Tempo (min) A (%) B (%) Rota de fluxo (mL/min) 1 0,00 98,0 2,0 1 2 20,00 80,0 20,0 1 3 40,00 60,0 40,0 1 4 50,00 40,0 60,0 1 5 55,00 0 100,0 1 6 60,00 0 100,0 1
Método 2 - Comprimentos de onda (λ) utilizados: 208, 220, 230, 240, 250, 254, 280, 314 nanômentros (nm) e condição de injeção dos solventes:
Tempo (min) A (%) B (%) Rota de fluxo (mL/min) 1 0,00 70,0 30,0 1 2 15,00 1,0 99,0 1 3 35,00 1,0 99,0 1
4.1.2 Reagentes e solventes utilizados
Para as reações de modificação estrutural, utilizaram-se reagentes como borohidreto de sódio (NaBH4), hidrocloreto de semicarbazida (NH2CONHNH2·HCl) e cloreto de mesila (CH3SO2Cl), obtidos comercialmente de Sigma-Aldrich. Nos ensaios enzimáticos foram utilizados a enzima acetilcolinesterase (AChE) adquirida de Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany), assim como albumina de soro bovino, reagente colorimétrico ácido 5,5-ditiobis-2- nitrobenzóico (DTNB), iodeto de acetiltiocolina (ACTI) e fisostigmina (eserina). A enzima proliloligopeptidase (POP) foi cedida pelo grupo do prof. Ernest Giralt do Instituto de Pesquisa Biomédica de Barcelona (IRB-Espanha) e seu substrato, o ZGP-AMC (N-benziloxicarbonil- Gli-Pro-metilcumarina-7-amida) foi obtido pela Bachem (Bubendorf, Switzerland). Os solventes e demais reagentes utilizados durante o trabalho foram de nível técnico ou qualidade p.a (Tedia, Vetec e Sigma Aldrich) e quando necessário, purificados através de técnicas de destilação para a remoção de possíveis contaminantes e/ou umidade. Para as técnicas cromatográficas empregaram-se diversas misturas de solventes com polaridades variadas, sendo que estas são indicadas no decorrer do texto. Para as análises em Cromatografia Líquida
de Alta Eficiência (CLAE) foram utilizados solventes (HPLC/SPECTRO, ≥ 98%) obtidos de Tedia High Purity Solvents.
4.1.3 Equipamentos utilizados
4.1.3.1 Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (RMN)
Os espectros de RMN de 1H, 13C, uni e bidimensionais (DEPT-135, COSY, HSQC, HMBC e NOESY) foram obtidos através de técnica realizada em espectrômetro Bruker Avance III HD, operando a 400,13 MHz para 1H e 100,62 MHz para 13C, do Departamento de Química, da Universidade Federal de Santa Maria. As amostras foram preparadas utilizando-se quantidades entre 1,3-25mg dissolvidas em 0,5 mL de clorofórmio (CDCl3), acetona (C3D6O) ou metanol (CD3OD) deuterados em tubos de 5 mm. Os deslocamentos químicos (δ) foram registrados em “ppm” (partes por milhão) e as constantes de acoplamento (J) calculadas em Hertz (Hz). A calibração dos espectros foi realizada utilizando-se como referência interna o TMS (δ 0,00) para os espectros de RMN 1H e, CDCl
3 (δ 77,00), C3D6O (δ 30,83) ou CD3OD (δ 47,60) para os espectros de RMN 13C.
4.1.3.2 Espectrometria de Massa de Alta Resolução (EM-IES)
Os espectros de massa de alta resolução (EM-IES) foram obtidos em aparelho espectrômetro Xevo G2 Q-TOF (Waters), realizados no LAQIA-UFSM sob a responsabilidade do Prof. Dr. Érico M. M. Flores. Condições de análise: Temperatura da fonte de 150 ºC, temperatura de dessolvatação de 500 ºC, gás de dessolvatação nitrogênio, fluxo de gás no cone de 10 L/h, fluxo do gás de dessolvatação entre 500 e 600 L/h, tensão do capilar entre 2,0 e 2,5 kV, tensão do cone de amostragem 20-30 v e infusão 10-20 µL/min.
4.1.3.3 Aparelho de rotação óptica específica, Polarímetro
Para a realização das medidas de rotação óptica específica, utilizou-se o polarímetro Autopol I com comprimento de onda da lâmpada de 589 nm (Rudolph Research Analytical, USA) e solventes como clorofórmio, etanol ou metanol do NPPN - UFSM.
4.1.3.4 Aparelho de ponto de fusão
O ponto de fusão foi determinado em aparelho digital MQAPF - 302 com termômetro não aferido (Microquímica Equipamentos) do NPPN - UFSM.
4.1.3.5 Espectrômetro de difração de raios X
As medidas cristalográficas foram realizadas em Bruker X8 Kappa-Apex II CCD utilizando radiação de Mo Kα do Departamento de Química - UFSM.
4.1.3.6 Espectrofotômetro
As atividades biológicas de ensaios enzimáticos e antimicrobiano foram realizados em espectrofotômetros SpectraMax i3 e i3x com SoftMax Pro 6.3 (Molecular Devices Inc., USA) e baseando-se na medida do comprimento de onda de absorbância para AChE de 405 nm e fluorescência para a POP em 360 e 485 nm, enquanto que para o ensaio antimicrobiano a leitura foi realizada no comprimento de onda de 620 nm.
4.2 MATERIAL VEGETAL
4.2.1 Erythrina crista-galli
4.2.1.1 Coleta e identificação do material vegetal
As cascas do caule de E. crista-galli foram coletadas no mês de maio de 2013, no município de Santa Maria (29°53'57.76”S;53°43'48.94”O), Rio Grande do Sul. A identificação do material vegetal foi realizada pela Prof. Dra. Thaís Scotti Canto Dorow. Uma exsicata encontra-se depositada no Herbário da Universidade Federal de Santa Maria - UFSM, sob o n° SMDB 13931.
4.2.1.2 Preparação e fracionamento do extrato bruto
O material vegetal (cascas do caule) foi inicialmente submetido à secagem em estufa de ar circulante à temperatura de 50 °C. Após seco, o mesmo foi triturado em liquidificador Poli
LS-04 e moído a fino grão (1,30 kg) em moinho Marconi MA 048. Foi realizada uma extração à quente, onde o material moído foi colocado em um balão de 5 L acoplado a um sistema de refluxo com a adição de metanol até a total cobertura do mesmo, aproximadamente 3 L. Após cada etapa de 8 horas sob refluxo, o solvente foi retirado do balão por filtração e rotaevaporado, sendo adicionado ao material vegetal nova quantidade de metanol puro. Este procedimento foi repetido durante 30 dias, até a completa extração dos metabólitos, obtendo-se um resíduo escuro e viscoso, denominado Extrato Metanólico (E.MeOH; 173,93 g).
O E.MeOH (173,90 g) foi submetido a um fracionamento ácido/base, onde foi suspenso em água, acidificado com ácido clorídrico (HCl) 2M a pH próximo de 1,5, e extraído com éter etílico em funil de extração. O solvente foi removido por pressão reduzida, restando um resíduo marrom, denominado Fração Etérea Ácida (FEA). A solução aquosa remanescente foi alcalinizada com hidróxido de amônio (NH4OH) a pH 9,0, e extraída com éter etílico e acetato de etila. Após cada extração, rotaevaporou-se o solvente, obtendo-se as frações resultantes, Fração Etérea Básica (FEB; 3,77 g) e Fração Acetato Básica (FAB; 4,50 g), conforme o Esquema 5.
Esquema 5- Fracionamento do E.MeOH de E. crista-galli.
*quantidade de E.MeOH utilizado para fracionamento.
4.2.1.3 Cromatografia da Fração Etérea Básica (FEB)
A FEB (3,50 g) foi submetida a uma CC, utilizando-se como fase estacionária sílica gel 60 (176 g) e diclorometano/metanol (gradiente de polaridade) como fase móvel. As frações foram reunidas por semelhança, através de análises em CCD, conforme é demonstrado na Tabela 2.
Fração Etérea Ácida (FEA) Extrato Metanólico* (E.MeOH; 173,90 g) Cascas do caule secas e moídas (1,30 g) Fração Aquosa Fração Etérea Básica
(FEB; 3,77 g) Fração Aquosa
Fração Acetato Básica (FAB; 4,50 g) Fração Aquosa (FAQ) Metanol 1. H2O/HCl 2M 2. Éter etílico 1. NH4OH 2. Éter etílico Acetato de etila
Tabela 2- Coluna cromatográfica da FEB.
Frações FEB Solventes Peso (g)
I 1-16 Diclorometano 100% DCM/MeOH 5% 0,03 II 17-22 DCM/MeOH10% 2,2 III 23-35 DCM/MeOH 15% 0,08 IV 36-53 DCM/MeOH15% 0,56 V 54-86 DCM/MeOH 20% DCM/MeOH 30% 0,17 VI 87-104 DCM/MeOH 50% 0,09 VII 105-110 Metanol 100% 0,16 VIII 111-118 Metanol 100% 0,13
Das 8 frações obtidas, apenas II e IV foram priorizadas para isolamento, devido a