Concentração e Purificação das Proteínas do Soro 64

Três membranas foram testadas para utilização nos experimentos de concentração e purificação das proteínas do soro: a UF-7001, a UF-6001 e a UF-6002. A escolha da membrana depende da qualidade do fluxo permeado e das características de retenção, porque a membrana deve reter todas as proteínas e ser permeável à lactose e aos sais.

Membranas de ultrafiltração são comercializadas pela sua massa molar de corte (MMC), a qual é geralmente definida, como a massa molar do menor componente que será retido pela membrana com uma eficiência de 95 %. Assim uma membrana com MMC de 10.000 Da deve reter pelo menos 95 % das moléculas com esta massa molar. A massa molar de corte de uma membrana é normalmente determinada através de medidas de rejeição utilizando-se soluções homogêneas de solutos (por exemplo, polietilenoglicol – PEG ou dextranas) com massa molar variada e conhecida.

Para avaliar a retenção realizamos uma caracterização das membranas verificando a retenção da membrana para moléculas com massa molar conhecida (dextranas) e superior a MMC informada pelo fabricante. Passamos pelas membranas uma solução de 0,15 % ou 1,5 g/L de dextrana com massa molar de 15 a 20 kDa nas membranas UF-7001, UF-6001 e UF- 6002. A concentração de dextrana foi avaliada no permeado e no concentrado através do método fenol sulfúrico, e realizamos o cálculo de retenção da membrana através destes dados. A melhor membrana é aquela que apresentar 100 % ou a maior retenção possível para as moléculas de dextrana, que possuem massa molar similar a menor proteína de interesse neste trabalho (α-La, 14 kDa).

Após a escolha da melhor membrana iniciaram-se os testes de concentração e purificação das proteínas propriamente ditas. O primeiro passo foi realizar a compactação e medidas de fluxo de água em diversas pressões transmembrana.

A seguir, dissolveu-se soro em pó em água destilada, obtendo-se 30 L de solução de soro, conforme explicado na seção 3.1 Preparação do soro.

A solução de soro foi colocada no tanque de alimentação da unidade, e então foram realizados testes de permeação do efluente; estes testes foram realizados da mesma forma que os testes de permeação hidráulica, porém o fluido é o soro. O objetivo é analisar a influência da pressão no fluxo de permeado e verificar a existência ou não de um fluxo limite dentro do intervalo de pressões testado.

Os experimentos realizados na unidade piloto de UF foram efetuados em duas etapas distintas. A primeira etapa teve como objetivo concentrar as proteínas do soro de queijo através do processo de UF e a segunda etapa consiste em purificar estas proteínas usando a

DF. Para cada uma destas etapas foram obtidos concentrados com características diferentes, os quais possuem aplicações de acordo estas características.

A pressão transmembrana foi mantida em 2 bar e a vazão da corrente de alimentação do soro de queijo foi de aproximadamente 840 L.h-1_{, condições determinadas em trabalhos} anteriores (BOSCHI, 2006) e confirmadas neste trabalho. A temperatura do soro foi mantida

constante em 50 °C, tendo em vista a temperatura de saída do soro do processo de fabricação do queijo (~ 60 °C) e a temperatura máxima admissível para a membrana (~ 55 °C).

Nos primeiros dez minutos, o sistema operou em reciclo total, isto é, as correntes de permeado e concentrado retornavam para o tanque de alimentação, para homogeneizar a solução e para o sistema entrar em equilíbrio térmico: após, somente a corrente concentrada retornava ao tanque, e o permeado foi sendo recolhido até que se obtivesse a concentração desejada. Medidas diretas de fluxo permeado foram realizadas a cada 15 minutos. A cada meia hora de operação foram coletadas, simultaneamente, amostras das correntes de permeado e de concentrado em frascos de vidro âmbar. As análises feitas nas amostras foram: pH, condutividade elétrica, extrato seco total e as concentrações de lactose e de proteína.

Para a concentração das proteínas do soro de queijo o seguinte processo pode ser visualizado: o soro flui, sob pressão, através da membrana, a qual permite a passagem de água, sais e lactose, que irão constituir a solução chamada de permeado cujas partículas são de tamanho inferior aos poros da membrana; as proteínas são partículas de tamanho superior em relação aos outros constituintes mencionados do soro, logo, são retidos pela membrana e esta solução é denominada de concentrado. A Figura 3.5 apresenta, de forma esquematizada, o processo de concentração do soro por UF.

Figura 3.5: Representação esquemática do processo de UF.

A UF foi operada associada a DF que consiste em adicionar água durante o processo de concentração, para lavar os componentes de mais baixa massa molar (lactose e sais), e conseqüentemente aumentar a purificação do retido (proteínas), o mesmo volume de água que é adicionado na DF é retirado no permeado. A Figura 3.6 apresenta de forma esquematizada os processos de DF no concentrado da UF.

SORO Permeado Concentrado UF Legenda: Proteína Lactose Sais

Figura 3.6: Representação esquemática do processo de DF.

Quatro experimentos diferentes foram realizados para verificar quais condições permitiriam uma maior purificação das proteínas, os quais estão descritos a seguir.

Experimento 1 a solução inicial foi concentrada até um volume final de 6 L no tanque de alimentação (FC = 5); a seguir duas DF foram realizadas utilizando-se 6 L de água para cada uma (DF1 e DF2).

Experimento 2 a solução inicial foi concentrada até um volume final de 6 L no tanque de alimentação (FC = 5); a, seguir cinco DF foram realizadas: as duas primeiras ( DF1 e DF2) com 6 L cada e mais três (DF3, DF4 e DF5) com 3 L cada.

Experimento 3 a solução de soro foi concentrada até um volume final de 5 L (FC = 6); em seguida realizaram-se duas DF (DF1 e DF2) com 5 L de água para cada uma.

Experimento 4 a solução de soro foi concentrada até um volume final de 5 L (FC = 6). Em seguida realizaram-se quatro DF: a DF1 e a DF2 de 5 L e a DF4 e a DF5 de 2,5 L.

Vale ressaltar que entre a etapa de concentração e as DFs não foi realizado enxágüe nem limpeza da membrana, isto é, o processo foi contínuo. A Figura 3.7 traz o esquema geral das etapas de concentração e purificação das proteínas do soro realizadas neste trabalho.

Concentrado Protéico Purificado Permeado DF água Concentrado 1 +

Figura 3.7: Resumo esquemático das estratégias utilizadas para concentração e purificação das proteínas do soro.