Este projeto foi parte de um grande trabalho desenvolvido em nosso laboratório para o estudo do complexo de ativação do TR, permitindo o entendimento das bases moleculares de formação e atuação deste complexo.
Ao longo do desenvolvimento do projeto, foi possível aprimorar protocolos de
expressão e purificação das proteínas e complexos de forma a garantir amostras
mais estáveis e com menor número de contaminantes, o que permitiu a realização de ensaios biofísicos de melhor qualidade.
A ideia de montar o complexo por meio de cotransformação, seguida pela coexpressão e copurificação se mostrou muito eficiente e garantiu que a produção do complexo TR:GRIP fosse muito mais rápida e eficiente, além garantir que menos proteínas fossem perdidas ao longo do processo. Os benefícios deste protocolo foram tantos que, paralelamente, outros alunos do laboratório estão buscando, a elaboração de um protocolo de cotransformação para a produção do complexo TR:RXR:GRIP.
Conseguimos observar também por meio de ensaios de anisotropia em conjunto com outros ensaios de estabilidade térmica publicados em nosso artigo (Fattori et al, 2014, Mol. Endo) que a porção DBD é importante na estabilização do complexo. O ensaio de anisotropia, no qual verificamos a afinidade dos dímeros pela GRIP, nos mostrou que o 9C era capaz de diminuir a afinidade pela GRIP quando os dímeros continham apenas a porção LBD destas proteínas. Porém, construções completas foram eficientes em manter a afinidade entre as proteínas, mesmo na presença do 9C. Este resultado levantou a hipótese de que outras regiões dos receptores, além das regiões já conhecidas no LBD, podem estar interagindo com a GRIP. Muito provavelmente, as regiões de hinge e do DBD do RXR estejam interagindo com a GRIP, pois ao compararmos as afinidades das construções mais completas dos homodímeros de TR e do heterodímero pela GRIP, podemos notar que a presença do RXR faz com que haja um aumento na afinidade dos NRs pela GRIP.
Contudo, ao observamos os ensaios de ultracentrifugação analítica e o segundo ensaio de anisotropia de fluorescência, podemos notar que, embora o 9C possa desestabilizar o complexo e diminuir sua afinidade na construção LBD, a presença deste ligante não é capaz de romper a interação entre essas proteínas. No ensaio de ultracentrifugação analítica observamos que há a formação do complexo na construção
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LBD mesmo na presença do ligante 9C. É por meio do ensaio de ultracentrifugação analítica que pudemos observar também uma estequiometria de 2 moléculas de
receptor para uma molécula de coativador.
Os resultados obtidos nos ensaios de cross-linking seguido por
espectrometria de massas nos permitiu investigar um pouco das interações que
existem entre essas proteínas. Foram observadas algumas interações inespecíficas, como a que ocorre entre TR K288-RXR K380 e TR K288-RXR K381. Utilizando-se da estrutura já publicada do heterodímero TR:RXR LBD (Putcha, 2012) retirada do PDB (Protein Data Bank - http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do), pudemos verificar que estas regiões não são próximas para que houvesse esta interação. Isso pode ter ocorrido durante a etapa de cross-linking ou mesmo a qualidade da amostra não estava boa para a realização deste ensaio, gerando interações inespecíficas. Além disso, não foi possível a obtenção de resultados para construções mais completas, o que permitira uma melhor avaliação da estrutura deste complexo.
Este trabalho permitiu a discussão e elucidação de muitos aspectos da formação dos complexos, além de ajudar no entendimento da modulação deste por parte do
ligante ácido 9-cis retinóico.
Os ensaios para avaliar a ação do 9C no complexo nos mostraram que, além de não desestabilizar o heterodímero, ele é capaz de atuar de forma a facilitar o desligamento de correpressores. Alguns ensaios celulares foram realizados em paralelo a este projeto pela aluna de doutorado, Jéssica Lois, a fim de comprovar nossos resultados obtidos no ensaio de anisotropia, sobre o desligamento do peptídeo correpressor. Estes ensaios celulares mostraram que a ativação do heterodímero em DR4 é muito maior na quando há a presença dos dois ligantes, T3 e 9C. Outros ensaios celulares utilizando um mutante de TR (TR F451X), o qual permanece em constante estado de repressão, mesmo na presença de T3, mostraram que a adição do ligante 9C aumenta significativamente a ativação do heterodímero, muito provavelmente pelo desligamento do correpressor.
Um ponto muito importante deste trabalho foi compreender mais sobre o mecanismo de ação do 9C neste complexo. Constatamos que o heterodímero é permissivo a este ligante e que, embora ele não atue diretamente no recrutamento de coativadores, o 9C desempenha papel importante na ativação destas proteínas. Estes resultados permitiram a criação de um modelo de ativação desse complexo (Figura 25).
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Figura 25. Modelo proposto com base nos resultados obtidos neste trabalho, sobre a ação do 9C no
heterodímero de TR:RXR. Na parte correspondente a “ativação lenta”, está representado o modelo de ativação normal para o heterodímero TR:RXR que é descrito na literatura. Na parte seguinte, em “ativação rápida” está o modelo proposto para a ação do 9C, onde esse ligante é capaz de auxiliar no desligamento de correpressores, permitindo a chamada “pré-ativação”, tornando o processo de ativação mais ágil.
Esse modelo mostra uma forma de ativação mais rápida, baseada na ideia de que a ação do 9C auxilia no desligamento do correpressor, tornando esta etapa de “pré ativação” mais ágil.
Estudos futuros devem ser realizados para melhor compreensão do mecanismo de ativação deste complexo. A busca pela estrutura destes complexos ajudaria a compreender melhor a interação entre as proteínas do complexo, além de identificar as possíveis novas regiões de interação entre elas. A descoberta de novas interações entre essas proteínas pode abrir caminho para o desenvolvimento de novos fármacos que sejam capazes de modular essas proteínas ao interagir com estas regiões e, por exemplo, impedir a interação entre elas. Estudos celulares também são importantes para a continuação deste projeto. Compreender o contexto fisiológico de ativação deste complexo ajudaria elucidar mais detalhes e a confirmar o modelo proposto, sendo
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importante também a realização de ensaios celulares em diferentes linhagens para verificar se este mecanismo de ação se aplica a diferentes contextos.
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