O soro é a amostra recomendada para este procedimento. Amostras de soro que apresentam hemólise ou lipemia macroscópicas poderão produzir um aumento da coloração de fundo do substrato.
Proceda à colheita do sangue usando as precauções de rotina relativas às punções venosas para análises clínicas. Na colheita e tratamento das amostras dos doentes, manuseie-as como materiais potencialmente infecciosos, de acordo com as precauções universais e as boas práticas clínicas e laboratoriais, independentemente da sua origem, tratamento ou certificação prévia.
Armazene as amostras de soro durante um período máximo de 3 dias a +2-8 °C se estiverem protegidas contra a evaporação e a contaminação. Para armazenamento mais prolongado ou para transporte, congele as amostras a uma temperatura inferior ou igual a -20 °C. Os ciclos repetidos de congelamento e descongelamento poderão provocar deterioração da amostra de teste.
ATENÇÃO: Considere as amostras e todos os materiais em contacto com elas como potencialmente
infecciosos, e proceda à sua eliminação de forma adequada. Utilize um desinfectante adequado para descontaminação. Não pipete com a boca. Evite a produção de aerossóis.
PROCEDIMENTO
Materiais fornecidos
1. R1: Lâminas de substrato HEp-2 2. C1: Controlo Positivo
3. C0: Controlo Negativo 4. R2: Conjugado FITC 5. R3: Meio de montagem 6. R4: PBS
7. R5: Contra-corante Azul de Evans 8. Tiras absorventes
Materiais Necessários Mas Não Fornecidos
1. Micropipeta de 25–50 μL calibrada ou regulável e/ou pipetas de Pasteur de 12,7 cm (5 pol.) 2. Tubos de ensaio em polipropileno: minitubos de 1 mL ou de 12 x 75 mm ou 13 x 100 mm 3. Suporte para tubos de ensaio
4. Câmara húmida
5. Placa de coloração ou frasco de Coplin para lavagem das lâminas 6. Agitador magnético (opcional)
7. Frasco de lavagem
8. Lamelas de vidro, para cobertura das lâminas, de 24 x 60 mm (para lâminas de 6 e 12 poços) ou de 26 x 72 mm (para lâminas de 24 poços)
9. Água destilada ou desionizada (DIH2O)
H303: Pode ser nocivo por ingestão.
H313: Pode ser nocivo em contacto com a pele.
P312: Caso sinta indisposição, contacte um CENTRO DE INFORMAÇÃO
10. Microscópio de fluorescência. Para obter resultados ideais com o isotiocianato de fluoresceína, utilize uma luz primária ou luz de excitação de 480-490 nm para iluminar a amostra. Observe a amostra utilizando filtros que permitam a passagem de luz com comprimentos de onda de 510 nm e superiores.
Comentários ao procedimento
1. Na execução do teste, inclua um controlo positivo e um controlo negativo numa lâmina de cada número de lote.
2. Não dilua o controlo negativo, este é fornecido na concentração de trabalho.
3. Como controlo da sensibilidade, o controlo positivo é optimizado para produzir uma fluorescência de +1 numa diluição em duplicado (+ ou -) do título indicado no Relatório de CQ anexo. Este título é utilizado para monitorizar a sensibilidade do ensaio e ajudar na classificação dos títulos do doente. O controlo positivo pode também ser utilizado não diluído como controlo padrão.
4. Quando usar lâminas no procedimento descrito em seguida, não deixe que o substrato seque (consulte a secção referente às limitações do procedimento).
5. Para evitar danificar o substrato, não toque com a ponta da pipeta no poço durante a aplicação da amostra.
6. EXCLUSIVAMENTE para Lâminas de HEp-2 de 24 poços: Processe as lâminas individualmente ou
processe um máximo de 4 lâminas numa câmara húmida. 7. Manipule as lâminas pelas extremidades. Evite tocar nos poços. 8. Utilize apenas um lápis para marcar as lâminas.
9. A área de trabalho deverá estar livre de folhas e de correntes de ar directas.
10. Mantenha os utensílios de vidro e os frascos de plástico limpos, lavando regularmente com uma solução detergente suave e enxaguando bem com água desionizada.
Procedimento
1. Retire o número de lâminas adequado do frigorífico. Deixe atingir a temperatura ambiente nos sacos de folha de alumínio (20 minutos). Estabilize todos os reagentes à temperatura ambiente.
2. Reconstitua o PBS com 1 litro de água desionizada. Os recipientes destinados ao PBS deverão estar limpos e isentos de contaminação. Não reutilize os recipientes do PBS sem os limpar com uma solução de detergente suave, para evitar o crescimento microbiano.
3. Prepare as diluições de rastreio dos soros de teste. Utilize o PBS ou o diluente para amostras do doente para fazer as diluições. Homogeneíze por inversão. Cada laboratório deverá estabelecer uma diluição de rastreio com base num “intervalo normal baseado na idade”. Consulte os Boletins Técnicos “Hipersensibilidade em Testes de ANA” e “Estudo do Intervalo do Normal para ANA”.
4. Utilize o controlo positivo como um instrumento de monitorização da sensibilidade do ensaio e da identificação de padrões. Prepare diluições duplas em série do Controlo Positivo com o mesmo diluente utilizado para os soros de teste. Inicie com uma diluição 1:2 e prossiga com pelo menos uma diluição para além do parâmetro de avaliação final referido no Relatório de QC para o Controlo. 5. Retire a lâmina do saco de folha de alumínio e coloque-a na câmara húmida. Adicione imediatamente
25-35 μL de controlos ou de soros de teste diluídos aos poços adequados. Certifique-se de que cada poço está completamente revestido com a amostra. Repita este passo para todas as lâminas. 6. Cubra a câmara húmida/suporte para lâminas. Incube as lâminas de substrato à temperatura
ambiente durante 20 minutos. ATENÇÃO: evite movimentar a câmara de incubação.
7. EXCLUSIVAMENTE para Lâminas de HEp-2 de 24 poços: Utilize as tiras absorventes para retirar
os soros dos poços de lâminas. Coloque suavemente a tira absorvente sobre cada lâmina para absorver a amostra (3-5 segundos). Não toque com a tira absorvente no substrato.
8. Enxagúe, apenas durante alguns instantes, todas as lâminas com um jacto de PBS. Aplique o jacto por cima dos poços, de forma a que o PBS lave cada poço, mas não aplique o jacto directamente nos poços.
9. Lave as lâminas durante um período total de 10 minutos numa placa de coloração cheia de PBS. Agite suavemente a placa de coloração várias vezes ou utilize um agitador magnético durante a lavagem.
Exemplo Diluição de Rastreio Sugerida
10. Retire todas as lâminas ou suportes para lâminas da placa de coloração e absorva o excesso de PBS em redor dos poços utilizando tiras absorventes. Não toque com a tira no substrato.
11. Coloque a(s) lâmina(s) na câmara húmida e dispense imediatamente cerca de 25 μL de Conjugado FITC do frasco conta-gotas em cada poço. Repita este passo para todas as lâminas.
12. Cubra a câmara húmida/suporte para lâminas. Incube durante 20 minutos à temperatura ambiente. 13. Enxagúe, apenas durante alguns instantes, todas as lâminas com um jacto de PBS, conforme
descrito no passo 8 mais acima.
14. Lave as lâminas durante um período total de 10 minutos numa placa de coloração cheia de PBS. Ou efectue um procedimento de contra-coloração OPCIONAL: Acrescente Contra-corante Azul de Evans ao PBS a uma placa de coloração (2-3 gotas de Azul de Evans/150 mL PBS) e lave as lâminas durante um total de 10 minutos.
15. Retire cada lâmina ou suporte para lâmina do PBS e escoe durante alguns instantes num toalhete de papel. Se estiver a usar o Suporte para Lâmina, retire as lâminas para montagem. Aplique 4 ± 1 gotas de meio de montagem por lâmina, certificando-se de que cobre todos os poços. Adicione a tampa deslizante.
16. Veja as lâminas com um microscópio de fluorescência numa sala escura. Avalie bem todos os poços de substrato, relativamente à presença ou ausência de auto-anticorpos. O meio de montagem é semi-permanente, pelo que as reacções de fluorescência podem ser reavaliadas durante 1 a 2 semanas, desde que as lâminas sejam armazenadas no escuro a +2-8 °C. A ampliação de rastreio para o substrato HEp-2 deverá ser determinada em cada laboratório, com base na fonte luminosa e na óptica do microscópio (recomenda-se 200X). Para a interpretação do padrão, utilize uma lente seca e uma ampliação total de ~400X-600X.
17. Determine e registe o padrão de coloração e classifique a intensidade, utilizando os seguintes critérios:
• +4 Fluorescência verde brilhante • +3 Fluorescência verde clara
• +2 Fluorescência positiva, claramente distinguível
• +1 A fluorescência específica mais baixa que permite que a coloração seja inequivocamente diferenciada da fluorescência de fundo