4.9.1 Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM)
A determinação da concentração inibitória mínima foi realizada utilizando-se o Citral, fitoconstituínte selecionado na triagem microbiológica, frente oito cepas de
Cladosporium spp. e três cepas de C.carrionii.
Os ensaios foram realizados por meio da técnica de microdiluição em caldo, utilizando placas de 96 orifícios estéreis e com tampa (CLEELAND, SQUIRES, 1991; ELOFF, 1998; HADACEK, GREGER, 2000).
Em cada orifício da placa, foi adicionado 100 μL do meio líquido caldo RPMI- 1640-L-glutamina, sem bicarbonato de sódio. Em seguida, 100 μL da emulsão do
citral na concentração inicial de 2048 μg/mL foram dispensados nas cavidades da primeira linha da placa. E por meio de uma diluição seriada em razão de dois, foram obtidas as concentrações de 1024, 512, 256, 128, 64, 32, 16, 8 e 4 μg/mL, de modo que na primeira linha da placa encontrava-se a maior concentração e na última, a menor concentração. Por fim, foi adicionado 10 μL do inóculo de aproximadamente 1-5 x 106 UFC/mL das espécies fúngicas nas cavidades, onde cada coluna da placa correspondeu a uma cepa fúngica, especificamente. Paralelamente, foi realizado o mesmo ensaio com os antifúngicos anfotericina B, itraconazol e voriconazol nas mesmas concentrações.
Para verificar a ausência de interferência nos resultados pelos solventes, DMSO e Tween 80, utilizados na preparação da emulsão do fitoconstituínte, foi realizado um controle no qual foram colocados nas cavidades 100 μL do caldo RPMI-1640-L-glutamina, DMSO (0,5 %), Tween 80 (2 %) e 10 μL da suspensão fúngica. Um controle de microrganismo foi realizado colocando-se nas cavidades 100 μL do caldo RPMI-1640-L-glutamina, 100 μL de água destilada estéril e 10 μL do inóculo de cada espécie. Também foi realizado um controle de esterilidade do meio, no qual foi colocado 200 μL do caldo RPMI-1640-L-glutamina em um orifício, na ausência da suspensão dos fungos.
As placas foram assepticamente fechadas e incubadas a 28 oC por 5 dias (e confirmada em 7 dias), sem anaerobiose, para realização da leitura. As CIMs para o citral e os antifúngicos foram definidas como a menor concentração capaz de inibir visualmente o crescimento fúngico verificado nos orifícios quando comparado com o crescimento controle. Os ensaios foram realizados em duplicata e o resultado expresso pela média aritmética das CIM’s obtidas nos dois ensaios. (SANTOS, HAMDAN, 2005).
Com base nos resultados da CIM os produtos naturais podem ser classificados quanto ao seu potencial antimicrobiano, onde substâncias com CIM ≤ 500 μg/mL são consideradas com forte atividade antimicrobiana, com 500 μg/mL < CIM ≤ 1500 μg/mL possuem moderada atividade e CIM > 1500 μg/mL são consideradas com fraca atividade (SARTORATTO et al., 2004).
4.9.2 Determinação da Concentração Fungicida Mínima (CFM)
A concentração fungicida mínima do citral foi determinada para as 11 cepas em estudo, pelo método de microdiluição (DENNING et al., 1992; RASOOLI, ABYANEH, 2004). Após a leitura da CIM em 7 dias, alíquotas de 20 μL foram retiradas de cada cavidade da placa de microdiluição onde não houve crescimento fúngico e foram transferidas para placas de 96 cavidades previamente preparadas com 100 uL do caldo RPMI-1640. As placas foram seladas em condições assépticas e incubadas a 28 ºC por 5 dias. A CFM foi definida como a menor concentração do citral, em que não houve crescimento, visível quando subcultivadas em placas de 96 poços contendo caldo RPMI-1640 sem produtos antifúngicos. Paralelamente, foi realizado o mesmo ensaio com os antifúngicos anfotericina B e voriconazol. Os experimentos foram realizados em duplicata.
Por meio da razão entre CFM/CIM podemos descobir a natureza da ação de uma substância com atividade antifúngica, podendo esta ter um efeito fungistático ou fungicida. Caso a razão resulte num valor ≤ 4 o efeito é fungicida, no entanto se for > 4 a substância tem perfil fungistático (SIDDIQUI et al., 2013).
Sendo assim, após a determinação da CIM e CFM, foram selecionadas 4 cepas frente as quais o citral apresentou um efeito fungicida (C. carrionii URM 2871,
C. oxysporum URM 5234, C. sphaerospermum URM 6120 e C. cladosporioides
INCQS 40188) para dar continuidade ao estudo de atividade antifúngica desse monoterpeno.
4.9.3 Determinação da cinética de crescimento micelial
A inibição do crescimento micelial fúngico foi determinada utilizando-se a técnica de diluição em meio sólido. Este estudo baseou-se na medida do crescimento micelial radial em ASD adicionado do monoterpeno nas concentrações CIM, CIM x 2 e CIM x 4, em diferentes intervalos de tempo. Para a execução da técnica, inicialmente, uma porção de 2 mm de diâmetro foi tomado de uma cultura com crescimento de 7-14 dias em Ágar Sabouraud Dextrose, a 28 oC, e colocada no centro de uma placa de Petri estéril com meio ASD adicionado do citral, nas diferentes concentrações. O sistema foi incubado a temperatura ambiente. Em
diferentes intervalos de tempo (0, 2, 4, 6, 8, 10, 12 e 14 dias) após incubação, o crescimento micelial radial da colônia fúngica foi medido e o resultado expresso em milímetros (mm).
Os controles foram realizados por meio da medida do crescimento micelial em ASD na ausência do citral, ou adicionado com anfotericina B ou voriconazol (CIM, CIM x 2 e CIM x 4). Foram realizados dois experimentos independentes em diferentes ocasiões e os resultados representam a média ± erro padrão dos dois experimentos (ADAN et al., 1998; THYÁGARA, HOSONO, 1996; DAFERERA, ZIOGAS, POLISSION, 2003).
4.9.4 Interferência sobre a germinação de conídios
Para avaliar a interferência do citral, voriconazol e anfotericina B sobre a germinação de conídios, diferentes concentrações dos produtos teste correspondentes a CIM, CIM x 2 e CIM x 4 foram adicionados em ependorf estéreis contendo 500 µL de caldo RPMI-1640, em seguida foram homogeneamente misturadas com 500 µL da suspensão dos conídios fúngicos determinada em camara de Neubauer e ajustada a 106 conídios/mL. Foi utilizado um controle de microrganismos apenas com água destilada. As amostras foram incubadas a 28 oC e após 48 h o número de conídios germinados e não germinados foi determinado em camara de Neubauer e o percentual de inibição da germinação dos conídios foi calculado, comparando os resultados obtidos no experimento teste com os resultados do experimento controle. A análise foi realizada em microscópio óptico comum (Zeiss® model Primo Star). Cada análise foi realizada em duplicata e os resultados expressos como a média das duas repetições (SURENDER et al., 1987; RANA et al., 1997; SHARMA, TRIPARTHI, 2008).
4.10 Ensaios de atividade antifúngica in vitro com alvos específicos