Clonagem da ORF Ag85A no sistema Zero Blunt® TOPO®

O fragmento amplificado (item 5.1.1) correspondente à sequência codificadora do gene Ag85A de M. tuberculosis, foi clonado no vetor Zero Blunt® TOPO®_{, um vetor}

linear que possui a topoisomerase I do vírus Vaccinia ligada covalentemente à extremidade 3' fosfato de cada fita de DNA. A ligação entre a topoisomerase I e o DNA do vetor é capaz de catalisar a reação de ligação do inserto neste, liberando assim, enzima inativa. Desta forma, obteve-se o plasmídeo pTP:Ag85A. A geração deste “plasmídeo intermediário” foi necessária para que, num momento posterior, a digestão enzimática deste permitisse a liberação do inserto (Ag85A) com extremidades coesivas, de modo a permitir a clonagem da referida ORF, de forma direcionada e em fase de leitura correta, no vetor pValac.

98 O plasmídeo pTP:Ag85A foi então utilizado para transformar células de E. coli Top10 eletrocompetentes. A seleção de colônias de E. coli recombinantes foi realizada em meio LB ágar contendo canamicina. Aproximadamente 18 horas após a transformação, foi possível a visualização de colônias recombinantes. Nenhuma colônia foi visualizada nas placas do controle negativo, onde nenhum DNA foi adicionado às células durante o processo de transformação.

Dez colônias transformadas foram escolhidas de forma aleatória, inoculadas em meio líquido seletivo e incubadas à 37ºC por 18 horas sob agitação constante. Essas culturas foram individualmente estocadas em glicerol 80% (1:1) para posterior confirmação da presença do plasmídeo pTP:Ag85A.

A fim de se confirmar a clonagem, os DNAs plasmideanos extraídos foram utilizados como molde para uma reação de PCR, utilizando os iniciadores específicos para a ORF Ag85A de M. tuberculosis. Os referidos plasmídeos extraídos da linhagem

E. coli Top 10 também foram submetidos a uma reação de digestão enzimática com as

enzimas BamHI e EcoRI, o que resultou em dois fragmentos visíveis: um de aproximadamente 1.017 pb, correspondente à ORF Ag85A e outro de 3.470 pb, correspondente ao vetor Zero Blunt® TOPO®

Embora vários clones tenham sido confirmados como portadores da ORF de interesse (Ag85A) apenas um deles foi utilizado para dar continuidade aos experimentos (Figura 12).

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Figure 12: Amplificação por PCR da ORF Ag85A de M. tuberculosis e digestão enzimática a partir do DNA plasmideano extraído de células de E. coli transformadas com o plasmídeo pTP:Ag85A. . Eletroforese em gel de agarose a 1%

corado com brometo de etídio. A) Amplificação da ORF Ag85A. Canaleta 1: Marcador de peso molecular 1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen); Canaleta 2: Controle negativo da reação de PCR; Canaleta 3: Controle positivo da PCR utilizando-se o DNA genômico de

M. tuberculosis; Canaleta 4: Inserto Ag85A amplificado por PCR a partir do DNA

plasmideano do clone de E. coli top10. B) Digestão enzimática com as enzimas BamHI e

EcoRI. Canaleta 1: Marcador de peso molecular 1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen);

Canaleta 2: Produto da digestão enzimática, resultando nos fragmentos visíveis de 1.017pb e 3.470pb, correspondentes à ORF Ag85A e ao vetor Zero Blunt® TOPO®_, respectivamente.

5.1.3 Clonagem da ORF Ag85A no vetor pValac

O plasmídeo de expressão eucariótica pValac:gfp (Guimarães et al., 2009) foi extraído de E. coli e submetido a uma reação de digestão enzimática com as enzimas

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Figure 13: Análise do produto da extração plasmideana, digestão do pValac:gfp e purificação do vetor pValac. Eletroforese em gel de agarose a 1% corado com

brometo de etídio. A) Análise do produto da extração plasmideana e Digestão com

EcoRI: Canaleta 1: Marcador de peso molecular 1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen);

Canaleta 2: Produto linear pValac:gfp (4.446 pb) gerado a partir da digestão com a enzima EcoRI; Canaleta 3: Produto pValac:gfp (4.446 pb) gerado a partir da extração plasmideana de E. coli. B) Análise do produto de Digestão enzimática: Canaleta 1: Marcador de peso molecular 1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen); Canaleta 2: Produto da reação de digestão enzimática do pValac:gfp, utilizando-se as endonucleases EcoRI e BamHI, resultando em um fragmento de 3.719 pb (pValac) e 696 pb (gfp); Canaleta 3: Produto pValac:gfp (4.446 pb) gerado a partir da extração plasmideana de E. coli. C) Análise do produto pValac purificado: Canaleta 1: Marcador de peso molecular 1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen); Canaleta 2: Produto da purificação do pValac (3.719 pb) a partir do gel de agarose apresentado em B.

Simultaneamente, a ORF Ag85A, também com extremidades coesivas BamHI e

EcoRI, foi obtida a partir do plasmídeo pTP:Ag85A para posterior ligação ao vetor

pValac purificado.

Os produtos de ligação foram utilizados para transformar células eletrocompetentes de E. coli TG1. A seleção de colônias de E. coli transformadas com esses plasmídeos foi realizada em meio LB ágar contendo cloranfenicol. A visualização das colônias foi feita com aproximadamente 18 horas após a transformação. Assim, as colônias observadas foram inoculadas em meio líquido seletivo e incubadas a 37ºC por

101 aproximadamente 18 horas. Transcorrido esse período, apenas 1 colônia demonstrou crescimento. Esta colônia foi então estocada em glicerol 80% para posterior extração dos plasmídeos recombinantes. Nenhuma colônia foi visualizada nas placas do controle negativo, onde nenhum DNA foi adicionado às células durante o processo de eletroporação.

O DNA plasmideano extraído foi então utilizado como molde numa reação de PCR, usado os iniciadores específicos da ORF Ag85A de M. tuberculosis, para confirmar a presença do inserto no vetor pValac. Foi confirmado que o clone obtido era portador do inserto correspondente à ORF Ag85A (1.017 pb). A figura 14 mostra o produto de amplificação da ORF Ag85A. O controle negativo da reação, ao qual foi adicionado apenas água milli-Q estéril ao invés de DNA, não demonstrou nenhum sinal de amplificação. O DNA genômico de M. tuberculosis foi utilizado para o controle positivo da reação.

Concomitantemente, o vetor pValac:Ag85A foi submetido a uma reação de digestão com as enzimas BamHI e EcoRI, o que resultou em dois fragmentos visíveis: 1.017 pb e 3.719 pb, correspondentes a ORF Ag85A e ao vetor pValac, respectivamente (Figura 14).

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Figure 14: Análise do produto de amplificação por PCR da ORF Ag85A de M.

tuberculosis e confirmação da presença da ORF Ag85A no vetor pValac por digestão

enzimática. Eletroforese em gel de agarose a 1% corado com brometo de etídio. A)

Confirmação da presença da ORF Ag85A no vetor pValac por PCR do clone pValac:Ag85A; Canaleta 1: Marcador de peso molecular 1Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen); Canaletas 2 e 3: Controles Negativos da reação de PCR, Canaleta 4: Controle positivo utilizando o DNA genômico de M. tuberculosis H37Rv; Canaleta 5: Inserto Ag85A amplificado por PCR a partir do DNA plasmideano do clone de E. coli TG1. B) Digestão enzimática com as enzimas BamHI e EcoRI. B) Canaleta 1: Marcador de peso molecular 1kb Plus DNA Ladder (Invitrogen); Canaleta 2: Digestão enzimática evidenciando a ORF Ag85A com aproximadamente 1.017pb. Canaleta 3: Plasmídeo pValac:Ag85A sem digerir.