Verificação da Produção, por Células Mamíferas da Linhagem CHO, da Proteína

5.2.2.1 Reação de Imunofluorescência para análises de Microscopia Confocal

Para verificação da expressão da proteína Ag85A por células mamíferas da linhagem CHO, umas das técnicas utilizadas neste trabalho foi a Microscopia Confocal. Após 48 horas de transfecção com o plasmídeo vacinal pValac:Ag85A, nas células eucarióticas incubadas com anticorpo primário (MAb-DT17) e posteriormente com anticorpo secundário, anti-IgG, marcado com o fluoróforo Alexa 488, (Alexa Fluor® 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Invitrogen) foi possível a visualização da expressão da proteína Ag85A. Através da sobreposição das imagens (Figura 17 D e E) gerando a

106 figura 17 F, pôde-se visualizar a marcação da proteína Ag85A com o fluoróforo Alexa Flúor 488, em verde, e o núcleo celular, em azul, marcado com DAPI. Como controles negativos do experimento, foram utilizadas i) células CHO não transfectadas marcadas com ambos os anticorpos, no intuito de evidenciar que as células eucarióticas estudadas não apresentavam nenhuma proteína que reagisse com o anticorpo primário utilizado (figura 17 A) e ii) células CHO transfectadas, marcadas apenas com o anticorpo secundário (anti-IgG, marcado com o fluoróforo Alexa 488), no intuito de constatar ausência de ligação inespecífica por parte deste anticorpo. Nenhuma fluorescência foi visualizada no comprimento de onda da cor verde, resultando na imagem sobreposta onde apenas o núcleo de todas as células está marcado em azul (Figura 17 B). O controle positivo do ensaio consistiu de células eucarióticas transfectadas com plasmídeo pValac:gfp (Figura 17 C).

Deste modo pode-se confirmar a expressão da proteína Ag85A em células transfectadas e, consequentemente, a funcionalidade do plasmídeo em estudo, pValac:Ag85A.

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Figure 17: Imunocitoquímica utilizando-se microscopia confocal para confirmar a produção da proteína Ag85A em células da linhagem CHO. A)

Células CHO não transfectadas incubadas com anticorpo primário anti-Ag85A, anticorpo secundário anti-IgG marcado com Alexa Flúor 488 e DAPI, sendo, este último, para a marcação do núcleo. B) Células CHO transfectadas com pValac:Ag85A incubadas somente com anticorpo secundário (A e B representam os controles negativos do experimento). C) Células transfectadas com pValac:gfp (Controle positivo). D) Células CHO transfectadas com pValac:Ag85A e incubadas com anticorpo primário anti-Ag85A, anticorpo secundário Alexa Flúor 488 e DAPI (imagem capturada apenas DAPI). E) Células CHO transfectadas com pValac:Ag85A e incubadas com anticorpo primário anti-Ag85A, anticorpo secundário Alexa Flúor 488 e DAPI (imagem capturada apenas Alexa 488). F) Sobreposição das imagens D e E (visualização da marcação da proteína Ag85A no citoplasma das células transfectadas com Alexa Flúor 488 e do núcleo com DAPI). As imagens A, B e C foram obtidas em objetiva de 40X e as imagens D, E e F em objetiva de 63X, utilizando Microscópio de Varredura a Laser Confocal, modelo LSM 510 Meta Zeiss.

5.2.2.2 Reação de Imunofluorescência para análises em Citômetro de Fluxo

Neste trabalho, a Citometria de Fluxo foi outra técnica utilizada a fim de constatar a expressão da proteína de interesse pelas células eucarióticas. O procedimento de transfecção foi realizado com o reagente comercial Lipofectamine 2000 TM (Invitrogen) e, decorridas 48 horas deste processo, realizou-se a técnica de imunofluorescência. As análises citométricas foram conduzidas em citômetro de fluxo FACScan (BD Biosience), sendo os resultados obtidos, analisados através do

108 programa FlowJo 7.6.4 (TreeStar Inc.). Os gráficos de dispersão de pontos, conhecidos como dot plots (Figuras 18 e 19 A e B) ilustram a porcentagem dos eventos adquiridos que foram selecionados para as análises, com base nos parâmetros tamanho e granulosidade das células (FSC e SSC, respectivamente). Como controle positivo do experimento, para verificar se a transfecção celular foi eficiente, células CHO foram transfectadas com o plasmídeo pValac:gfp; como controle negativo foram utilizadas células CHO não transfectadas.

Como pode ser observado na figura 18, observa-se o resultado expresso em dot

plot [SSC (granulosidade)/FL1 (fluorescência específica)], das células CHO não

transfectadas que apresentaram uma parcela de eventos fluorescentes de apenas 2,59% (Figura 18A), enquanto a percentagem de células sem expressão representou 97,41%, o qual é esperado para células não transfectadas. A continuação foi verificada a eficiência de transfecção das células CHO com o plasmídeo pValac:gfp e a subsequente expressão do GFP pelas mesmas. Como mostra o dot plot representado na figura 18B, a expressão do GFP pelas células CHO foi de 95,54%, com uma intensidade mediana de fluorescência de 96,93, o que significa que a transfecção celulas com o plasmídeo pValac:gfp foi muito eficiente e que maioria das células CHO expressaram quantidade alta da referida proteína. A combinação dos resultados obtidos entre as células CHO não transfectadas e as células CHO transfectadas com o plasmídeo pValac:gfp é apresentado na Figura 18C em um histograma (Count (quantidade de eventos lidos)/FL1 (fluorescência específica)). Observa-se deslocamento à direita da curva representante das células expressando a proteína GFP, o que demonstra uma diferença de 93,67%, correspondente às células eficientemente transfectadas com o plasmídeo pValac:gfp que estão produzindo a referida proteína.

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Figure 18: Detecção da produção da proteína verde fluorescente (GFP) por citometria de fluxo (FACScan). Dot plot gerado pelo programa FlowJo. A) Células CHO não transfectadas; B) Células CHO expressando o GFP após transfecção com o plasmídeo pValac:gfp; C)

Histograma gerado pelo programa FlowJo. Histograma contendo a combinação de resultados obtidos entre as células CHO não transfectadas e transfectadas com o plasmídeo pValac:gfp.

Para as análises da proteína recombinante Ag85A expressa nas células CHO se observa que as células não transfectadas submetidas ao mesmo processo de marcação que as células transfectadas, revelaram que 99,11% das mesmas não apresentaram fluorescência alguma (Figura 19 A), o que permite traçar o ponto de corte entre a não expressão da proteína Ag85A e a expressão detectável da mesma (controle negativo do ensaio). No entanto, ao analisar as células transfectadas com o

110 vetor pValac:Ag85A, submetidas ao processo de marcação imunocitoquímica, pode-se observar que 33,68% das células eucarióticas foram capazes de expressar a referida proteína (Figura 19 B).

Os resultados obtidos apresentam-se também combinados na figura 19 C, expressos em um histograma, [cont. (quantidade de eventos)/FL1 – espectro de emissão do Alexa 488)]. Estes experimentos revelam a expressão da proteína Ag85A pelas células CHO transfectadas com o plasmídeo pValac:Ag85A, que condiz com o ensaio de Microscopia Confocal, revelado no item 6.2.2.1.

Foi também avaliada a intensidade média de fluorescência (MFI) das células submetidas às análises no citômetro de fluxo. A MFI é um parâmetro que permite relacionar a quantidade de moléculas em estudo, expressas em cada célula analisada no citómetro de fluxo. Nas análises realizadas, a MFI para células não transfectadas foi de 3,52, enquanto que a MFI para células transfectadas com o plasmídeo pValac:Ag85A foi igual a 16,00; assim, a intensidade de fluorescência das células transfectadas com pValac:Ag85A foi 3 vezes maior que a MFI das células não transfectadas (NT). A análise deste parâmetro revelou que as células transfectadas com o plasmídeo pValac:Ag85A foram capazes de expressar a proteína recombinante Ag85A em quantidades detectáveis.

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Figure 19: Verificação da produção da proteína Ag85A em células CHO por citometria de fluxo (FACScan). A) Dot Plot evidenciando células não transfectadas marcadas com anticorpo

primário e secundário;B) Dot Plot de células transfectadas com pValac:Ag85A marcadas com anticorpo primário e secundário. Nos gráficos dispõe-se no eixo Y a contagem celular e no eixo X o detetor FL1 (laser de argônio, 488nm). Imagens obtidas utilizando-se programa FlowJo. C) Histograma que mostra a expressão da proteína Ag85A revelada pela marcação com anticorpo monoclonal primário (MAb) anti Ag85A, e anticorpo secundário, anti IgG de camundongo marcado com Alexa 488.