As células HEp-2 existentes nos poços consistem numa mistura de células em repouso (interfase) (não mitóticas) e em várias fases da mitose. A mitose é um processo de divisão celular constituído por quatro fases: 1) prófase, 2) metáfase, 3) anáfase e 4) telófase. Durante a mitose, a membrana nuclear dissolve- se e os cromossomas são facilmente visíveis numa disposição característica para cada fase. Para cada amostra, avalie as reacções celulares mitótica e em repouso (interfase). As células mitóticas deverão ser vistas durante a metáfase.
I. O teste para auto-anticorpos é negativo caso não se observe nenhum padrão de fluorescência específico no substrato ou caso a fluorescência seja inferior a 1+.
II. O teste para ANA é positivo quando o substrato HEp-2 exibe um padrão de fluorescência específico e quando a intensidade da fluorescência é ≥ 1+.
PADRÕES DE ANA:
A. HOMOGÉNEO (DIFUSO). O núcleo apresenta uma coloração uniforme. Dentro das células em mitose, os cromossomas apresentando coloração intensa, como uma massa de forma irregular. Esta combinação de padrão é sugestiva de auto-anticorpos contra nADN, histonas ou DNP. B. MARGINAL (PERIFÉRICO). O núcleo apresenta coloração predominante na periferia. Dentro das
células em mitose, os cromossomas podem corar como uma massa de forma irregular, com maior intensidade nas margens exteriores. Esta combinação de padrão é sugestiva de auto- anticorpos contra nADN ou complexos ADN-histonas. Se os cromossomas das células em mitose forem negativos, o padrão nuclear marginal poderá ser sugestivo de auto-anticorpos contra a membrana nuclear (14).
C. MOSQUEADO. Os padrões mosqueados 1) e 2) são sugestivos de auto-anticorpos contra Sm, RNP, Scl-70, SSA, SSB ou outros antigénios indefinidos.
1. MOSQUEADO FINO. Inúmeros pequenos pontos uniformes de fluorescência espalhados ao longo do núcleo, com margens nucleares distintas. No mosqueado fino, poderão existir alguns pontos agrupados dispersos (observados frequentemente em DTCM). O citoplasma das células em mitose poderá reter um mosqueado fino, enquanto que os cromossomas das células em mitose são negativos.
2. MOSQUEADO GROSSEIRO OU ATÍPICO. Pontos uniformes de fluorescência de tamanho médio, dispersos ao longo do núcleo, com margens nucleares distintas. Os cromossomas das células em mitose são negativos. Raramente, podem também estar presentes pontos maiores, que dão o aspecto de um padrão nucleolar positivo, exceptuando o facto de serem muito numerosos e de tamanho variável. OBSERVAÇÃO: O anti-Scl-70 constitui uma excepção à descrição do padrão efectuada acima, na medida em que as regiões dos cromossomas em mitose são positivas. O antigénio está associado ao cromossoma e pode ser observado com coloração nucleolar.
3. MOSQUEADO DISCRETO (ESPECIFICIDADE PARA CENTRÓMERO). Pontos uniformes de fluorescência de tamanho médio, dispersos ao longo do núcleo, com margens nucleares indistintas. Nas células em mitose, os pontos discretos só estão agrupados na massa do cromossoma. Durante o estadio de prófase da mitose, o agrupamento dos pontos pode ter um aspecto de nuvem por cima de toda a massa cromossómica. Durante a metáfase e anáfase, o mosqueado localiza-se nas regiões do cromossoma e pode apresentar formas em barra mais definidas. O padrão mosqueado discreto é específico para o centrómero e apresenta uma elevada correlação com a síndroma CREST, uma variante da esclerose sistémica progressiva (15).
D. NUCLEOLAR. Coloração homogénea intensa dos nucléolos, frequentemente associada à fluorescência homogénea e esbatida do resto do núcleo. Os cromossomas das células em mitose são habitualmente negativos; todavia, alguns anticorpos nucleolares poderão reagir com os cromossomas. As células em mitose não apresentam nucléolos distintos. O padrão é sugestivo de auto-anticorpos contra ARN 4-6S.
E. FUSO. Nas células em mitose, só existe fluorescência do fuso. O fuso consiste numa rede de linhas provenientes dos centrossomas, que os ligam entre si. O padrão é sugestivo de auto- anticorpos contra antigénios associados aos microtúbulos (significado desconhecido).
III. Podem observar-se reacções de coloração citoplasmática, que são sugestivas de auto-anticorpos mitocondriais (AMA), contra o músculo liso (ASMA) ou outros. Estas reactividades deverão ser
confirmadas e tituladas em substratos tais como estômago/rim de ratinho, caso se pretenda participar os resultados.
A. MITOCONDRIAL. O aspecto é sugestivo de um teste positivo para AMA quando surgem inúmeros pontos citoplasmáticos numa rede fibrosa, predominantemente no citoplasma de células em repouso (interfase) e em mitose. Pode estar presente um número limitado de grânulos fluorescentes através da superfície do núcleo.
B. MÚSCULO LISO. O aspecto é sugestivo de um teste positivo para ASMA quando se observa um de dois padrões de coloração:
1. Os anticorpos IgG ou IgM que reagem com a actina, a miosina ou a tubulina apresentam um aspecto fluorescente diáfano, parecido com algodão, no citoplasma. A actina e a miosina são componentes proteicos dos microfilamentos; a tubulina é um componente proteico dos microtúbulos (16,17).
2. Surge uma rede de fluorescência araneiforme ao longo do citoplasma celular, com fibrilas que se estendem desde a membrana celular. As células em mitose apresentam grandes pontos de fluorescência no citoplasma, enquanto que a massa cromossómica é negativa. Este tipo de coloração é sugestivo de auto-anticorpos IgG ou IgM com especificidade para a vimentina ou a queratina, que são componentes proteicos dos filamentos intermediários do citoplasma (16,17).
IV. Se a amostra for positiva para auto-anticorpos com a diluição de rastreio, determine o título procedendo à diluição em série da amostra e voltando a executar o teste com estas diluições. O título de auto-anticorpos consiste na diluição mais elevada que demonstra fluorescência específica de +1 do substrato, com a ampliação especificada no passo 17 do procedimento.
V. Caso utilize o Contra-corante Azul de Evans, as células irão ter um aspecto vermelho-alaranjado e deverão ser observadas relativamente à presença ou ausência de fluorescência verde clara específica.