KALLESTAD HEp-2 Cell Line Substrate

(1)

KALLESTAD™

HEp-2 Cell Line Substrate

An indirect fluorescent antibody procedure for the detection and semi-quantitation of human

nuclear autoantibodies.

(2)

(3)

Lexicon/Lexique/Glosario/Glossar/Definizione dei simboli/Léxico/Leksikon/Ordlista . . . 4 English . . . 7 Français . . . 17 Español . . . 29 Deutsch . . . 41 Italiano . . . 53 Português . . . 65 Dansk . . . 77 Svenska . . . 89 References/Bibliographie/Referencias/Literatur/Bibliografia/Bibliografia/Referencer/Referenser . . . 101

(4)

English F ranç ais E spa ñ ol Deut sc h It a lia no Port uguê s D an sk Sven sk a Eur o pean Co nf or mity Co nf or mité a u x nor m es eur o p é e nne s Co nfor mi dad eu ro pe a CE -K on fo rmit ät s-k e nnze ich nu ng Conf or mità eu ro pea Confor midade c o m as no rm as eu ro peia s Eur o pæ isk ov er en s s te mme lse Eu ro peisk öv er en sst ämme lse U s e by U tiliser avant le Fecha de cadu c idad Verw endbar bis U tilizzare entro il Utilizar até H oldbar til A nv änd före For In Vitr o D iag no st ic U s e D ispos itif médical de diagn o stic in vi tr o Pa ra u s o diagnóstico in vitro In-vitro- Dia g no stik um

Per uso diagno

stico

in

vitro

Para utilização no diagnós

tico in vitro Me dicin s k u d s ty r til in vitr o-dia g n o stik Fö r in vitr o -diag no st iskt bru k B a tc h co d e C o d e d u lot C ód ig o de lo te Charge nbeze ich nung Codice del lotto C ódigo do lote Lotnummer B atchnummer Manufacturer Fabricant F abrica nte H ersteller F abbricante Fa bri c ante Producent T illv erkare C a talog Num b er N u méro de ré fé re nc e Número de cat álo g o Artikel-Nummer N umero di ca ta log o Número de Catálogo Katalognummer A rtikelnummer Co nsult In st ru ct io ns fo r Us e Co nsult e r le s instructions d’utilisation Co nsult e las in strucc ione s de uso Ge bra u c h sanwei sung be ac ht en Consult a re le

istruzioni per l’uso

Consult e a s in st ru çõ es de utilização Se br ug sa nvisning Se bruk san v isnin g e n Te mp er at ur e Limita ti on Limites de tempér at ur e Límites de temp er at ur a Zuläs s iger Te mp era tu rb e re ich Limit i d i te mper at ur a Limit e de te mper at ur a Te mper at ur -begrænsning Te mper at ur -begrä n sning Do N o t R e u s e Ne pas réutilis er No volver a utilizar Nicht wie d er v e rw end e n Non riutilizzare Não Reutilizar Må ik ke ge na nven des Få r ej åt er an vän d as N u mb e r o f Te sts N omb re d e te st s N úme ro d e pr ue b a s Anza hl d e r T e sts N u m e ro d i an a lisi N ú m e ro d e te ste s An ta l te st s A nt al te ste r Authorized Re pr es e n ta ti ve i n th e Eu ro pean Co mmunit y Re pr és e n ta nt agr é é da ns la Co mmu n a u té Eur o péen ne Re pr es en ta nt e au to riza do e n la Co munid a d Eu ro p e a Bevollmächtigter in de r Eu ro p ä is ch en Union Mandatario au to rizza to p e r l’U n ione Europea Re pres en ta nt e au to riza do na Comunidade Eur o p e ia Repr æsen tant i det Eur o pæ iske Fælless kab Auk to ris er ad re pres en ta nt i Eu ro peiska ge men s k a p e n Su bst rat e Slide s L a mes de Substrat Po rt ao bjet os de su st ra to Substrat- be sch ich te te O b je kt tr äg er Vetrini di substra to Lâ mina s de Substrato Subst ratslide O bjektg las med ce ller/vä vnad Po sit ive Co nt ro l C on tr ô le Po sit if C on tr o l p o s itivo Posit ivk on tr olle Co n tr o llo p o s itiv o Co n tr o lo Po sitiv o Po sit iv k o n tr o l P os itiv ko nt roll Ne ga tive Con tr o l C o n trôle Né ga tif C o n tr ol n e ga ti vo Ne ga tivko n tr o lle Cont ro llo ne ga tivo Controlo Negativ o Ne ga ti v ko nt ro l N eg at iv k o n tr o ll

(5)

F IT C C o n jug a te C on ju gu é à la flu o re s c é ine Co njug ad o FITC F ITC-Kon juga t C oniu ga to F ITC Co n jug ad o F ITC F IT C k o n jug a t FI TC-k on ju ga t Mounting Media M ili eu de Mo nt ag e Medio de montaje Ein d ec kmit te l S o luzio ne di mon ta ggio Meio d e Montagem Monteringsm e dium Monteringsmed ium Phos ph at e B u ff er ed Sa line Tamp on Phos ph at e Sa lin

Solución salina amo

rt igu ada co n fos fat o Ph osph at ge puf fe rt e Kochs a lzlösung Soluzione fisio logic a ta mpon at a c o n fosf ato (PBS)

Solução Salina com Tampão Fo

sf a to Fo sf at bu ff e r sa lt va nds o pl øs ni n g Fo sf at bu ff ra d sa ltlösni n g Eva n s’ B lue C o u n ter st ain Co nt re -co lor an t a u bleu d’Eva n s Contratinción de azu l de Eva n s Ev an s’ Blau Fä rb emit te l Colorante di co nt ra st o Eva n s Blue Contra-corante Azu l de Ev an s Evan ’s Blue ko nt ra fa rvn ing Evans b lå färglös n ing QC Re por t Positive Control Rappo rt CQ Co nt rôle Positif Inf o rme de l

control de calidad Control pos

itivo QK-Be ric ht Posit ivk on tr olle n Rap p or to sul

controllo di qualità Controllo pos

itiv o Rela tó rio d e CQ Controlo Positiv o QC rappor t Positiv k o ntrol Rap p o rt fö r k v a lit et sk on tr oll Pos itiv ko nt ro ll Sample D iluent D iluant éc ha ntil lon Diluy e nte para muestras Pr ob en ve rd ün-nu ng smit te l Diluente per ca mpion e Diluente de am os tr as Prø v e for tynde r Pr ovdilu ent Co nt ain s Co nt ien t Co nt iene E n th äl t C ont ien e C ont é m Inde h o lder Inn eh ålle r W A RNING A TTEN T ION A TENCI ÓN ACHTUNG AT TENZIONE ATENÇÃO A DVARSEL V ARNING English F ranç ais E spa ñ ol Deut sc h It a lia no Port uguê s D an sk Sven sk a

(6)

(7)

SUMMARY AND EXPLANATION

The detection and semi-quantitation of autoantibodies aid in the diagnosis of autoimmune diseases (1). The Kallestad HEp-2 Test detects autoantibodies to nuclear (ANA) antigens.

Laboratories have used indirect fluorescent antibody (IFA) procedures to detect autoantibodies since 1957. In these procedures, a fluorescent antibody serves as a marker for an antigen-antibody binding reaction which occurs on a substrate surface. Among the substrates frequently used in the IFA procedure are human epithelial (HEp-2) cells. Other common substrates, such as mouse kidney and stomach, and Crithidia luciliae (a hemoflagellate), are also available from Bio-Rad Laboratories. Observation of a specific pattern of fluorescence on the substrate indicates the presence of autoantibodies in the patient’s serum.

A positive ANA result usually occurs in patients with autoimmune disorders such as systemic lupus erythematosus (SLE), mixed connective tissue disease (MCTD), rheumatoid arthritis (RA), Sjögren’s syndrome (SS), and progressive systemic sclerosis (PSS) (2). However, the incidence of low-titer ANA positives increases with age in normal individuals (3). Therefore, the presence of low-titer antibody should be interpreted in the context of other clinical information.

PRINCIPLES OF THE PROCEDURE

Autoantibodies in a test sample bind to antigens in the substrate. Washing removes excess serum from the substrate. Fluorescein conjugated (FITC) antiserum added to the substrate attaches to the bound autoantibody. After a second washing step to remove excess conjugate, the substrate is coverslipped and viewed for fluorescent patterns with a fluorescent microscope. Observation of a specific fluorescent pattern(s) on the substrate indicates the presence of autoantibodies in the test sample.

PRODUCT INFORMATION

Once open, all reagents are stable through the expiration date indicated on the label, when stored at the indicated temperatures and free of visible signs of contamination. If improper storage or handling of the kit during transit is suspected, run the test using only positive and negative controls, and observe for expected results. The kit should be stored at +2–8°C (some components can be stored at room temperature, see below).

The following reagents can be used interchangeably with the Crithidia, MSK and HEp-2 substrates: • FITC Conjugate - PN 30446, 2.5 mL and 30480, 100 mL

• Mounting Media - PN 30403

• Phosphate Buffered Saline - PN 31098 • Evans Blue Counterstain - PN 30431

(9)

Kit Catalog Number Item Description

30471 Kallestad™ HEp-2 Kit, 12-well, 60 tests

30472 Kallestad™ HEp-2 Kit, 12-well, 240 tests

32583 Kallestad™ HEp-2 Kit, 6-well, 48 tests Reagent Qty Qty Qty

Comp.

PN Component Preparation

R1

5 20 HEp-2 Substrate Slides, 12-well Store at

+2-8°C. Bring to room temperature prior to use. Use

as supplied. 8 HEp-2 Substrate Slides, 6-well

• HEp-2 substrate fixed onto glass slides • Handle slides by the edges.

• Do not apply pressure to surface of foil bag.

R2

1 4 1 30446 FITC Conjugate, 2.5 mL

• Fluorescein conjugated antiserum to human Immuno-globulin

• 1% bovine serum albumin

• Phosphate buffered saline solution (pH ~ 7) • 0.1% sodium azide preservative

Use as supplied. Store

at +2-8°C.

R3

1 2 1 30403 Mounting Media, 2.5 mL

• A semi-permanent buffered mounting media in a Trizma buffered solution, pH 7-8

• ≤ 7.5% Polyvinyl alcohol • ≤ 20% 1,2-Propanediol Use as supplied. Store at +2-26°C. R4

2 4 2 31098 Phosphate Buffered Saline (PBS),

pH 7.3 ± 0.10, 11.34g/vial • Dibasic sodium phosphate • Monobasic sodium phosphate • Sodium chloride

• Stable in crystalline form for 24 months at +2-8°C or at room temperature (RT = 18-26°C)

Dissolve contents of 1 vial in distilled water for a final volume of 1 liter. Stable for 3 months at RT. R5

1 1 1 30431 Evans’ Blue Counterstain, 2.5 mL

• ≤ 2% Evans’ blue stain

• 0.1% sodium azide preservative

at +2-26°C.

C0

1 2 1 Kallestad™ Negative Control, 0.5 mL

• Pooled normal human serum • 1% bovine serum albumin • 0.1% sodium azide preservative

at +2-8°C.

C1

1 1 1 Kallestad™ Homogeneous Positive Control, 0.5 mL

• Pooled human serum with a specific autoantibody activity

• 1% bovine serum albumin • 0.1% sodium azide preservative

Dilute as directed, refer

to QC Report for titer. Store at

+2-8°C.

NA 5 20

8

25090 25089

Slide Blotter, 12-well Slide Blotter, 6-well

Use as supplied. NA 1 1 1 Mini-CD, Instructions For Use, Kallestad™ IFA

Products

Use as supplied. A sign of possible deterioration in any of the reagents is a change in expected reactivity or pattern, sediment in the vial or a cloudy appearance, which indicates bacterial growth.

(10)

WARNINGS AND PRECAUTIONS

• For Professional Use Only. • For in vitro diagnostic use.

• Human source material. Material used in the preparation of this product has been tested and found non-reactive for hepatitis B surface antigen (HBsAg), antibodies to hepatitis C virus (HCV), and antibodies to human immunodeficiency virus (HIV-1 and HIV-2). Because no known test method can offer complete assurance that infectious agents are absent, handle reagents and patient samples as if capable of transmitting disease. Employ Standard and Universal Precautions; handle these reagents, all human blood and specimens as if capable of transmitting infectious disease, in a Biosafety Level 2 laboratory, applying the guidelines from the current CDC/NIH Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (12) or the WHO Laboratory Biosafety Manual (23) or equivalent local, regional and national regulations.

Optional Materials Available from Bio-Rad Laboratories Refer to Product Label for Content and Handling Precautions

Catalog Number Item Description Preparation

HEp-2 Substrate Slides, 12-well

Store at +2-8°C. Bring to room temperature prior to use. Use as

supplied. 26102 HEp-2 Substrate Slide, 12-well, 5/pk

26103 HEp-2 Substrate Slide, 12-well, 20/pk 26104 HEp-2 Substrate Slide, 12-well, 100/pk

26100 HEp-2 Substrate Slides, 6-well, 8/pk 26101 HEp-2 Substrate Slides, 6-well, 20/pk

26105 HEp-2 Substrate Slides, 24-well, 8/pk 26106 HEp-2 Substrate Slides, 24-well, 100/pk

30480 FITC Conjugate, 100 mL Use as supplied. Store at +2-8°C. 130 Liquichek™ Negative Control, 0.5 mL Use as supplied. Store at +2-8°C. 31996 Kallestad™ Patient Sample Diluent, 100 mL

• Phosphate buffered saline • 1% bovine serum albumin • 0.1% sodium azide preservative

Use as supplied. Store at +2-8°C.

Optional Liquichek™ Positive

Controls

HEp-2 Positive Controls:

• Centromere—PN 112 • SS-B—PN 113 • SS-A—PN 114 • Sm—PN 115 • RNP—PN 116 • Scl-70—PN 117 • Mitotic Spindle—PN 118

ANA Positive Controls:

• Homogeneous—PN 107 • Speckled Pattern—PN 108 • Nucleolar Pattern—PN 111

Dilute as directed, refer to QC Report for titer. Store at +2-8°C.

102610 Glass Coverslip, 24 x 60 mm

(for 12 and 6 well slides) Use as supplied. 30474 Glass Coverslip, 26 x 72 mm

(for 24 well slides) Use as supplied. 100586 Slide blotter, 24 well Use as supplied.

(11)

• Reagents Containing Sodium Azide

WARNING - The Positive Controls, Negative Controls, FITC Conjugate, Patient Sample Diluent, and

Evans’ Blue Counterstain reagents contain 0.1% sodium azide (NaN₃).

Sodium azide may react with lead and copper plumbing to form highly explosive metal azides. On disposal of liquids, flush with a large volume of water to prevent azide build-up. For further information, please refer to the Manual Guide - Safety Management No. CDC-22 issued by the Centers for Disease Control (13). Dispose of product and packaging waste in accordance with all applicable local, regional, national and international regulations.

• The Safety Data Sheet is available at bio-rad.com and upon request.

SPECIMEN COLLECTION AND PREPARATION

Serum is the recommended sample for this procedure. Grossly hemolyzed or lipemic serum may produce increased background staining of the substrate.

Collect blood using the routine precautions observed in venipunctures for clinical assays. When collecting and processing patient specimens, handle them as potentially infectious according to universal precautions and good clinical laboratory practices, regardless of their origin, treatment, or prior certification.

Store serum samples for up to 3 days at +2-8°C if they are protected from evaporation and contamination. For longer storage or shipment, freeze samples at –20°C or colder. Repeated freezing and thawing may cause deterioration of the test specimen.

CAUTION: Consider specimens and all materials they contact as potentially infectious, and dispose of

them in an appropriate manner. Use an appropriate disinfectant for decontamination. Do not pipette by mouth. Avoid generation of aerosols.

PROCEDURE

Materials Provided

1. R1: HEp-2 Substrate slides 2. C1: Positive Control 3. C0: Negative Control 4. R2: FITC Conjugate 5. R3: Mounting Media 6. R4: PBS

7. R5: Evans’ Blue Counterstain 8. Blotting Strips

Materials Required But Not Provided

1. 25 - 50 μL calibrated or adjustable micropipette and/or 5" Pasteur pipettes 2. Polypropylene test tubes: 1 mL minitubes or 12 x 75 mm or 13 x 100 mm 3. Test tube rack

4. Humidity chamber

5. Staining dish or Coplin jar for washing slides 6. Magnetic stirrer (optional)

7. Wash bottle

8. Glass cover slips, 24 x 60 mm (for 6 and 12 well slides), or 26 x 72 mm (for 24 well slides) 9. Distilled or deionized water (DIH₂O)

10. Fluorescent microscope. To obtain optimum results with fluorescein isothiocyanate, use a primary or excitation light of 480–490 nm to illuminate the specimen. View the specimen using filters which allow passage of light at 510 nm and greater.

H303: May be harmful if swallowed.

H313: May be harmful in contact with skin.

(12)

Procedural Comments

1. Include a positive and negative control on one slide of each lot number in the test run. 2. Do not dilute the negative control, it is provided at working strength.

3. As a sensitivity control, the positive control is optimized to produce a +1 fluorescence within 1 two-fold dilution (+ or –) of titer listed on the enclosed QC Report. This titer is used to monitor assay sensitivity and assist with grading of patient titers. The positive control may also be used undiluted as a pattern control.

4. When using slides in the following procedure, do not allow substrate to dry (see section on limitations to procedure).

5. To avoid damage to the substrate, do not touch pipette tip to well during application of sample. 6. For 24-well HEp-2 slides ONLY: Process slides individually or process up to 4 slides in a humidity

chamber.

7. Handle slides by the edges. Avoid touching wells. 8. Use pencil only to mark slides.

9. Work area should be free of drafts and direct air currents.

10. Keep glassware and plastic bottles clean by regularly washing with a mild detergent solution and rinsing well with deionized water.

Procedure

1. Remove appropriate number of slides from refrigerator. Equilibrate to room temperature in foil bags (20 minutes). Bring all reagents to room temperature.

2. Reconstitute PBS with 1 liter DI-water. Containers for PBS should be clean and free from contamination. Do not reuse PBS containers without cleaning them with a mild detergent solution to avoid microbial growth.

3. Prepare screening dilutions of the test sera. Use PBS or Patient Sample Diluent to make dilutions. Mix by inversion. Each lab should establish a screening dilution based on an “age-based normal range”. See Technical Bulletins “Oversensitivity in ANA Testing” and “ANA Normal Range Study.”

4. Use the Positive Control as a monitor of assay sensitivity and pattern identification. Prepare serial doubling dilutions of the Positive Control in the same diluent used for the test sera. Start with a 1:2 dilution and continue at least one dilution past the endpoint stated in the QC Report for the Control. 5. Remove slide from foil bag and place in humidity chamber. Immediately add 25-35 μL controls or

diluted test sera to appropriate wells. Be sure each well is entirely covered with sample. Repeat this step for all slides.

6. Cover humidity chamber. Incubate substrate slides at room temperature for 20 minutes. CAUTION: Avoid moving incubation chamber.

7. For 24-well HEp-2 slides ONLY: Use blotter to remove sera from slide wells. Gently place blotter

onto each slide to absorb sample (3-5 seconds). Do not touch blotter to substrate.

8. Rinse each slide briefly with a stream of PBS. Apply stream above wells so that PBS washes over each well, but do not apply stream directly on wells.

9. Wash slides for a total of 10 minutes in a staining dish filled with PBS. Gently agitate staining dish several times or use a magnetic stirrer during the wash.

10. Remove each slide or slide holder from staining dish and blot excess PBS from around wells using blotting strips. Do not touch strip to substrate.

11. Place slide(s) in humidity chamber and immediately dispense approximately 25 μL FITC Conjugate from dropper bottle to each well. Repeat this step for all slides.

12. Cover humidity chamber. Incubate 20 minutes at room temperature. 13. Rinse each slide briefly with a stream of PBS, as described in step 8 above.

14. Wash slides for a total of 10 minutes in a staining dish filled with PBS. Or perform an OPTIONAL counterstaining procedure: Add Evans’ Blue Counterstain to PBS in a staining dish (2-3 drops Evans’ Blue/150 mL PBS) and wash slides for a total of 10 minutes.

Example Suggested Screening Dilution

(13)

15. Remove each slide or slide holder from PBS and drain briefly on a paper towel. If using Slide Holder, remove slides for mounting. Apply 4 ± 1 drops mounting media per slide, making sure to cover all wells. Add coverslip.

16. View slides under a fluorescent microscope in a dark room. Evaluate each substrate well for the presence or absence of autoantibodies. The mounting media is semi-permanent, so fluorescent reactions may be re-evaluated for 1-2 weeks if slides are stored in the dark at +2-8°C. Screening magnification for the HEp-2 substrate should be determined in each laboratory based on the light source and optics of the microscope (200X is recommended). For pattern interpretation, use a dry lens and total magnification of ~400X – 600X.

17. Determine and record the staining pattern, and grade the intensity using these criteria: • +4 Brilliant apple green fluorescence

• +3 Bright apple green fluorescence

• +2 Clearly distinguishable, positive fluorescence

• +1 Lowest specific fluorescence that enables the staining to be clearly differentiated from the background fluorescence

QUALITY CONTROL

Both a positive and negative control should be included with each assay run.

The Positive Control (HOMOGENEOUS) should demonstrate even nuclear staining throughout the nucleus. In the dividing mitotic cells, the chromatin will fluoresce as an irregularly shaped mass. Often the chromatin will fluoresce more intensely in dividing mitotic cells. For monitoring the assay sensitivity, the staining should be +1 within one (+ or –) dilution of the Control titer given on the QC Report. The Control

Titer is determined on at least three lots of Bio-Rad Laboratories substrate slides using the current lot of Bio-Rad Laboratories FITC Conjugate. The actual control titer found in your laboratory may vary by plus or minus one doubling dilution due to technique, interpretation, or microscope differences. If your results vary by two or more doubling dilutions, contact the Bio-Rad Laboratories Technical Service Department or your local Bio-Rad Laboratories Representative.

Negative Control: There should be no distinct pattern visible nor any clear difference between the nucleus and cytoplasm.

INTERPRETATION OF RESULTS

The HEp-2 cells on each well are a mixture of cells in resting (interphase) (non-mitotic) and in various stages of mitosis. Mitosis is a cell division process that consists of four phases: 1) prophase, 2) metaphase, 3) anaphase, and 4) telophase. During mitosis, the nuclear membrane dissolves and the chromosomes are easily seen in a characteristic arrangement for each phase. Evaluate the resting (interphase) and mitotic cell reactions for each sample. Mitotic cells should be viewed during metaphase. I. The test for autoantibodies is negative if no specific pattern of fluorescence is observed on the

substrate, or the fluorescence is less than 1+.

II. The test for ANA is positive when the HEp-2 substrate shows a specific pattern of fluorescence and the fluorescence intensity is ≥ 1+.

ANA PATTERNS:

A. HOMOGENEOUS (DIFFUSE). The nucleus stains evenly throughout. Within mitotic cells, the chromosomes stain as an intensely stained irregularly shaped mass. This pattern combination is suggestive of autoantibodies to nDNA, histones, or DNP.

B. RIM (PERIPHERAL). The nucleus stains predominantly at its periphery. Within mitotic cells, the chromosomes may stain as an irregularly shaped mass with more intensely stained outer edges. This pattern combination is suggestive of autoantibodies to nDNA or DNA-histone complexes. If the mitotic cell chromosomes are negative, the rim nuclear pattern may be suggestive of autoantibodies to nuclear membrane (14).

C. SPECKLED. Speckled patterns 1) and 2) are suggestive of autoantibodies to Sm, RNP, Scl-70, SSA, SSB, or other undefined antigens.

1. FINE SPECKLED. Numerous small uniform points of fluorescence scattered throughout the nucleus with distinct nuclear margins. A few coarse speckles may be dispersed in the fine

(14)

speckles (often seen in MCTD). Mitotic cell cytoplasm may retain fine speckling, while the mitotic cell chromosomes are negative.

2. COARSE OR ATYPICAL SPECKLED. Medium sized uniform points of fluorescence scattered throughout the nucleus with distinct nuclear margins. The mitotic cell chromosomes are negative. Infrequently, larger speckles may also be present which give the appearance of a positive nucleolar pattern except they are too numerous and are variable in size. NOTE: Anti-Scl-70 is an exception to the above pattern description in that the mitotic chromosome regions are positive. The antigen is chromosome-associated and may be found with nucleolar staining.

3. DISCRETE SPECKLED (CENTROMERE SPECIFICITY). Medium sized uniform points of fluo-rescence scattered throughout the nucleus with indistinct nuclear margins. In mitotic cells, the discrete speckles are clustered only in the chromosome mass. During the prophase stage of mitosis, the cluster of speckles appear as a cloud over the entire chromosome mass. During metaphase and anaphase, the speckles localize to the chromosome regions and may appear as more defined bar shapes. The specificity of the discrete speckled pattern is to the centromere and is highly correlated with the CREST syndrome a variant of progres-sive systemic sclerosis (15).

D. NUCLEOLAR. Intense homogeneous staining of the nucleoli often associated with dull homogeneous fluorescence of the rest of the nucleus. Mitotic cell chromosomes are usually negative; however, some nucleolar antibodies may react with the chromosomes. The mitotic cells do not possess distinct nucleoli. The pattern is suggestive of autoantibodies to 4-6S RNA.

E. SPINDLE. In cells undergoing mitosis, only the spindle fluoresces. The spindle consists of a network of threads proceeding from the centrosomes and connecting the centrosomes to each other. The pattern is suggestive of autoantibodies to microtubule associated antigens (significance unknown).

III. Cytoplasmic staining reactions may be observed which are suggestive of mitochondrial (AMA), smooth muscle (ASMA), or other autoantibodies. These reactivities should be confirmed and

titered on substrates such as mouse stomach/kidney if results are to be reported.

A. MITOCHONDRIAL. A positive test for AMA is suggested when numerous cytoplasmic speckles in a fibrous network appear mainly in the cytoplasm of resting (interphase) and mitotic cells. A lim-ited number of fluorescent granules may be present across the surface of the nucleus.

B. SMOOTH MUSCLE. A positive test for ASMA is suggested when one of two staining patterns is observed:

1. IgG or IgM antibodies reacting with actin, myosin, or tubulin present a cotton-like, diapha-nous fluorescent appearance in the cytoplasm. Actin and myosin are protein components of microfilaments; tubulin is a protein component of microtubules (16,17).

2. A spidery network of fluorescence appears across the cell cytoplasm with fibrils extending from the cell membrane. Mitotic cells show large fluorescent speckles in the cytoplasm while the chromosome mass is negative. This type of staining is suggestive of an IgG or IgM auto-antibody with specificity to vimentin or keratin, protein components of the intermediate fila-ments in the cytoplasm (16,17).

IV. If the sample is positive for an autoantibody at the screening dilution, determine the titer by serially diluting the sample and rerunning the test with these dilutions. The titer of the autoantibody is the highest dilution demonstrating +1 specific fluorescence of the substrate at the magnification speci-fied in procedure step 17.

V. If Evans’ Blue Counterstain is used, the cells will appear red-orange and must be observed for the presence or absence of specific apple-green fluorescence.

LIMITATIONS OF THE PROCEDURE

1. The Kallestad HEp-2 Test is a diagnostic aid only. Low titer positive results may occur in apparently healthy people. Therefore, the results of this test must be interpreted in the context of the patient’s total clinical presentation.

(15)

2. Multiple autoantibodies may be present. Consequently, a given staining pattern may be produced by more than one antibody, and one antibody may interfere with the staining pattern of another, complicating pattern interpretation. Serially diluting the patient’s sample will often aid in distinguishing such patterns.

3. Infrequently, a very high titer of antibody may appear as a doubtful positive or negative result when run at a screening dilution. This phenomenon is due to a prozone reaction which occurs because of an insufficient quantity of tissue antigen for binding the large amount of antibody. Serially diluting the patient’s sample permits the semi-quantitative determination of the antibody titer.

4. It is recommended that laboratories performing ANA testing establish normal values for populations less than 40 years of age and greater than 40 years of age.

5. Sera from patients undergoing successful therapy for autoimmune disorders may be negative for ANA (2).

6. ANA specificity cannot be determined by morphological staining pattern alone (2). 7. Many drugs such as hydralazine and procainamide may induce ANA (21).

8. Dispensing varying volumes of patient sera dilutions or FITC conjugate to each well may cause sensitivity differences in well-to-well and day-to-day test runs. For this reason, Bio-Rad Laboratories recommends constant volume applications to each well.

9. Letting the HEp-2 slides dry during the procedure may generate a technical artifact which may be confused with a rim-like pattern. This artifact is distinguished from a true rim pattern by the great variation in the size of the rims. A true pattern will show nuclei which are approximately the same size. 10. If drying occurs within the HEp-2 wells during key steps of the assay process, the centers of the wells

can exhibit decreased fluorescence compared to the outer edges of the wells. This variability is sometimes referred to as a “donut” pattern. The most sensitive step in the HEp-2 procedure is the addition of the conjugate. If drying occurs before the conjugate is added fluorescence is significantly reduced. To reduce the potential for drying, process slides individually.

EXPECTED VALUES

Five independent laboratories and Bio-Rad Laboratories determined expected values on 111 serum samples. The sera were obtained from normal individuals and from patients with a wide variety of diseases including collagen-vascular disorders (e.g. SLE, RA, SS).

SPECIFIC PERFORMANCE CHARACTERISTICS

Specificity

The HEp-2 cells contain nuclear antigens.

The specificity of the FITC Conjugate is confirmed by immunoelectrophoresis and reverse Radial Immunodiffusion.

Accuracy

Serum samples were tested by both the Kallestad Test and a reference autoantibody test. These sera were obtained from normal individuals and from patients with a wide variety of diseases. 96.4% agreement was obtained between the Kallestad HEp-2 substrate and the reference method.

Diagnosis Kallestad

HEp-2 Test

Reference Method

(+) (–) (+) (–)

Juvenile Rheumatoid Arthritis 5 0 5 0

Rheumatoid Arthritis 8 1 8 1 SLE 23 1 21 3 Drug-induced SLE 2 0 2 0 MCTD 5 0 5 0 Other Collagen-Vascular 8 1 8 1 Other Diseases 13 11 17 7 Normal 1 32 1 32

(16)

(17)

Substrat de la lignée cellulaire HEp-2 KALLESTAD™

Test par immunofluorescence indirecte permettant la détection et la détermination semi-quantitative d’auto-anticorps antinucléaires humains.

(18)

TABLE DES MATIÈRES

Page Utilisation ...17 Lexique...4 Introduction ...19 Principes de la méthode ...19

Informations sur le produit ...19

Avertissements et mises en garde ...21

Prélèvement et préparation des échantillons...22

Protocole opératoire ...22

Contrôle qualité...24

Interprétation des résultats ...24

Limites du test...26

Valeurs prévues...27

Caractéristiques spécifiques de performance ...27

(19)

INTRODUCTION

La détection et la détermination semi-quantitative d’auto-anticorps aident au diagnostic des maladies auto-immunes (1). Le test HEp-2 Kallestad détecte les auto-anticorps antinucléaires (ANA).

Les laboratoires ont fait appel aux méthodes par immunofluorescence indirecte (IFA) pour mettre les auto-anticorps en évidence depuis 1957. Ces méthodes se basent sur le marquage d’un anticorps fluorescent pour détecter la formation du complexe antigène-anticorps qui se produit à la surface d’un substrat. Les cellules épithéliales humaines (HEp-2) font partie des substrats fréquemment utilisés avec la méthode IFA. D’autres substrats courants, tels le rein et l’estomac de souris, ainsi que Crithidia luciliae (un hémoflagellé), sont également disponibles auprès de Bio-Rad Laboratories. L’observation d’un aspect de fluorescence spécifique sur le substrat indique la présence d’auto-anticorps dans le sérum du patient.

On observe fréquemment un résultat ANA positif chez des patients atteints de troubles auto-immuns tels qu’un lupus érythémateux systémique (LES), une connectivité mixte (syndrome de Sharp) (MCTD), une polyarthrite rhumatoïde (PR), le syndrome de Sjögren (SS) et une sclérodermie généralisée (SG) (2). Toutefois, l’incidence de résultats ANA positifs de faible titre augmente avec l’âge chez les sujets normaux (3). La présence d’anticorps de titre faible doit donc être interprétée dans le cadre d’autres informations cliniques.

PRINCIPES DE LA MÉTHODE

Les auto-anticorps présents dans un échantillon à analyser se lient aux antigènes dans le substrat. Le lavage élimine l’excédent de sérum du substrat. L’antisérum conjugué à la fluorescéine (FITC) ajouté au substrat se fixe aux anticorps liés. Après un second lavage pour éliminer l’excédent de conjugué, recouvrir le substrat d’une lamelle couvre-objet et l’examiner pour la présence d’aspects fluorescents sous un microscope à fluorescence. L’observation d’aspects fluorescents spécifiques sur le substrat indique la présence d’auto-anticorps dans l’échantillon à analyser.

INFORMATIONS SUR LE PRODUIT

Une fois ouverts, tous les réactifs restent stables jusqu’à la date de péremption indiquée sur l’étiquette, lorsqu’ils sont conservés aux températures recommandées et ne contiennent aucun signe visible de contamination. Si l’on craint un stockage ou une manipulation incorrecte de la trousse pendant l’expédition, réaliser le test en utilisant seulement les contrôles positif et négatif et comparer les résultats aux valeurs attendues. La trousse doit être conservée à +2-8 °C (certains composants peuvent être conservés à température ambiante, voir les informations ci-dessous).

Les réactifs suivants peuvent être utilisés de manière interchangeable avec les substrats Crithidia, MSK et HEp-2 :

• Conjugué FITC - Num. Réf. 30446, 2,5 mL et 30480, 100 mL • Milieu de montage - Num. Réf. 30403

• Tampon phosphate salin - Num. Réf. 31098

(20)

Numéro de référence du kit

Description de l’article

30471 Kit Kallestad™ HEp-2, 12 puits, 60 tests

Réactif Qté Qté Qté

Num. Réf.

comp. Composant Préparation

R1

5 20 Lames de substrat HEp-2, 12 puits Conserver à

+2-8 °C. Laisser revenir à température ambiante avant utilisation. Utiliser sous la forme fournie. 8 Lames de substrat HEp-2, 6 puits

• Substrat HEp-2 fixé sur des lames de verre • Tenir les lames par les bords.

• Ne pas appliquer de pression sur la surface de la pochette en aluminium.

R2

1 4 1 30446 Conjugué FITC, 2,5 mL

• Antisérum conjugué à la fluorescéine dirigé contre les immunoglobulines humaines

• 1 % de sérum-albumine d’origine bovine • Solution tampon phosphate salin (pH ~ 7) • 0,1 % d’azide de sodium comme conservateur

Utiliser sous la forme fournie. Conserver à +2-8 °C. R3 1 2 1 30403 Milieu de montage, 2,5 mL

• Un milieu de montage tamponné semi-permanent dans une solution tampon Trizma, pH 7-8

• ≤ 7,5 % d’alcool polyvinylique • ≤ 20 % 1,2-Propanédiol Utiliser sous la forme fournie. Conserver à +2-26 °C. R4

2 4 2 31098 Tampon phosphate salin (PBS),

pH 7,3 ± 0,10, 11,34 g/flacon

• Phosphate de sodium dibasique • Phosphate de sodium monobasique • Chlorure de sodium

• Stable sous forme cristalline pendant 24 mois à +2-8 °C ou à température ambiante (TA = 18-26 °C)

Dissoudre le contenu d’un flacon dans de

l’eau distillée pour obtenir un volume final d’un

litre. Stable pendant 3 mois à

la TA.

R5

1 1 1 30431 Contre-colorant au bleu d’Evans, 2,5 mL • ≤ 2 % de colorant au bleu d’Evans

• 0,1 % d’azide de sodium comme conservateur

Utiliser sous la forme fournie. Conserver à

+2-26 °C.

C0

1 2 1 Contrôle Négatif Kallestad™, 0,5 mL

• Pool de sérum humain normal

• 1 % de sérum-albumine d’origine bovine • 0,1 % d’azide de sodium comme conservateur

Utiliser sous la forme fournie. Conserver à

+2-8 °C.

C1

1 1 1 Contrôle Positif Homogène Kallestad™, 0,5 mL

• Pool de sérum humain ayant une activité auto-anticorps spécifique

Diluer selon les consignes ; consulter le rapport CQ pour le titre. Conserver à +2-8 °C. SO 5 20 8 25090 25089

Papier buvard pour lames, 12 puits Papier buvard pour lames, 6 puits

Utiliser sous la forme fournie. SO 1 1 1 Mini-CD, Mode d’emploi, Produit IFA Kallestad™ Utiliser sous la

forme fournie. Un changement de la réactivité ou de la fluorescence attendue, la présence d’un dépôt dans le flacon ou une apparence trouble, indiquant une croissance bactérienne, sont des signes de détérioration possible des réactifs.

(21)

AVERTISSEMENTS ET MISES EN GARDE

• Exclusivement à usage professionnel. • Dispositif médical de diagnostic in vitro.

• Matériel d’origine humaine. Le matériel utilisé dans la préparation de ce produit a été testé et trouvé négatif en antigène de surface de l’hépatite B (HBsAg), en anticorps contre le virus de l’hépatite C (HCV) et en anticorps contre le virus de l’immunodéficience humaine (HIV-1 et HIV-2). Toutefois, aucune méthode de test connue ne peut garantir absolument l’absence d’agents infectieux. Il convient donc de manipuler les réactifs et les échantillons patients comme s’ils étaient potentiellement infectieux. Observer les précautions standard et universelles. Manipuler ces réactifs ainsi que le sang et les prélèvements humains comme s’ils étaient capables de transmettre des maladies infectieuses, dans un laboratoire de biosécurité de niveau 2, en appliquant les directives de la dernière édition de Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (Biosécurité dans les laboratoires microbiologiques et biomédicaux) (12) des CDC/NIH, du Laboratory Biosafety Manual

Matériel facultatif disponible auprès de Bio-Rad Laboratories

Consulter l’étiquette du produit pour le contenu et les précautions de manipulation

Numéro de référence Description de l’article Préparation

Lames de substrat HEp-2, 12 puits

Conserver à +2-8 °C. Laisser revenir à température ambiante avant utilisation. Utiliser sous la forme

fournie. 26102 Lame de substrat HEp-2, 12 puits, 5/boîte

26103 Lame de substrat HEp-2, 12 puits, 20/boîte 26104 Lame de substrat HEp-2, 12 puits, 100/boîte

Lames de substrat HEp-2, 6 puits

26100 Lames de substrat HEp-2, 6 puits, 8/boîte 26101 Lames de substrat HEp-2, 6 puits, 20/boîte

Lames de substrat HEp-2, 24 puits

26105 Lames de substrat HEp-2, 24 puits, 8/boîte 26106 Lames de substrat HEp-2, 24 puits, 100/boîte

30480 Conjugué FITC, 100 mL Utiliser sous la forme fournie. Conserver à +2-8 °C. 130 Contrôle Négatif Liquichek™, 0,5 mL Utiliser sous la forme fournie.

Conserver à +2-8 °C. 31996 Diluant d’échantillons patients Kallestad™,

100 mL

• Tampon phosphate salin

Utiliser sous la forme fournie. Conserver à +2-8 °C.

Contrôles Positifs Liquichek™ en option

Contrôles Positifs HEp-2 : • Centromère — Num. Réf. 112 • SS-B — Num. Réf. 113 • SS-A — Num. Réf. 114 • Sm — Num. Réf. 115 • RNP — Num. Réf. 116 • Scl-70 — Num. Réf. 117

• Fuseau mitotique — Num. Réf. 118 Contrôles Positifs ANA :

• Homogène — Num. Réf. 107

• Fluorescence mouchetée — Num. Réf. 108 • Fluorescence nucléolaire — Num. Réf. 111

Diluer selon les consignes ; consulter le rapport CQ pour le titre. Conserver

à +2-8 °C.

102610 Lamelle couvre-objet en verre, 24 x 60 mm

(pour lames 12 et 6 puits) Utiliser sous la forme fournie. 30474 Lamelle couvre-objet en verre, 26 x 72 mm

(pour lames 24 puits) Utiliser sous la forme fournie. 100586 Papier buvard pour lames, 24 puits Utiliser sous la forme fournie.

(22)

(Manuel de sécurité biologique de laboratoire) (23) de l’OMS ou des réglementations locales, régionales et nationales équivalentes.

• Réactifs contenant de l’azide de sodium

ATTENTION—Les Contrôle Positif, Contrôle Négatif, Conjugué à la fluorescéine et Contre-colorant

au bleu d’Evans contient 0,1% d’azoture de sodium (NaN₃).

L’azide de sodium peut réagir avec les conduites en plomb ou en cuivre pour former des azides métalliques très explosifs. Aussi, après avoir jeté les solutions contenant de l’azide de sodium, il faut rincer à grande eau afin d’éviter la formation de tels azides. Pour de plus amples informations, se référer au Manual Guide - Safety Management No. CDC-22 (Manuel d’utilisation - Gestion de la sécurité N° CDC-22) publié par les CDC (Centers for Disease Control) (13). Éliminer les déchets liés au produit et à l’emballage conformément à toutes les réglementations locales, régionales, nationales et internationales en vigueur.

• La fiche de données de sécurité est disponible sur bio-rad.com et sur demande.

PRÉLÈVEMENT ET PRÉPARATION DES ÉCHANTILLONS

Le type d’échantillon recommandé pour cette analyse est le sérum. Un sérum fortement hémolysé ou lipémique risque de produire une intensification de la coloration de fond du substrat.

Le prélèvement sanguin doit être réalisé en observant les précautions habituelles associées aux ponctions veineuses pour dosages cliniques. Lors du recueil et du traitement des prélèvements de patients, manipuler ceux-ci comme des produits potentiellement infectieux conformément aux précautions universelles et aux bonnes pratiques de laboratoire clinique, indépendamment de leur origine, traitement ou certification antérieure.

Les échantillons sériques peuvent être conservés pendant 3 jours maximum à +2-8 °C s’ils sont protégés de toute évaporation et contamination. S’ils doivent être conservés plus longtemps ou expédiés, congeler les échantillons à -20 °C minimum. Des cycles de congélation-décongélation répétés peuvent provoquer la détérioration de l’échantillon à analyser.

ATTENTION : Considérer les prélèvements et tous les matériels avec lesquels ils entrent en contact

comme potentiellement infectieux, et les mettre au rebut suivant les procédures établies. Ne pas pipeter à la bouche. Eviter la production d’aérosols.

PROTOCOLE OPÉRATOIRE

Matériel fourni

1. R1 : Lames de substrat HEp-2 2. C1 : Contrôle Positif

3. C0 : Contrôle Négatif

4. R2 : Conjugué à la fluorescéine 5. R3 : Milieu de Montage

6. R4 : PBS

7. R5 : Contre-colorant au bleu d’Evans 8. Bandelettes de papier buvard

Matériel requis mais non fourni

1. Micropipette calibrée ou réglable à 25 - 50 μL et/ou pipettes Pasteur de 12,7 cm (5 po.) 2. Tubes à essai en polypropylène : minitubes de 1 mL ou 12 x 75 mm ou 13 x 100 mm 3. Portoir pour tubes à essai

4. Chambre humide

5. Cuve à coloration ou cuve Coplin pour le lavage des lames 6. Agitateur magnétique (facultatif)

7. Flacon de lavage

8. Lamelles couvre-objets de 24 x 60 mm (pour lames à 6 et 12 puits) ou de 26 x 72 mm (pour lames à 24 puits)

H303: Peut être nocif par ingestion.

H313: Peut être nocif par contact avec la peau.

(23)

9. Eau distillée ou déminéralisée (DIH₂O)

10. Microscope à fluorescence. Utiliser une lumière primaire ou d’excitation de 480 à 490 nm pour éclairer l’échantillon afin d’obtenir des résultats optimum avec l’isothiocyanate de fluorescéine. Observer l’échantillon à l’aide de filtres qui laissent passer la lumière à 510 nm et à des longueurs d’onde plus élevées.

Précautions relatives à la méthode

1. Inclure un contrôle positif et un contrôle négatif sur une lame de chaque numéro de lot utilisé dans la série analytique.

2. Ne pas diluer le contrôle négatif, il est fourni à la concentration de travail.

3. En tant que contrôle de sensibilité, le contrôle positif est optimisé pour produire une fluorescence de +1 dans un écart de 1 double dilution (+ ou -) du titre indiqué dans le rapport CQ annexé. Ce titre est utilisé pour surveiller la sensibilité du dosage et faciliter la classification des titres patients. Le contrôle positif peut aussi être utilisé non dilué comme contrôle de la fluorescence.

4. Lors de l’utilisation des lames dans l’essai suivant ne pas laisser le substrat sécher (voir la section sur les limites du test).

5. Afin d’éviter de perturber le substrat, ne pas laisser l’embout de la pipette entrer en contact avec le puits lors du dépôt de l’échantillon.

6. Pour les lames HEp-2 à 24 puits SEULEMENT : Préparer les lames une par une ou 4 à la fois

maximum dans la chambre humide.

7. Tenir les lames par les bords. Éviter de toucher les puits. 8. Marquer les lames uniquement au crayon.

9. La zone de travail doit être protégée des courants d’air.

10. Maintenir la propreté de la verrerie et des flacons en plastique en les nettoyant régulièrement avec une solution détergente douce et en les rinçant soigneusement à l’eau déminéralisée.

Protocole opératoire

1. Retirer le nombre de lames nécessaire du réfrigérateur. Les laisser revenir à température ambiante dans les pochettes en aluminium (20 minutes). Ramener tous les réactifs à température ambiante. 2. Reconstituer le PBS avec 1 litre d’eau déminéralisée. Les récipients destinés au PBS doivent être

propres et non contaminés. Ne pas réutiliser les récipients de PBS sans les nettoyer avec une solution détergente douce pour éviter toute croissance microbienne.

3. Préparer les dilutions de dépistage des échantillons sériques. Utiliser le PBS ou le Diluant d’échantillons patients pour effectuer les dilutions. Mélanger en retournant les flacons. Il incombe à chaque laboratoire d’établir une dilution de dépistage en fonction d’une “plage d’âge normale”. Consulter les bulletins techniques “Sensibilité excessive lors de tests ANA” et “Étude de la plage ANA normale”.

4. Utiliser le Contrôle Positif pour surveiller la sensibilité du dosage et identifier la fluorescence. Préparer des doubles dilutions successives du Contrôle Positif dans le même diluant utilisé pour les échantillons sériques. Commencer avec une dilution selon une proportion de 1:2 et continuer avec au moins une dilution au-delà du critère indiqué dans le rapport CQ du Contrôle.

5. Retirer la lame de la pochette en aluminium et la placer dans la chambre humide. Ajouter immédiatement 25 à 35 μL de contrôle ou d’échantillon sérique dilué dans les puits appropriés. S’assurer que chaque puits est complètement rempli de l’échantillon. Répéter cette étape pour toutes les lames.

6. Recouvrir la chambre humide et le porte-lames. Laisser incuber les lames de substrat à température ambiante pendant 20 minutes. MISE EN GARDE : Éviter de déplacer la chambre d’incubation. 7. Pour les lames HEp-2 à 24 puits SEULEMENT : Utiliser un papier buvard pour extraire les

échantillons des puits des lames. Poser doucement le papier buvard sur chaque lame pour absorber l’échantillon (3 à 5 secondes). Ne pas laisser le papier buvard entrer en contact avec le substrat. 8. Rincer rapidement chaque lame sous un jet de PBS. Diriger le jet au-dessus des puits de façon à ce

que la solution PBS lave chaque puits mais ne pas diriger le jet directement sur les puits.

Exemple Dilution de dépistage recommandée

(24)

9. Laver les lames dans une cuve de coloration remplie de solution PBS pendant 10 minutes. Agiter doucement la cuve de coloration plusieurs fois ou utiliser un agitateur magnétique pendant le lavage. 10. Retirer les lames ou le porte-lames de la cuve de coloration et absorber l’excédent de solution PBS

autour des puits à l’aide des bandes de papier buvard. Ne pas laisser une bande entrer en contact avec le substrat.

11. Placer la ou les lames dans la chambre humide et à l’aide du flacon compte-gouttes, distribuer immédiatement environ 25 μL de Conjugué à la fluorescéine dans chaque puits. Répéter cette étape pour toutes les lames.

12. Recouvrir la chambre humide et le porte-lames. Laisser incuber pendant 20 minutes à température ambiante.

13. Rincer rapidement chaque lame sous un jet de PBS ainsi qu’il est décrit à l’étape 8 ci-dessus.

14. Laver les lames dans une cuve de coloration remplie de solution PBS pendant 10 minutes. Il est aussi possible de réaliser une technique de contre-coloration EN OPTION : Ajouter du contre-colorant au bleu d’Evans au PBS dans une cuve de coloration (à raison de 2 à 3 gouttes de bleu d’Evans par 150 mL de PBS) et laver les lames pendant 10 minutes.

15. Retirer chaque lame ou le porte-lames de la solution PBS et les égoutter brièvement sur un papier absorbant. Si un porte-lames est utilisé, en retirer les lames pour le montage. Déposer 4 gouttes ± 1 de milieu de montage sur chaque lame en s’assurant de remplir tous les puits. Les recouvrir d’un couvre-objets.

16. Examiner les lames sous un microscope à fluorescence dans une chambre noire. Évaluer la présence ou l’absence d’auto-anticorps dans chaque puits de substrat. Le milieu de montage est semi-permanent et il est donc possible d’évaluer à nouveau les réactions de fluorescence pendant 1 à 2 semaines si les lames sont conservées dans l’obscurité à +2-8 °C. Il incombe à chaque laboratoire de définir le grossissement de dépistage pour le substrat HEp-2 en fonction de la source lumineuse et de l’optique du microscope (un grossissement de 200 x est recommandé). Pour l’interprétation des aspects, utiliser un objectif à sec et un grossissement total de ~400 à 600 x.

17. Déterminer et enregistrer l’aspect de la coloration et évaluer l’intensité selon les critères suivants : • +4 fluorescence jaune-vert brillant d’intensité maximale

• +3 fluorescence jaune-vert moins brillant • +2 fluorescence positive clairement définie

• +1 la plus faible fluorescence permettant de distinguer le colorant de la fluorescence de fond

CONTRÔLE QUALITÉ

Chaque série analytique doit inclure un contrôle positif et un contrôle négatif.

Le Contrôle Positif (HOMOGÈNE) doit manifester une coloration nucléaire égale dans tout le noyau. Dans les cellules mitotiques qui se divisent, la chromatine doit émettre une fluorescence de masse irrégulière. La chromatine émet souvent une fluorescence plus intense pendant la mitose. En ce qui concerne la vérification de la sensibilité du dosage, la coloration doit être +1 dans un écart de (+ ou -) une

dilution du titre du Contrôle indiqué dans le rapport CQ. Le titre du Contrôle est déterminé sur un minimum de trois lots de lames de substrat Bio-Rad Laboratories en utilisant le lot actuel de son Conjugué à la fluorescéine. Le titre réel du contrôle trouvé en laboratoire peut varier d’une double dilution en plus ou en moins en fonction de la technique utilisée, de l’interprétation des résultats ou de différences d’un microscope à l’autre. Si les résultats varient de deux doubles dilutions ou plus, contacter le service technique de Bio-Rad Laboratories ou le représentant local de la société.

Contrôle Négatif : On ne devrait pas observer d’aspect défini évident ni de différence visible entre le noyau et le cytoplasme.

INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS

Les cellules HEp-2 sur chaque puits constituent un mélange de cellules à l’état de repos (interphase) (non-disjonction mitotique) et dans diverses phases de mitose. La mitose est un processus de division cellulaire qui comporte les quatre phases suivantes : 1) prophase 2) métaphase 3) anaphase 4) télophase. Pendant la mitose, la membrane nucléaire se dissout et les chromosomes se distinguent facilement dans une disposition caractéristique de chaque phase. Il convient donc d’évaluer l’état de repos (interphase) et les réactions des cellules mitotiques pour chaque échantillon. Les cellules mitotiques doivent être observées en métaphase.

(25)

I. Le test de dépistage d’auto-anticorps est négatif si aucun aspect fluorescent n’est observé sur le substrat ou si la fluorescence est inférieure à 1+.

II. Le test de dépistage d’ANA est positif lorsque le substrat HEp-2 met en évidence un aspect fluores-cent particulier et que l’intensité de la fluorescence est ≥ 1+.

ASPECT DES ANA :

A. HOMOGÈNE (DIFFUS). Le noyau se colore uniformément de façon homogène. Dans les cellules mitotiques, la coloration intense des chromosomes prend l’aspect d’une masse de forme irrégulière. Cette combinaison d’aspects indique la présence d’auto-anticorps ADNn, anti-histones ou anti-DNP.

B. PÉRIPHÉRIQUE (BORD). Le noyau se colore principalement à sa périphérie. Dans les cellules mitotiques, les chromosomes peuvent se colorer sous forme de masse irrégulière avec des bords externes à coloration plus intense. Cette combinaison d’aspects indique la présence d’auto-anticorps anti-ADNn ou de complexes ADN-histone. Si les chromosomes des cellules mitotiques sont négatifs, l’aspect du bord nucléaire peut indiquer la présence d’auto-anticorps dirigés contre la membrane nucléaire (14).

C. MOUCHETÉ. Les aspects mouchetés 1) et 2) indiquent la présence d’auto-anticorps anti-antigènes Sm, RNP, Scl-70, SSA, SSB ou contre d’autres anti-antigènes non définis.

1. FINEMENT MOUCHETÉ. Nombreux petits points de fluorescence uniformes, répartis dans tout le noyau avec des bords nucléaires distincts. Quelques gros granules peuvent être dispersés dans le fin marquage moucheté (aspect souvent observé dans les MCTD). Le cytoplasme des cellules mitotiques peut conserver une fine granulation bien que leurs chromosomes soient négatifs.

2. GROS GRANULES OU GRANULES ATYPIQUES. Points de fluorescence de taille moyenne uniforme répartis dans tout le noyau avec des bords nucléaires distincts. Les chromosomes des cellules mitotiques sont négatifs. Dans de rares cas, de plus gros granules peuvent également être présents, ce qui donne un aspect nucléolaire positif, sauf qu’ils sont trop nombreux et de taille variable.

REMARQUE : Les anticorps anti-Scl-70 constituent une exception à l’aspect décrit ci-dessus en ce que les régions chromosomiques mitotiques sont positives. L’antigène est associé aux chromosomes et peut être découvert par la coloration nucléolaire.

3. GRANULATION DISCRÈTE (SPÉCIFICITÉ DU CENTROMÈRE). Points de fluorescence de taille moyenne uniforme répartis dans tout le noyau avec des bords nucléaires indistincts. Dans les cellules mitotiques, les granules discrets ne sont groupés que dans la masse chromosomique. Lors de la prophase de la mitose, le groupe de granules ressemble à un nuage sur toute la masse chromosomique. Lors de la métaphase et de l’anaphase, les granules se localisent dans les régions chromosomiques et peuvent présenter des formes de bâtonnets plus définies. La spécificité de l’aspect moucheté discret est associée au centromère et a une corrélation élevée avec le syndrome Crest, une variante de la sclérodermie généralisée (15).

D. NUCLÉOLAIRE. Coloration homogène intense des nucléoles souvent associée à une fluorescence homogène diffuse du reste du noyau. Les chromosomes des cellules mitotiques sont généralement négatifs ; mais quelques anticorps anti-nucléolaires peuvent réagir aux chromosomes. Les cellules mitotiques ne possèdent pas de nucléoles distincts. Cet aspect suggère la présence d’auto-anticorps anti-ARN 4-6S.

E. FUSEAU. Dans les cellules mitotiques, seul le fuseau émet une fluorescence. Le fuseau se compose d’un réseau de filaments émanant des centrosomes et connectant ceux-ci l’un à l’autre. Cet aspect suggère la présence d’auto-anticorps dirigés contre les microtubules associées aux antigènes (signification inconnue).

III. On peut observer des réactions de coloration cytoplasmique qui suggèrent la présence d’auto-anticorps anti-mitochondries (AMA), anti-muscles lisses (ASMA) ou autres. Ces réactivités doivent

être vérifiées et titrées sur des substrats tels que estomac/rein de souris si le rapport des résultats doit être présentés.

(26)

A. MITOCHONDRIAL. Le test est positif pour la présence d’AMA si de nombreux granules cytoplasmiques dans un réseau fibreux apparaissent principalement dans le cytoplasme de cellules mitotiques à l’état de repos (interphase). Un nombre limité de granules fluorescents peut être présent sur toute la surface du noyau.

B. MUSCLE LISSE. Le test est positif pour la présence d’ASMA si l’on observe un des deux aspects de coloration suivants :

1. Des anticorps anti-IgG ou IgM réagissant avec l’actine, la myosine ou la tubuline ont un aspect fluorescent cotonneux et diaphane dans le cytoplasme. L’actine et la myosine sont des composants protéiniques des microfilaments ; la tubuline est un composant protéinique des microtubules (16,17).

2. Un réseau de fluorescence stellaire apparaît dans le cytoplasme cellulaire avec des fibrilles émanant de la membrane. Les cellules mitotiques présentent de gros granules fluorescents dans le cytoplasme alors que la masse chromosomique est négative. Ce type de coloration suggère la présence d’auto-anticorps anti-IgG ou IgM avec une spécificité à la vimentine ou aux kératines, composants protéiniques des filaments intermédiaires dans le cytoplasme (16,17).

IV. Si l’échantillon est positif pour un auto-anticorps à la dilution de dépistage, déterminer le titre par dilutions successives de l’échantillon et recommencer le test avec ces dilutions. Le titre d’auto-anticorps est la dilution la plus élevée démontrant une fluorescence spécifique du substrat de +1 au grossissement indiqué à l’étape 17 du protocole opératoire.

V. Si du contre-colorant au bleu d’Evans est utilisé, les cellules apparaîtront rouge-orange et doivent être évaluées pour la présence ou l’absence d’une fluorescence spécifique vert-jaune.

LIMITES DU TEST

1. Le test HEp-2 Kallestad constitue uniquement une aide diagnostique. Des résultats positifs à titre faible peuvent se présenter chez des sujets apparemment sains. Les résultats de ce test doivent donc être interprétés dans le cadre du tableau clinique général du patient.

2. Divers auto-anticorps peuvent être présents. Un aspect de coloration donné peut donc être produit par plus d’un anticorps, et un anticorps particulier peut altérer l’aspect de coloration d’un autre, ce qui complique l’interprétation des aspects. Des dilutions successives de l’échantillon patient aident souvent à différencier ces aspects.

3. Dans de rares cas, un titre très élevé d’anticorps peut apparaître comme un résultat positif ou négatif douteux lors de son analyse à une dilution de dépistage. Ce phénomène provient d’une réaction de zone qui se produit en raison d’une quantité insuffisante d’antigènes dans le tissu pour lier un taux élevé d’anticorps. Des dilutions successives de l’échantillon patient permettent la détermination semi-quantitative du titre des anticorps.

4. Il est recommandé aux laboratoires réalisant des tests ANA d’établir des valeurs normales pour les populations de moins et de plus de 40 ans.

5. Des échantillons sériques provenant de patients sous traitement efficace contre des troubles auto-immuns peuvent être négatifs pour la présence d’ANA (2).

6. La spécificité des ANA ne peut pas être déterminée uniquement par l’aspect de la coloration morphologique (2).

7. De nombreux médicaments tels que l’hydralazine et la procaïnamide peuvent induire des ANA (21). 8. La distribution de différents volumes de dilutions d’échantillons sériques de patients ou de conjugué

à la fluorescéine dans chaque puits peut provoquer des différences de sensibilité dans les séries analytiques d’un puits à l’autre et d’un jour à l’autre. C’est pour cette raison que Bio-Rad Laboratories recommande le dépôt d’un volume identique dans chaque puits.

9. Si on laisse sécher les lames HEp-2 pendant l’analyse, un artefact technique risque de se produire susceptible d’être confondu avec un aspect périphérique. Un tel artefact se distingue d’un véritable aspect périphérique par la grande variation de taille des bords. Un véritable aspect périphérique présente des noyaux qui sont tous à peu près de la même taille.

10. Si les puits de HEp-2 sèchent pendant les étapes clés du protocole de dosage, les centres des puits peuvent donner une fluorescence moindre comparée à celle de leurs bords externes. Cette variabilité s’appelle parfois un aspect annulaire. L’étape la plus délicate du test sur HEp-2 est l’ajout du

(27)

conjugué. Si les puits sèchent avant l’ajout du conjugué, la fluorescence est grandement réduite. Il convient donc de préparer les lames une par une afin de réduire les risques de séchage.

VALEURS PRÉVUES

Cinq laboratoires indépendants ainsi que Bio-Rad Laboratories ont déterminé les valeurs attendues sur 111 échantillons sériques. Ces échantillons ont été prélevés sur des sujets normaux et des patients présentant des maladies très diverses, dont une collagénose avec manifestations vasculaires (notamment, lupus érythémateux systémique, polyarthrite rhumatoïde ou sclérodermie généralisée).

CARACTÉRISTIQUES SPÉCIFIQUES DE PERFORMANCE

Spécificité

Les cellules HEp-2 contiennent des antigènes nucléaires.

La spécificité du Conjugué à la fluorescéine est confirmée par immunoélectrophorèse et immunodiffusion radiale inversée.

Exactitude

Des échantillons sériques ont été soumis au test Kallestad et à un test de dépistage d’auto-anticorps de référence. Ces échantillons ont été prélevés sur des sujets normaux et des patients présentant des maladies très diverses. Une concordance de 96,4 % a été obtenue entre le substrat HEp-2 Kallestad et la méthode de référence.

Diagnostic Test HEp-2 Kallestad

Méthode de référence

(+) (–) (+) (–)

Arthrite chronique juvénile 5 0 5 0

Polyarthrite rhumatoïde 8 1 8 1

LES 23 1 21 3

Lupus induit 2 0 2 0

Connectivité mixte 5 0 5 0

Autre collagénose avec manifestations

vasculaires

8 1 8 1

Autres maladies 13 11 17 7

(28)

(29)

Sustrato de células HEp-2

de KALLESTAD™

Procedimiento indirecto que utiliza anticuerpos fluorescentes para la detección y semicuantificación de autoanticuerpos nucleares humanos.

(30)

ÍNDICE

Página Indicaciones ...29 Glosario ...4 Resumen y explicación ...31 Principios del procedimiento ...31 Información sobre el producto...31 Advertencias y precauciones ...33 Recogida y preparación de muestras ...34 Procedimiento ...34 Control de calidad...36 Interpretación de los resultados ...37 Limitaciones del procedimiento ...38 Valores esperados ...39 Características específicas de rendimiento ...39 Referencias ... 101

(31)

RESUMEN Y EXPLICACIÓN

La detección y semicuantificación de autoanticuerpos facilita el diagnóstico de enfermedades autoinmunitarias (1). La prueba de HEp-2 de Kallestad detecta autoanticuerpos antinucleares (ANA).

Los laboratorios han utilizado procedimientos indirectos con anticuerpos fluorescentes (IFA) para detectar autoanticuerpos desde 1957. En estos procedimientos, un anticuerpo fluorescente sirve como marcador de las reacciones de unión antígeno-anticuerpo que se producen en una superficie de sustrato. Uno de los sustratos empleados frecuentemente en el procedimiento IFA son las células epiteliales humanas (HEp-2). Bio-Rad Laboratories también suministra otros sustratos comunes, tales como riñón y estómago de ratón, y Crithidia luciliae (un hemoflagelado). La observación de un patrón de fluorescencia específico en el sustrato indica la presencia de autoanticuerpos en el suero del paciente.

Los pacientes que sufren enfermedades autoinmunitarias tales como lupus eritematoso diseminado (LED), enfermedad mixta del tejido conjuntivo (EMTC), artritis reumatoide (AR), síndrome de Sjögren (SS) y esclerosis diseminada progresiva (EDP) suelen dar positivo en pruebas de ANA (2). Sin embargo, la incidencia de positivos con un valor bajo de ANA aumenta con la edad en individuos normales (3). Por tanto, la presencia de valores bajos de anticuerpos debe interpretarse conjuntamente con otros tipos de información clínica.

PRINCIPIOS DEL PROCEDIMIENTO

Los autoanticuerpos de las muestras del análisis se unen a los antígenos del sustrato. El lavado elimina el suero sobrante del sustrato. El antisuero conjugado con fluoresceína (FITC) añadido al sustrato se acopla al autoanticuerpo unido. Tras un segundo paso de lavado para eliminar el conjugado sobrante, el sustrato se cubre con un cubreobjetos y se examina a través de un microscopio de fluorescencia para observar los patrones fluorescentes. La observación de uno o varios patrones de fluorescencia específicos en el sustrato indica la presencia de autoanticuerpos en la muestra del análisis.

INFORMACIÓN SOBRE EL PRODUCTO

Una vez abiertos, todos los reactivos son estables hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta si se conservan a la temperatura indicada y no muestran señales visibles de contaminación. Si se sospecha que el kit puede haber sido conservado o manipulado incorrectamente durante el transporte, realice la prueba utilizando sólo controles positivos y negativos, y compruebe los resultados esperados. El kit debe conservarse a entre +2 y 8 °C (algunos componentes pueden conservarse a temperatura ambiente, véase lo indicado a continuación).

Los siguientes reactivos pueden utilizarse de forma intercambiable con los sustratos Crithidia, estómago-riñón de ratón y HEp-2:

• Conjugado FITC - NP 30446, 2,5 mL y 30480, 100 mL • Medio de montaje - NP 30403

• Solución salina amortiguada con fosfato - NP 31098 • Contratinción de azul de Evans - NP 30431

(32)

Número de catálogo del

kit Descripción del artículo

30471 Kit de HEp-2 de Kallestad™, 12 pocillos, 60 pruebas

Reactivo Cant. Cant. Cant.

Comp.

NP Componente Preparación

R1

5 20 Portaobjetos de sustrato de HEp-2, 12 pocillos Conserve a +2-8 °C. Deje que alcance

la temperatura ambiente antes de usarlo. Utilice

tal como se suministra. 8 Portaobjetos de sustrato de HEp-2, 6 pocillos

• Sustrato de HEp-2 fijado sobre portaobjetos de vidrio

• Manipule los portaobjetos por los bordes. • No presione la superficie de la bolsa de papel

metalizado.

R2

1 4 1 30446 Conjugado FITC, 2,5 mL

• Antisuero antiinmunoglobulinas humanas conjugado con fluoresceína

• Albúmina de suero bovino al 1%

• Solución salina amortiguada con fosfato (pH ~ 7) • Conservante de azida sódica al 0,1%

Utilice tal como se suministra.

Conserve a +2-8 °C.

R3

1 2 1 30403 Medio de montaje, 2,5 mL

• Un medio de montaje amortiguado

semipermanente en una solución amortiguada Trizma, pH 7-8

• ≤ 7,5% de alcohol polivinílico • ≤ 20% de 1,2-propanediol

R4

2 4 2 31098 Solución salina amortiguada con fosfato (PBS), pH 7,3 ± 0,10, 11,34 g/frasco • Fosfato sódico dibásico

• Fosfato sódico monobásico • Cloruro sódico

• Estable en forma cristalina durante 24 meses a +2-8 °C o a temperatura ambiente (TA = 18-26 °C) Disuelva el contenido de un frasco en agua destilada hasta obtener un volumen final de un litro. Estable durante 3 meses a TA. R5

1 1 1 30431 Contratinción de azul de Evans, 2,5 mL • ≤ 2% de tinción de azul de Evans • Conservante de azida sódica al 0,1%

C0

1 2 1 Control negativo de Kallestad™, 0,5 mL

• Mezcla de suero humano normal • Albúmina de suero bovino al 1% • Conservante de azida sódica al 0,1%

C1

1 1 1 Control positivo homogéneo de Kallestad™,

0,5 mL

• Mezcla de suero humano con una actividad de autoanticuerpos específica

• Albúmina de suero bovino al 1% • Conservante de azida sódica al 0,1%

Diluya tal como se indica; consulte el informe de control de calidad para los

valores. Conserve a +2-8 °C. No corresponde 5 20 8 25090 25089

Papel secante para portaobjetos, 12 pocillos Papel secante para portaobjetos, 6 pocillos

Utilice tal como se suministra. No

corresponde

1 1 1 Mini-CD, Instrucciones de uso, productos IFA de Kallestad™

Utilice tal como se suministra. Una señal de posible deterioro en cualquiera de los reactivos es un cambio en la reactividad o en el patrón esperados, sedimentos en el frasco o un aspecto turbio, que indica proliferación bacteriana.