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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
TÁBATA RENÉE DORATIOTO
FORMAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DOS COMPLEXOS FORMADOS ENTRE
RECEPTORES DE HORMÔNIOS TIREOIDIANOS E COATIVADORES.
FORMATION AND CHARACTERIZATION COMPLEX BETWEEN THYROID
HORMONE RECEPTORES AND COACTIVATOR
CAMPINAS
2016
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TÁBATA RENÉE DORATIOTO
FORMAÇÃO ECARACTERIZAÇÃO DOS COMPLEXOS FORMADOS ENTRE RECEPTORES DE HORMÔNIOS TIREOIDIANOS E COATIVADORES.
FORMATION AND CHARACTERIZATION COMPLEX BETWEEN THYROID HORMONE RECEPTORES AND COACTIVATOR
Dissertação apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do Título de Mestra em Biociências e Tecnologia de Produtos Bioativos na Área de Fármacos, Medicamentos e Insumos para Saúde.
Dissertation presented to the Institute of Biology of the University of Campinas in partial fulfillment of the requirements for the degree of Master in the Area of Drugs and Medical Supplies.
ESTE ARQUIVO DIGITAL CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA ALUNA TÁBATA RENÉE DORATIOTO E ORIENTADA PELA DRA. ANA CAROLINA MIGLIORINI FIGUEIRA
Orientadora: Dra. Ana Carolina Migliorini Figueira
Campinas 2016
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Campinas, 22 de fevereiro de 2016.
COMISSÃO EXAMINADORA
Prof.(a) Dr.(a). Ana Carolina Migliorini Figueira Prof.(a). Dr.(a) Sandra Martha Gomes Dias
Prof.(a) Dr(a). Fernanda Aparecida Heleno Batista
Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se encontra no processo de vida acadêmica do aluno.
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À memória do meu querido primo Rafael Lorencini Montagnoli. Você sempre será minha inspiração.
“Uma das coisas que aprendi é que se deve viver apesar de.”
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Agradecimentos
À minha orientadora Dra. Carol Figueira, por ter me aceitado em seu grupo e me mostrado o incrível mundo dos receptores nucleares.
Aos membros da banca; Dra. Sandra e Dra. Fernanda, por terem aceitado o convite e por toda contribuição na correção deste trabalho.
À Dra. Juliana Oliveira, pelo tempo dedicado na leitura deste trabalho e também sua colaboração com as correções.
À Dra. Juliana Fattori, que se tornou uma grande amiga, me ajudando nos momentos difíceis, mas também compartilhando da minha alegria nos momentos bons, dentro e fora do laboratório. Obrigada por tudo, de verdade.
Às minhas queridas molecas; Jéssica, Nathália, Aline, Scarlet, Albane, Taisa, e Natália, que me aguentaram todo esse tempo, nos dias bons e ruins. Obrigada por toda a ajuda, apoio e conversas sobre signos.
Aos meus queridos amigos; Luciano, Plínio, Pedro, Flávio e Leandro, por tornarem os momentos no laboratório mais alegres e felizes.
Ao meu amor João, por toda paciência, carinho e pelas inúmeras vezes em que foi me buscar mais de meia noite no laboratório. Obrigada por ouvir meus desabafos, minhas crises e sempre me animar nos momentos difíceis. Ter você ao meu lado fez tudo ficar mais fácil e feliz.
Aos meus amados pais, sem os quais eu não estaria aqui. Obrigada por tudo que fizeram por mim pra que eu tivesse tantas oportunidades. Vocês são meu orgulho e exemplo de vida. Vocês são meu tudo, eu amo vocês.
A todos que, de uma forma ou outra, estiveram comigo nessa longa caminhada. Meu mais sincero obrigado.
Ao CNPEM/LNBio, pelo espaço e toda infraestrutura disponibilizada para a realização deste trabalho. Em especial aos Laboratórios de Espectroscopia e Calorimetria (LEC) e Laboratório de Purificação de Proteínas (LPP) por todo apoio na realização deste trabalho.
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RESUMO
O hormônio tireoidiano regula diversas funções do sistema endócrino por meio da interação deste com seu receptor (receptor nuclear de hormônio tireoidiano – TR). Na presença de um ligante esse receptor sofre uma mudança conformacional que permite sua interação com proteínas coativadoras, como a GRIP (proteína de interação com o receptor de glucocorticóide - glucocorticoid receptor interacting protein). A associação do TR com coativadores auxilia na abertura da estrutura da cromatina, através do recrutamento de acetilases de histonas, resultando na ativação da transcrição de diversos genes, principalmente dos genes ligados à produção de proteínas que regulam o metabolismo basal. Este projeto teve como principal objetivo estudar a formação e a caracterização do complexo receptor nuclear com coativador para mapear possíveis interfaces de interação adicionais e entender melhor sua formação. Para isso foram realizados ensaios que possibilitaram avaliar a estequiometria dos complexos, a afinidade entre essas proteínas e também a influência dos ligantes desses receptores na formação dos complexos. Foram desenvolvidos os ensaios de purificação das proteínas e montagem dos complexos (por ensaios de pull down ou coexpressão). Ensaios de anisotropia de fluorescência possibilitaram a verificação da afinidade entre receptores nucleares (NRs) e a GRIP e do mecanismo de ação do ligante do RXR (Retinoid X Receptor) (ácido 9-cis retinóico – 9C) no complexo TR:RXR:GRIP. Além destes, também foram realizados outros experimentos de caracterização biofísica para avaliar a qualidade das amostras e a estabilidade da estrutura secundária das proteínas e complexos. Como principais resultados, obtivemos dados sobre a afinidade dos complexos e sua estabilidade, que nos mostraram que a presença de construções mais completas são importantes na sua estabilização. Através da anisotropia de fluorescência observamos que o 9C atua no complexo, auxiliando no desligando correpressores. É importante mencionar que este trabalho resultou no maior detalhamento do mecanismo de ativação do TR o que poderá fornecer subsídios, por exemplo, para o planejamento de fármacos.
PALAVRAS-CHAVE: Complexo NR-CoA; Receptor Nuclear; Receptor de Hormônio
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ABSTRACT
The thyroid hormone regulates many functions of the endocrine system through the interaction with its receptor (nuclear receptor thyroid hormone - TR). In the presence of its ligand, the receptor undergoes a conformational change that allows the interaction with coactivator proteins, as GRIP. The combination of TR with coactivators assists in opening the chromatin structure via the recruitment of histone acetylases. These results in the activation of transcription of many genes, particularly genes linked to the expression of proteins that regulate the basal metabolism. This project aimed to study the formation and characterization of nuclear receptor with coactivator complex to map possible additional interaction interfaces and to better understand their formation. We performed assays, which enabled us to evaluate the stoichiometry of the complex, the affinity between these proteins; and, also, the activity of the ligands of these receptors. We developed protocols for protein purification and formation of complex (as pull down-like and coexpression). Fluorescence anisotropy assays made possible to verify the affinity between TRs and GRIP, and also to study the mechanism of action of RXR ligand (9C) in the complex TR: RXR: GRIP. In addition, other biophysical characterization experiments were made to evaluate the quality of the samples and the stability of the secondary structure of proteins and complexes. The main results gave information of the affinity of the complexes and their stability, which showed that the presence of more complete constructions of these receptors are important in their stabilization. By fluorescence anisotropy we observed that the 9C operates in the complex helping to dissociate correpressores. It is worth to highlight that this research helped to get more detail about TR’s mechanism of action, which could be useful, for example, for drug design.
KEYWORDS: NR-CoA complex; Nuclear receptor; Thyroid hormone receptor; Retinoid X
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ÍNDICE
RESUMO ... 7
ABSTRACT ... 8
1. INTRODUÇÃO ... 11
1.1. Receptor de hormônio tireoidiano e seus ligantes naturais ... 14
1.2. TR e sua interação com o DNA ... 16
1.3. TR e sua interação com Receptor de Retinóide X... 17
1.4. TR e correguladores: a interação TR:GRIP ... 20
2. OBJETIVOS E JUSTIFICATIVA ... 23
3. MATERIAL E MÉTODOS ... 24
3.1. Expressão e purificação de proteínas ... 24
3.2. Expressão e purificação dos receptores nucleares TR e RXR e do coativador GRIP 25 3.3. Co-transformação e purificação por afinidade do complexo TR:GRIP ... 26
3.3.1. Purificação por exclusão molecular ... 27
3.4. Formação do heterodímero (LBD e DL) ... 27
3.5. Formação do complexo TR:RXR:GRIP (LBD e DL) ... 28
3.6. Caracterização biofísica básica ... 29
3.6.1. Dicroísmo circular (CD) ... 29
3.6.2. Espalhamento de luz dinâmico (DLS) ... 30
3.6.3. Eletroforese Nativa ... 30
3.7. Ultracentrifugação analítica ... 31
3.8. Anisotropia De Fluorescência ... 31
3.9. Ensaio de cross-linking ... 32
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 34
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4.2. Formação dos heterodímeros (LBD E DL). ... 35
4.3. Montagem dos complexos TR:RXR:GRIP (LBD E DL) ... 37
4.4. Montagem do complexo TR:GRIP ... 39
4.5. Caracterização Biofísica por Dicroísmo circular (CD) ... 42
4.6. Caracterização Biofísica por Espalhamento de luz dinâmico (DLS) ... 46
4.7. Caracterização Biofísica por Gel Nativo ... 48
4.8. Ultracentrifugação analítica ... 49
4.9. Anisotropia de Fluorescência ... 51
4.9.1. Afinidade TR:GRIP e TR:RXR:GRIP ... 51
4.9.2. Atuação do 9C no complexo TR:RXR:CoA ... 53
4.10. Espectrometria de MASSAS ... 57
5. CONCLUSÃO E PERSPECTIVAS ... 63
6. PROJETO DE COLABORAÇÃO EM ADAMENTO ... 67
7. TRABALHOS APRESENTADOS ... 68
8. REFERÊNCIAS ... 71
9. ANEXOS ... 78
9.1. Anexo 1 ... 78
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1. INTRODUÇÃO
Os receptores nucleares (NRs) são uma classe formada por 48 proteínas encontradas em células animais que tem como principal função a transcrição de genes alvo. Dessa forma, os receptores estão diretamente relacionados a diversos processos fisiológicos como, por exemplo, homeostase, metabolismo e desenvolvimento celular. Sua ação na transcrição normalmente ocorre de maneira dependente de um ligante específico, que pode ser hormônios, vitaminas e também pequenas moléculas lipofílicas (Robinson-Rechavi, 2003; Moras, 1998; Aranda e Pascual, 2001).
Já foram identificados para alguns dos receptores nucleares, ligantes naturais e sintéticos capazes de interagir com essas proteínas, porém, ainda existem alguns receptores que são chamados receptores órfãos, para os quais não foi identificado um ligante específico (Robinson-Rechavi, 2003; Moras, 1998; Burris 2013).
De maneira geral, os NRs são muito semelhantes quanto a sua estrutura (Figura 1), os quais se organizam em domínios que agem de forma similar para a maioria das proteínas dessa classe (Aranda e Pascual, 2001; Yen, 2001; Laudet e Gronemeyer, 1995; Bourguet, 2000). O domínio N-terminal, também chamado domínio A/B, é o menos conservado entre os NRs, apresentando diferenças até mesmo entre isoformas de um mesmo receptor (Aranda e Pascual, 2001). É nesta região que fica contida a função de ativação 1 (AF-1), que permite a transcrição basal de genes independente de ligante (Tsai M e O’Malley, 1994).
Em seguida, está o domínio C de ligação ao DNA, comumente chamado de DBD (DNA Binding Domain). Em contraposição à região A/B, este domínio apresenta o maior nível de conservação entre os receptores e tem como principal função o reconhecimento e interação com sequências específicas de DNA. No DBD estão contidos dois motivos estruturais conhecidos como “dedos de zinco” sendo o primeiro relacionado ao reconhecimento e interação com DNA, enquanto o segundo está envolvido na dimerização (Aranda e Pascual, 2001).
O domínio D, ou hinge (dobradiça), é uma região que une o DBD ao domínio de ligação ao ligante (LBD - Ligand Binding Domain), permitindo uma maior mobilidade
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entre esses domínios. Nesta região está contido o sinal de localização nuclear, que direciona o receptor para o núcleo da célula (Aranda e Pascual, 2001; Barra, 2004). Esta região também pode ser alvo de modificações pós-traducionais que regulam o recrutamento de correguladores (Aranda e Pascual, 2001).
A região chamada LBD apresenta diversas funções distintas que vão além da interação com o ligante. É neste domínio que estão contidas as regiões de interação com correguladores e interfaces de dimerização. Embora não seja o domínio mais conservado entre as diversas proteínas da classe dos NRs, o LBD possui uma estrutura básica formada por 12 hélices (numeradas de H1 a H12), sendo que no C-terminal da H12 está localizada a função de ativação 2 (AF-2), responsável pela transcrição de genes de forma dependente de ligante (Moras e Gronemeyer, 1998; Aranda e Pascual, 2001; Brélivet,). Alguns NRs apresentam ainda um quinto domínio chamado de região F, com estrutura muito variável e sem função definida (Robinson-Rechavi, 2003).
Figura 1. Representação geral da estrutura dos receptores nucleares composta por: uma região N-
terminal contendo a função de ativação 1; um domínio de ligação ao DNA (DBD), onde ocorre o reconhecimento e a interação com o DNA, bem como a interação com outros receptores nucleares; a região hinge contendo o sinal de localização nuclear; o domínio de ligação ao ligante (LBD) onde se localiza o sitio de interação com ligante, além de regiões de interação com moléculas correguladoras e outros receptores nucleares (é também a região onde se localiza a função de ativação 2).
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Além de sua estrutura, o mecanismo clássico de ação destes receptores, de maneira geral, é muito semelhante (Figura 2). Na ausência de seu ligante especifico, essas proteínas se encontram associadas a proteínas correpressoras que recrutam complexos proteicos que contêm desacetilases de histonas, HDAC (histone deacetylases), resultando na repressão gênica (Gronemeyer, 2004). Após a ligação do ligante, os receptores sofrem mudanças conformacionais que permite o desligamento dos correpressores, ao mesmo tempo em que cria uma superfície para a interação de proteínas coativadoras. Os coativadores por sua vez, atuam no recrutamento de complexos HAT (histone acetyl-transferase) que descondensam a cromatina pela acetilação de histonas para que, posteriormente, a maquinaria de transcrição possa iniciar a transcrição de genes alvos (Bourguet, 2000; Nagy, 2004; Sonoda, 2008).
Figura 2. Esquema simplificado do mecanismo de ação dos receptores nucleares. Em a) observamos os
receptores sem ligante, interagindo com o correpressor, resultando na repressão gênica. Na figura b) com a chegada do ligante, o receptor sofre mudanças conformacionais permitindo o desligamento do correpressor e criando novas interfaces para a interação com moléculas coativadoras. Por fim, em c) esta representado a interação dos receptores com um coativador, permitindo a transcrição dos genes.
Além do mecanismo clássico, os receptores também podem regular a transcrição e a repressão de genes de outras maneiras. Como exemplo, os chamados elementos responsivos negativos, são sequencias nas quais o receptor é capaz de se ligar e regular, de maneira negativa, a transcrição de genes, mesmo na presença de seu ligante. O TR é um desses receptores capazes de se ligar aos elementos responsivos negativos, os quais apresentam maior afinidade pelo homodímero de TR. Por outro lado, na presença do
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ligante, há uma preferência de ligação deste receptor na forma de heterodímeros com o receptor de retinóide X a este elemento (Aranda e Pascual, 2001). Além disso, ainda existem outros mecanismos de ação, como a transativação e a transrepressão. Nesses casos, os receptores interagem com outros fatores de transcrição, como por exemplo, a proteína GATA. Estudos mostraram que o TR é capaz de interagir com essa proteína para regular negativamente a expressão do gene TSH (Figueira, 2010).
1.1. Receptor de hormônio tireoidiano e seus ligantes naturais
No organismo humano são encontradas duas isoformas do TR: TRα e TRβ, as quais são codificadas por genes presentes nos cromossomos 17 e 3, respectivamente (Yen, 2001); dos quais, por processamento alternativo do RNA, se formam diferentes isotipos: TRα1, TRα2, TRβ1 e TRβ2 (Nagy, 2004). A expressão de cada isotipo de TR ocorre de forma diferente nos tecidos do organismo humano. O TRα1 é mais expresso em tecido cardíaco, músculo esquelético e gordura marrom enquanto TRα2 é mais expresso no cérebro. O TRβ1 é abundante no fígado, no rim e no cérebro (Barra, 2004). Já a expressão do TRβ2 ocorre principalmente no cérebro e na glândula pituitária, regulando, de forma negativa, a produção dos hormônios tireoidianos (Barra, 2004; Yen, 2001).Dentre os isotipos citados, o TRα2 difere do isotipo TRα1 em sua região C- terminal, o que impede sua interação com seu ligante. Dessa forma, acredita-se que esta isoforma impede a transcrição por parte das demais isoformas, pois compete pela ligação ao DNA e também compete pela dimerização com RXR (Barra, 2004).
Como citado, muitas das ações mediadas pelos TRs ocorrem pela interação destas proteínas com um ligante específico (Moras e Gronemeyer, 1998; Aranda e Pascual, 2001; Robinson-Rechavi, 2003), no caso, seus ligantes naturais: tetraiodotironina ou tiroxina (T4) e triiodotironina (T3) (Yen, 2001; Figueira, 2006) (Figura 3).
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Figura 3. Figura das fórmulas químicas do ligantes (a) tiroxina e (b) triiodotironina, os quais são ligantes
naturais do receptor de hormônio tireoidiano.
Esses hormônios são produzidos na glândula tireoidiana e vão atuar nos mais diversos tecidos do organismo, desempenhando funções importantes principalmente no metabolismo basal, mas também no controle da atividade enzimática, absorção de glicose, aumento da ação da insulina e metabolismo de lipídeos (Oppeneimer e Samuels, 1983; Setian, 2007).
A maior parte do hormônio produzido pela glândula pituitária é secretado na forma de T4, embora também seja produzido uma menor quantidade de T3. No contexto celular, essa proporção é invertida uma vez que ao entrar na célula, grande parte do T4 é convertido em T3 (Basset, 2003;Sandler, 2004). Dessa forma o T4 é considerado como um pré-hormônio para a formação do T3 (Sonoda, 2008; Cardoso, 2014; Gao, 2014). Embora o T3 se ligue com maior afinidade ao TR (Gao, 2014; Surks, 1977), o T4 também o faz, porém de maneira menos estável (Sandler, 2004; Gao, 2014).
Diferentes patologias podem estar relacionadas a distúrbios causados pelos hormônios tireoidianos como, por exemplo, hipotireoidismo, hipertireoidismo, doença de Graves, cretinismo, cardiopatias e, até mesmo, obesidade e variações nos níveis de colesterol (http://www.endocrino.org.br. Acesso em: dezembro, 2015; Duntas, 2002; Klein, 2007).
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Cerca de 15% da população brasileira acima de 45 anos apresenta algum problema relacionado à tireoide, segundo dados do Instituto da Tiroide. Essa porcentagem se torna maior entre as mulheres que, além do processo natural de envelhecimento da glândula tireoidiana, também podem apresentar problemas desencadeados pela gravidez (http://www.indatir.org.br Acesso em: dezembro, 2015). Apesar disso, as doenças ligadas à tireoide não são exclusivas às pessoas mais velhas, podendo acometer jovens, crianças e pessoas de todas as idades, independente do sexo (http://www.endocrino.org.br Acesso em: dezembro, 2015).
1.2. TR e sua interação com o DNA
Para que os receptores possam atuar na transcrição de genes, eles necessitam reconhecer e interagir com o DNA. Isso ocorre em regiões específicas do DNA, chamadas de elemento responsivo ao hormônio (HRE), que se trata de uma sequencia de 6 pares de base, podendo ser AGAACA para alguns receptores esteroidais, como o Receptor de Glucocorticóide (GR) e o Receptor de Estrógeno (ER). No caso do TR, estes HREs são caracterizados por uma sequência AGGTCA (Aranda e Pascual, 2001).
Na ausência de seu ligante, o TR é capaz de se ligar ao DNA na forma de monômeros e homodímeros, mas a presença de T3 induz a formação de heterodímeros com RXR. Na forma de homodímero o TR pode regular a expressão de genes de maneira negativa, reprimindo a transcrição, ou de forma positiva, onde se liga preferencialmente ao HRE organizado na forma de palíndromo invertido. Porém, o TR atua majoritariamente na forma de heterodímeros com o RXR, ligando-se ao DNA, principalmente, em repetições diretas separadas por 4 nucleotídeos (DR4) (Laudet e Gronemeyer, 1995; Chen, 2010; Ikeda, 1994; Lazar, 1991; Williams, 1994; Piedrafita, 1995; Brent, 1995; Ribeiro, 1992; Brendik, 1995; Lee, 2005) (Figura 5).
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Figura 5. Esquema da organização dos elementos responsivos ao hormônio (HREs) os quais o TR é capaz
de reconhecer e interagir. Em cada um dos casos é possível que as sequências AGGTCA sejam separadas por até 6 pares de base, no caso dos palíndromos e de 1-5 pares de bases no caso das repetições diretas.
1.3. TR e sua interação com Receptor de Retinóide X
Sabe-se que o TR pode atuar em contexto celular na sua forma monomérica (uma molécula de TR), em sua forma homodimérica (duas moléculas de TR) ou formando heterodímeros com outros receptores nucleares (Decherf, 2013; Lazar, 1991), tais como receptores de ácido retinóico (RAR), receptor ativador da proliferação de peroxissomos (PPAR), receptor de vitamina D e os fatores de transcrição do promotor de ovalbumina de galinha (COUP-TF) (Bogazzi, 1994; Cooney, 1992; Lucas, 1991; Schrader, 1994; Tini, 1994; Yen, 1992). Porém pouco se sabe sobre o mecanismo de ação que envolve tais heterodímeros (Yen, 2001).
O heterodímero de TR mais estudado é aquele formado com o receptor de retinóide X (RXR), o qual é encontrado em três isoformas diferentes no organismo humano, sendo estas: RXRα, RXRβ e RXRγ. Este receptor está envolvido em diversos processos, sendo relacionado ao crescimento celular, homeostase, desenvolvimento e metabolismo (Ghosh et al, 2002).
O RXR é capaz de formar homodímeros (duas moléculas de RXR) para regular a transcrição de genes alvo, mas também é descrito como o parceiro de heterodimerização de diversos outros receptores, como o receptor de ácido all trans retinóico (RAR), receptor de hormônio tireoidiano (TR), receptor de vitamina D (VDR) e com o receptor ativador de proliferação de peroxissomos (PPAR), sendo considerado um parceiro promíscuo (Laudet e Gronemeyer, 1995; Ghosh et al, 2002). Na ausência de seu ligante, a região AF-2 do RXR se encontra interagindo com a região de ligação do coativador de um
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monômero de RXR próximo (Ghosh et al, 2002). Porém, a presença do 9C induz a ligação de homodímeros de RXR em DR1 (Repretições Diretas espaçadas por 1 nucleotídeo) (Laudet e Gronemeyer, 1995).
Quando descrito pela primeira vez, o RXR foi considerado um receptor órfão, porém foi visto que determinadas doses do ligante ácido retinóico (RA) eram capazes de ativar o RXR. Posteriormente, foi visto que o ácido 9-cis retinóico (9C) é o ligante natural deste receptor (Rosen et al, 1992). O 9C também é capaz de atuar na ativação de alguns heterodímeros formados pelo RXR (Figura 4).
Existem 3 casos possíveis em se tratando de permissividade ao 9C. Um primeiro caso seria de um heterodímero permissivo, ou seja, apenas o 9C seria capaz de ativar o heterodímero, mas a presença do ligante do receptor parceiro do RXR juntamente ao 9C atuariam de forma sinérgica, aumentando a ativação. Esse é o caso do heterodímero de PPAR com RXR (Figura 4a). Um segundo caso seria de permissividade condicional. Assim como o nome sugere, existe uma condição para que o 9C atue no heterodímero. Este é o caso do heterodímero de RAR com RXR, em que o 9C sozinho não é capaz de ativar o heterodímero, mas sua atuação conjunta ao ácido retinóico (ligante do RAR) é capar de aumentar a transcrição (Figura 4b). O terceiro caso trata da não permissividade ao 9C, como no caso do VDR (receptor de vitamina D) e o RXR. Neste heterodímero o 9C não é capaz de ativar a transcrição sozinho e também não altera a ativação por parte da vitamina D (Figura 4c) (Aranda e Pascual, 2011).
Entretanto, alguns heterodímeros são considerados exceção a esta rega, como no caso do heterodímero TR:RXR, que foi descrito como não responsivo ao 9C (Valerie, 2003; Zhang, 1992). Neste caso, apenas o ligante do TR seria capaz de ativar a transcrição (Aranda e Pascual, 2001).
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Figura 4. Esquema representando a permissividade ao 9C de alguns heterodímeros formados com o RXR.
a) Para o heterodímero formado entre RXR e PPAR, o 9C é capaz de se ligar ao RXR e promover a transcrição gênica, mesmo na ausência de um ligante que ative o PPAR. Contudo, a ação dos ligantes deste heterodímero é capaz de aumentar a transcrição. b) O heterodímero formado entre o Receptor de Ácido Retinóico(RAR) e RXR representam um caso de permissividade condicional ao 9C, visto que este ligante é incapaz de ativar a transcrição sozinho. Porém, o 9C é capaz de se ligar ao RXR após a ligação do ácido all
trans retinóico se ligar ao RAR, e melhorar a ativação da transcrição gênica. c) O heterodímero formado
entre o receptor de vitamina D (VDR) e o RXR é um exemplo de heterodímero não permissivo ao 9C, uma vez que o 9C não é capaz de ativar o heterodímero e não altera a ativação deste na presença da vitamina D, ligante do VDR.
Alguns estudos mostraram que o 9C pode apresentar alguns efeitos sobre o heterodímero TR:RXR, induzindo a dissociação de moléculas correpressoras e, assim, regulando a repressão de genes (Shi et al, 1997; Li et al, 2004). Outro estudo mostrou, por meio de ensaios de calorimetria, que o 9C pode atuar na atividade do TR:RXR, diminuindo a afinidade deste pelo coativador (Putcha et al, 2009).
Segundo Rosen et al (1992), foi possível observar que HREs (Elementos Responsivos ao Hormônio) que funcionam fisiologicamente de forma similar na presença do TR, podem apresentar um comportamento diferente na presença do RXR
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e/ou do 9C. Os resultados desse estudo mostraram que o RXR, na ausência do 9C, pode heterodimerizar com o TR e melhorar a ativação de determinados genes pelo T3. Outros genes, porém, apresentaram uma melhor resposta ao T3 quando havia a presença do RXR e do 9C na célula.
Por outro lado, sabe-se que o contexto celular é muito importante quando se trata da permissividade do heterodímero ao 9C, visto que a presença deste ligante em certas linhagens celulares resultou em um aumento no recrutamento de coativadores (Castillo
et al, 2004).
1.4. TR e correguladores: a interação TR:GRIP
Além de sua interação com outros receptores e o DNA, o TR é capaz de interagir com outras proteínas como chaperonas, correpressores e coativadores (Moras e Gronemeyer, 1988; Darimont, 1998). Proteínas coativadoras interagem com os receptores nucleares para permitir a transcrição de genes, enquanto os correpressores são responsáveis pela repressão e/ou controle da ativação dos receptores nucleares, sem necessariamente afetar a transcrição basal regulada por eles (McKenna, 1999).
O TR pode estar ligado ao DNA mesmo na ausência de seu ligante, agindo de maneira a reprimir a transcrição. Neste caso, o TR está associado a outras proteínas correpressoras como, por exemplo, o NCoR (Nuclear Receptor Correpressor) e o SMRT (Silencing Mediator of Retinoid and Thyroid Hormone Receptor) (Xu, 1999). A função destas proteínas é recrutar desacetilases de histonas que, por sua vez, vão manter a cromatina condensada, impedindo a ação da maquinaria de transcrição (Hu, 1999; Rosenfeld, 2001).
A proteína SMRT apresenta dois domínios de interação (ID1 e ID2) com o TR. Esses regiões são formados por um motivo consenso LxxxI/LxxxI/L (onde L é uma Leucina, I é uma Isoleucina e x representa um aminoácido qualquer) (Gosh, 2002). Quanto ao TR, estudos mostram que as hélices H1, H3 e H5 estão envolvidas na interação com estes correpressores (Basset, 2003; Horlein, 1995; Chen, 1995).
A ligação do T3 no TR induz uma mudança conformacional que dissocia o correpressor e cria uma superfície que permite a interação com moléculas coativadoras
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(Basset, 2003; Xu, 1999). Essas proteínas vão mediar a interação dos NRs com a maquinaria de transcrição (Aranda e Pascual, 2001).
Um exemplo de coativador que interage com o TR é a GRIP (proteína de interação com o receptor de glucocorticóide - glucocorticoid receptor interacting protein), pertencente à classe de coativadores de receptores esteroidais (Mukherjee, 2006). Ela é uma proteína de cerca de 160 kDa, e, assim como os demais coativadores da família p160, apresenta em sua estrutura uma interface de interação com NRs formado por três segmentos de α-hélice com uma sequência de aminoácidos LxxLL (onde L é uma leucina e x é um aminoácido qualquer). Além disso, a GRIP possui dois domínios de ativação (denominados AD1 e AD2, respectivamente) em sua região C-terminal, responsáveis por recrutar coativadores secundários que vão atuar no desenovelamento da cromatina, permitindo a atividade da maquinaria de transcrição. Por fim, também apresenta o domínio basic-helix-loop-helix/Per-Arnt-Sim (bHLH-PAS), localizado na região N- terminal das proteínas da família p160, atuando principalmente como um terceiro domínio de ativação (denominado AD3) e recrutando um coativador secundário, diferente dos demais domínios de ativação, chamado CoCoA (coiled-coil coactivator). Este último atua mediando a ativação da transcrição de alguns genes (Darimont, 1998;
Kim, 2003) (Figura 6).
Figura 6. Representação da estrutura da proteína GRIP, contendo os diversos domínios que atuam no
recrutamento de outras proteínas que auxiliam no desenovelamento da cromatina bem como proteínas da maquinaria de transcrição que auxiliam na transcrição de genes alvo.
Estudos mostram que a interação entre coativadores (CoA) e NRs ocorre entre o motivo LXXLL dos coativadores e as hélices H3, H4, H5 e H12 da região LBD dos NRs
(Brélivet, 2012; O’Malley, 2012). Porém, um trabalho realizado com construções maiores
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de interação entre essas proteínas. Pesquisas com foco na interação entre TR:GRIP mostraram que essa interação pode ser explorada como um alvo para o desenvolvimento de novos fármacos, principalmente no tratamento de casos de hipertireoidismo. A perspectiva é que substâncias possam impedir a formação desse complexo, evitando, assim, a ativação da transcrição de genes-alvos (Van Beeren, 2000).
Outro exemplo de coativador que interage com o TR são os complexos denominados TRAPs (TR-associated proteins) (Basset, 2003; Rosenfeld, 2001; Moeller, 2006). A existência desse segundo grupo de proteínas mostra que a transcrição dos genes pode ser muito mais complexa que o simples modelo proposto para ação dos receptores nucleares. Isso porque, assim como demais coativadores, os complexos TRAP interagem com a mesma região do receptor nuclear, e, devido a isso, ambas as classes de coativadores não podem agir simultaneamente. Dessa forma, o processo de transcrição ocorre em duas etapas, uma primeira onde um coativador da família p160 interagiria com o TR recrutando HATs que vão abrir a cromatina para que, então, complexos TRAP atuem na transcrição do gene (Basset, 2003; Xu, 1999).
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2. OBJETIVOS E JUSTIFICATIVA
No contexto descrito, o presente projeto se propõe a estudar a formação de complexos do TR e TR:RXR com o coativador GRIP, visando um melhor entendimento de suas bases moleculares e de sua atuação na ativação de genes-alvo. É importante mencionar que, até o momento, os estudos de interação entre estas três proteínas se restringem à utilização somente de peptídeos contendo os RIDs (domínio de interação com receptor) enovelados da GRIP e construções contendo apenas o LBD dos receptores. Desta forma, este trabalho é o primeiro a utilizar construções mais completas do coativador e do TR (Vide item 3.1), na intenção de estudar e mapear as interfaces de interação com os receptores e sua modulação.
O principal objetivo deste trabalho é a obtenção de complexos formados entre receptores nucleares e coativadores, além de sua posterior caracterização por meio do uso de técnicas de biologia estrutural e biofísica. Para tanto, tornou-se necessário realizar os seguintes objetivos específicos:
- expressar e purificar as proteínas TR, RXR e GRIP, em diferentes construções e em quantidade e qualidade adequadas;
- padronizar uma metodologia para a formação do complexo TR:RXR-GRIP, através de purificações e experimentos de montagem de complexos e coexpressões;
- caracterizar as afinidades do TR e TR:RXR por coativador
- estudo da modulação dos ligantes no recrutamento de coativadores, avaliação da permissividade ao 9C;
- avaliar a participação dos domínios DBD e LBD na formação dos complexos; -estudar a estequiometria dos complexos por meio de ensaios de ultracentrifugação analítica;
- realizar ensaios de crosslinking seguido por espectrometria de massas para mapeamento das interfaces de interação;
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3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Expressão e purificação de proteínas
Para expressão e purificação das proteínas foram utilizados protocolos pré- estabelecidos no Laboratório da Dra. Ana Carolina Migliorini Figueira. Os vetores contendo os insertos das proteínas a serem expressas e purificadas também estavam disponíveis no laboratório (Figura 7; Tabela I).
Foram trabalhadas duas construções principais das proteínas TR e RXR, sendo uma menor contendo apenas o domínio de ligação ao ligante (LBD), bem como uma segunda construção maior, contendo ambos os principais domínios dessas proteínas: o domínio de ligação ao DNA (DBD) e também o LBD (Figura 7).
Figura 7. Representação das construções expressas no decorrer do projeto. Receptores nucleares (a) TR e
RXR : construção DL contendo as regiões DBD(domínio de ligação ao DNA) e LBD (domínio de ligação ao ligante), e construção LBD contendo somente o domínio de ligação ao ligante; e da proteína GRIP (b) contendo as três regiões de interação com receptores nucleares.
Na Figura 7 estão ilustradas as construções utilizadas neste trabalho. Os vetores e as características que estes conferem à produção das proteínas bem como outras informações importantes para o entendimento das etapas de produção das proteínas, foram reunidos na Tabela I.
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Tabela I. Listagem das proteínas nas construções utilizadas, os vetores nos quais estão inseridos e caudas fusionadas utilizadas na purificação de cada proteína. Na tabela estão indicados, para cada construção utilizada, o nome técnico de cada proteína bem como o número de aminoácidos que as compõe.
Construção Nome utilizado
neste trabalho Vetor Tag MW (kDa)
hTRβΔABC
(aa 202-461) TR LBD pET28a(+) Histidina 31,5
hTRβΔAB
(aa 102-461) TR DL pET28a(+) Histidina 43,4
hRXRαΔABC
(aa 225-462) RXR LBD pET17a Histidina 30,8
hRXRαΔAB
(aa 126-462) RXR DL pET28a(+) Histidina 40,3
mGRIP (aa 564-767)
GRIP (3
motivos LxxLL) pGEX-2T Histidina, GST
22,5(GRIP) + 25(GST) = 47,5
3.2. Expressão e purificação dos receptores nucleares TR e RXR e do coativador GRIP
Os vetores que codificam para as proteínas TR (LBD e DL), RXR (LBD e DL) e GRIP foram transformados em bactéria Escherichia coli, linhagem BL21 (DE3), cultivadas em meio de cultura Luria-Bertani (LB) com o respectivo antibiótico. Para as construções DL foi utilizado 5 mM de solução de ZnCl2 (necessário para manter o DBD estruturado, devido existência dos “dedos de zinco”). A expressão das proteínas foi induzida utilizando-se 1 mM de IPTG.
O isolamento das bactérias foi feito por meio centrifugação (7000 rpm, a 4°C por 15-20 minutos) de forma a se obter um pellet bacteriano. Esse pellet foi ressuspendido em tampão de lise (Hepes 20 mM pH 8, NaCl 300 mM, 5% de glicerol) contendo 20 mM de β-mercaptoetanol e 100µM de PMSF. Para a lise das células, foi necessária a adição de 100 μg de lisozima para cada litro de expressão e, em seguida, foi realizada sonicação em
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banho de gelo. Após a lise, a suspensão foi centrifugada para separação das porções solúvel (sobrenadante) e insolúvel (pellet).
Todas as proteínas, incluindo a GRIP, apresentam uma cauda de histidina, dessa forma a purificação das proteínas foi feita por afinidade por meio da incubação da resina Talon (Clontech) previamente ativada com um tampão de equilíbrio (Hepes 20 mM, pH 8, NaCl 300 mM, 5% de glicerol, imidazol 5 mM, β-mercaptoetanol 20 mM), com o sobrenadante da lise, contendo a proteína impura e solúvel durante 90 minutos. A suspensão foi transferida para uma coluna plástica e lavada com tampão de equilíbrio. As proteínas foram eluídas com tampão de eluição (Hepes 20 mM, pH 8, NaCl 300 mM, glicerol a 5%, imidazol 300 mM, β-mercaptoetanol 2 mM); congeladas em nitrogênio liquido e armazenadas a 80 °C. Todo o processo de purificação foi realizado a 4°C.
A concentração das proteínas foi verificada analisando-se a absorbância no espectrofotômetro a 280 nm utilizando-se a massa molecular e o coeficiente de extinção molar de cada proteína. Quando necessário, as proteínas foram concentradas por centrifugação em concentrador AMICON, sendo que o tampão também pode ser trocado durante este processo. Após a purificação, quando necessário, as proteínas foram clivadas utilizando-se 1 unidade (U) de trombina por 0,5 mg de proteína, para que houvesse a remoção das caudas de histidina e da GST. A expressão, purificação e clivagem das proteínas foram analisadas em eletroforese de SDS-PAGE 15%.
3.3. Co-transformação e purificação por afinidade do complexo TR:GRIP Além da expressão e purificação das proteínas GRIP e TR de forma isolada, foi realizada uma co-expressão dessas proteínas com a finalidade de se obter o complexo TR:GRIP (LBD ou DL) já montados. Para este experimento, os vetores contendo o inserto que codifica para as proteínas TR (LBD e DL) e GRIP foram co-transformados em bactérias Escherichia coli, cepa BL21 (DE3). A expressão foi realizada conforme descrito no item anterior, de maneira semelhante a das proteínas sozinhas. Após a co-expressão das duas proteínas, foi adicionado T3 ao lisado, para que o complexo TR:GRIP se formasse. A purificação foi realizada por afinidade utilizando resina de cobalto, seguindo-se o protocolo já descrito anteriormente.
Após o processo de purificação por afinidade utilizando-se a resina de cobalto, o complexo TR:GRIP foi concentrado e clivado com trombina para remoção de caudas de histidina e fusão com GST (1U/0,5 mg de proteína), por cerca de 16h a 4°C. Para a
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separação das caudas GST e histidina clivadas, foi realizado uma etapa de purificação a mais, onde foi utilizado o ensaio de filtração em gel cujo o procedimento é detalhado na seção 3.3.1.
A concentração dos complexos foi verificada analisando-se a absorbância no espectrofotômetro a 280 nm utilizando-se a soma da massa molecular e o coeficiente de extinção molar de cada proteína. Quando necessário, os complexos foram concentrados por centrifugação em concentrador AMICON, sendo que o tampão também foi trocado durante este processo. A expressão e purificação destes complexos foram analisadas por eletroforese de SDS-PAGE 15% de acrilamida.
3.3.1. Purificação por exclusão molecular
Como descrito anteriormente, foi realizada a clivagem do complexo TR:GRIP (LBD e DL) após a copurificação em resina de cobalto. Dessa forma foi necessário realizar uma segunda etapa de purificação deste complexo para que a cauda GST fosse retirada desta amostra.
Para isso, foi realizada uma etapa de filtração em gel, com o exclusivo intuito de tornar mais pura a amostra de complexo. A gel filtração foi realizada utilizando-se uma coluna Superdex 200 (16/600), previamente equilibrada com 1 volume de coluna (CV) de tampão contendo 20 mM Hepes, pH 8.0, 200 mM NaCl e 5 % glicerol. Foram injetados 500 μl de proteína em concentração de 10mg/ml na coluna de gel filtração, em um fluxo de 0,3mL/min seguido de eluição isocrática com 1,2 CV. Todo o processo foi realizado a 4 °C. As amostras foram armazenadas em gelo assim que coletadas, devido ao fato das proteínas serem termossensíveis. Ao fim desta etapa, as frações obtidas foram analisadas por eletroforese de SDS-PAGE 15% para verificar a presença do complexo.
3.4. Formação do heterodímero (LBD e DL)
Para que fosse possível montar os complexos contendo a proteína RXR (sejam eles os complexos LBD ou DL), foi necessário preparar inicialmente o heterodímero TR:RXR (LBD ou DL).
Para a montagem do heterodímero, as proteínas TR e RXR foram expressas e purificadas conforme descrito no item 3.2. As proteínas purificadas foram então concentradas e suas concentrações foram medidas em espectrofotômetro a 280 nm,
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utilizando-se a soma da massa molecular e o coeficiente de extinção molar de cada proteína. Para a montagem do heterodímero foi necessário calcular as concentrações molares de cada uma das proteínas para que a mistura fosse feita em proporções molares de 1:1.
A formação dos heterodímeros foi checada por eletroforese SDS-PAGE 15%. Analises de DLS e ultracentrifugação analítica foram usadas também para auxiliar na confirmação da formação do heterodímero.
3.5. Formação do complexo TR:RXR:GRIP (LBD e DL)
A montagem dos complexos foi realizada por um ensaio do tipo Pull Down de acordo com as etapas a seguir:
Etapa 1: Montagem do heterodímero como descrito no item anterior com adição de T3 em excesso molar de 3 vezes (Figura 8a). A adição do T3 foi necessária uma vez que a interação do TR com a GRIP só ocorre na presença de seu ligante.
Etapa 2: A GRIP-GST previamente purificada (conforme item 3.2) foi incubada com heterodímero em excesso molar de duas vezes, em banho de gelo por 1 hora (Figura 8b).
Etapa 3: A solução (heterodímero+GRIP-GST) foi incubada com resina glutationa- Sepharose 4 fast flow (Amershan Biosciences) por 30 minutos. Após o período de incubação, a solução foi transferida para uma coluna plástica onde o flow through foi coletado e a resina foi lavada com tampão (Hepes 20 mM pH 8, NaCl 300 mM, 5% de glicerol) para a retirada do excesso de TR e RXR (Figura 8c).
Etapa 4: Após a lavagem, foi adicionado trombina (1U/ 0,5 mg de proteína) à solução e foi incubado por 16 horas em banho de gelo. Dessa forma, apenas a cauda GST permaneceu ligada à resina enquanto o complexo formado ficou em solução (Figura 8d). Etapa 5: Após as 16 horas, o flow through contendo o complexo formado foi coletado (Figura 8d).
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Figura 8. Esquema da montagem dos complexos LBD e DL por meio de ensaio de Pull Down Like. a)
Primeiro as proteínas TR e RXR foram incubadas juntas para a montagem do heterodímero (etapa 1). b) Em seguida, esse heterodímero era incubado com a proteína GRIP previamente purificada e ainda fusionada à cauda GST, na presença do ligante T3 para a formação do complexo TR:RXR:GRIP (etapa 2). c) Complexo incubado com a resina glutationa-Sepharose (etapa 3). d) Clivagem da cauda GST e coleta do compelxo (etapas 4 e 5).
Em alguns casos, quando necessário manter a cauda GST no complexo (por questões de estabilidade), a etapa de clivagem não foi realizada. Nesses casos, após a lavagem da etapa 4, o complexo era eluído com glutationa reduzida 5mM. Todos os passos foram realizados em X°C.
Assim como nos passos anteriores, a concentração do complexo foi verificada analisando-se a absorbância no espectrofotômetro a 280 nm utilizando-se a soma da massa molecular e o coeficiente de extinção molar de cada proteína, concentrado em concentrador AMICON quando necessário. O complexo clivado foi analisado por eletroforese de SDS-PAGE 15%.
3.6. Caracterização biofísica básica
Os ensaios de caracterização biofísica foram realizados para verificar a qualidade da amostra, quanto à estabilidade das proteínas e complexos bem como por verificar a montagem dos complexos.
3.6.1. Dicroísmo circular (CD)
O experimento de CD (dicroísmo circular) foi realizado com as proteínas isoladas e com o complexo em concentrações de 5 μmolL-1, em tampão com 5 mM de Tris (pH
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8,0), contendo 25 mM de NaCl, a uma temperatura de 10 °C, com espectro de varredura entre 195 a 260 nm. Os espectros obtidos das proteínas foram subtraídos dos espectros dos tampões correspondentes, permitindo a análise das estruturas secundárias das proteínas sozinhas e do complexo. As amostras também foram submetidas ao desenovelamento térmico para análise da estabilidade da estrutura secundária, quando a proteína se encontrava sozinha ou formando complexo. O desenovelamento foi realizado em uma faixa de 10-90°C, com taxa de aumento de temperatura de 1°C/mim, sendo monitorados os sinais de CD em 222 e 208 nm (característicos da estrutura em alfa hélice). As medidas foram realizadas em um Espectropolarimetro J-810 (Jasco) com um total de 20 acumulações.
3.6.2. Espalhamento de luz dinâmico (DLS)
O experimento de DLS foi realizado para monitorar o raio hidrodinâmico (Rh) da proteína, homogeneidade da amostra (através da polidispersão) e estado oligomérico das proteínas. Para isso, foram utilizados 40 µl de proteína na concentração de 1,5 mg/mL. As medidas foram realizadas a 15°C com tempo de duração de cada aquisição de 5 segundos, sendo uma medida composta de 100 aquisições no total. As medidas foram realizadas no equipamento Protein Solutions DynaPro DLS system (Wyatt).
3.6.3. Eletroforese Nativa.
A eletroforese nativa consiste na separação de partículas segundo sua carga e seu tamanho. A carga de uma proteína pode variar conforme sua estrutura primária e o pH da solução na qual será realizada a corrida eletroforética. O tamanho da proteína varia de acordo com a sua conformação, sendo que as mais compactadas tem uma mobilidade maior.
Foram utilizados géis nativos do sistema Phast System (Amershan – GE) com um gradiente de acrilamida de 8 a 25%. Após a corrida os géis foram corados com corante (0,2% de azul de bromofenol, 20% de glicerol e 100 mM de Tris-HCl pH 6,8) e depois foram descorados em descorante (30% de metanol e 10% de ácido acético)
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3.7. Ultracentrifugação analítica
Para este ensaio foi necessário a troca do tampão das proteínas e complexos por um tampão correspondente, porém sem glicerol para que este não interferisse na sedimentação da amostra, nem causasse difusão reversa.
Os complexos e proteínas, nas construções LBD, obtidos a 0,5 mg/mL foram submetidos a ensaios de velocidade de sedimentação em uma ultracentrifuga analítica (BeckmanCoulter OptimaTM XL-A, Beckman Instruments Inc. Palo Alto, CA), a 10 °C, 42000 rpm, medindo a absorbância em 280 nm, num total de 100 espectros coletados. O padrão de sedimentação das proteínas e complexos e as curvas geradas foram analisadas pelo programa Sedfit para obter tanto o coeficiente de sedimentação (c(S)), quanto a massa dos complexos e proteínas.
3.8. Anisotropia De Fluorescência.
Foram realizados dois ensaios de anisotropia, sendo um para verificar a afinidade entre homo e heterodímeros (ambos nas construções LBD e DL) pela GRIP; e um segundo experimento para verificar a ação do 9C no desligamento de correpressor e recrutamento de coativador.
Num primeiro ensaio, para verificar a afinidade entre as proteínas do complexo, foi titulado GRIP-GST em concentrações variando entre 1 a 1000 nM em uma solução contendo TR (LBD ou DL), marcado com FITC (isotiocianato de fluoresceína), na sua forma homodimérica e na forma de heterodímero com RXR (LBD ou DL), na presença ou ausência de 9C, em concentração de 50 nM.
Para este ensaio, o TR foi marcado com excesso molar de sonda (FITC – Invitrogen) equivalente a 3 vezes a concentração molar da proteína e foi incubado por 1 hora no gelo. Posteriormente, à solução TR-sonda foi aplicada em uma coluna de
desalting (HiTrap desalting – GE Healthcare) para retirada do excesso de sonda. As
amostras obtidas de TR marcado foram monitoradas por absorbância em 280 e 495 nm para monitorar a presença de proteína e sonda, respectivamente.
O segundo ensaio foi realizado para estudar a ação do 9C no desligamento e recrutamento de correpressores. O heterodímero TR:RXR LBD, em concentrações variando de 1 a 10000 nM, foi titulado em soluções contendo peptídeos de proteínas correguladoras marcados com FITC com concentração de 50 nM, sendo que, para a
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verificação da ligação com o peptídeo SRC1, foi adicionado T3 ao heterodímero em concentrações molares com 3 vezes de excesso.
Após a montagem do complexo entre heterodímero com peptídeo corregulador (10 µM heterodímero e 50 nM do peptídeo corregulador), foi titulado 9C em concentrações variando de 10 a 60000 nM para verificar variações na anisotropia.
Os peptídeos correguladores utilizados neste segundo ensaio foram: SRC1 peptídeo coativador FITC-KYSQTSHKLVQLLTTTAEQQL N-CoR peptídeo correpressor FITC-RTHRLITLADHICQIITQDFARN ambos obtidos pela Life-technologies.
A anisotropia foi medida a 15°C num fluorímetro (ISS-K2), utilizando 495 nm como comprimento de onda de excitação, sendo a emissão monitorada a partir de 520 nm utilizando-se filtro de Cuttoff. Os valores de anisotropia foram calculados pelo programa Vinci-ISS por meio da função (Lakowicz, 2002):
onde I se refere a intensidade de fluorescência medida, V e H correspondem aos polarizadores orientados na vertical e horizontal, respectivamente, e G é um fator de correção que considera diferenças da sensibilidade da fotomultiplicadora, dependente das direções dos polarizadores. Esse fator de correção pode ser calculado de acordo com (Lakowicz, 2002):
Os dados foram ajustados no programa Origin por meio do algoritmo de Levenberg-Marquardt para determinação dos valores de Kd e os valores do coeficiente de Hill para avaliar a cooperatividade das interações (Figueira, 2010).
3.9. Ensaio de cross-linking
Este ensaio foi realizado em colaboração com o grupo do Prof. Dr. Fábio Gozzo no Instituto de Química da Unicamp. Os complexos foram ligados covalentemente por meio da reação de cross-linking e foram analisados por espectrometria de massas, com a
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finalidade de mapear as interfaces de interação existentes entre as proteínas formadoras dos complexos.
A reação de cross-linking foi realizada com reagente DSS (suberato de disuccinimidila) em excesso molar de 200:1, a uma temperatura de 23°C por 2h, com agitação de 300 rpm. A solução de DSS utilizada na reação foi preparada com 10 mg do composto em 250 μL de DMF (DSS 108 mM).
Após a reação de cross-linking, foram realizadas reações de redução utilizando DTT (ditiotreitol), por 30 minutos, a 60°C e reações de alquilação, utilizando iodoacetamida, durante 30 minutos, em temperatura ambiente e protegido da luz. Essas reações foram necessárias para quebrar as pontes de dissulfeto. Ao fim dessas reações, as amostras foram digeridas com tripsina em uma proporção de 1:50 (tripsina:complexo de proteína). Essa etapa foi realizada a 37°C por 16 h, com agitação de 500 rpm.
As análises foram realizadas nos equipamentos Q Exactive Orbitrap e Easy-nLC 1000 LC System, Thermo Scientific, por eletrospray. O processamento dos dados foi feito através dos programas Mascot Server, SIM - XL, I-TASSER, Xwalk e PyMOL.
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4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Este trabalho é parte de um projeto maior que busca compreender com mais detalhes o mecanismo de ação TR. Além dos ensaios descritos aqui, foram realizados outros experimentos em paralelo para que o objetivo geral do projeto fosse alcançado. Os resultados e conclusões aqui apresentados, juntamente com outros resultados obtidos em nosso laboratório, foram publicados recentemente (Fattori et al, 2014, Mol. Endo).
4.1. Expressão e purificação das proteínas (TR, RXR (LBD e DL) e GRIP) Foram expressas construções das proteínas GRIP e dos receptores nucleares TR e RXR. No caso do TR e RXR, foram expressas duas construções diferentes, uma contendo só o LBD, e outra contendo o DBD e o LBD (DL). A expressão e purificação das proteínas foram acompanhadas por gel de poliacrilamida (Figura 9).
Figura 9. Gel de poliacrilamida das proteínas purificadas por afinidade sendo a) TR LBD (31,5 kDa), b)
RXR LBD (30,8 kDa) e na figura c) estão os géis correspondentes ao 1) TR DL (43,4 kDa), 2) RXR DL (40,3 kDa) e 3) GRIP+GST (47,5 kDa – GRIP = 22,5 kDa e GST = 25 kDa) as quais estão indicadas com um traço preto. Os valores dos marcadores (em kDa) estão indicados ao lado de cada figura.
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Após o processo de purificação, a concentração das eluições das proteínas foi determinada a partir da absorbância a 280 nm medida no Nanodrop (Thermo). O rendimento médio da purificação foi de 25 mg/L de expressão para TR LBD; 13 mg/L de expressão para TR DL; 75 mg/L de expressão para RXR LBD e DL; 10 mg/L de expressão para a proteína GRIP em fusão com GST.
É possível observar nos géis que as purificações por afinidade garantiam amostras com um relativo grau de pureza, o que permitia a utilização destas proteínas para muitos dos ensaios biofísicos sem a necessidade de adicionar uma segunda etapa de purificação. Além disso, todas as proteínas apresentaram o tamanho esperado.
4.2. Formação dos heterodímeros (LBD E DL).
Antes de montar os complexos com o coativador, era necessário formar os heterodímeros (TR:RXR) em ambas as construções (LBD e DL). Para isso, as proteínas TR e RXR purificadas previamente (conforme item 3.2) foram incubadas juntas em concentrações molares proporcionais de 1:1. As amostras de heterodímero também foram avaliadas por eletroforese, como pode ser visto na Figura 10.
Figura 10. Gel de poliacrilamida das amostras de heterodímero LBD (a) e DL (b). Os traços pretos
presentes nas figuras estão indicando as bandas que correspondem a proteína RXR LBD (a) e RXR DL (b). Os traços vermelhos, da mesma forma, foram adicionados para indicar as bandas que correspondem ao TR LBD (a) e TR DL (b). Os valores do marcador molecular (kDa) estão representados ao lado de cada figura.
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Podemos observar no gel do heterodímero LBD (figura 10a) as duas bandas das proteínas TR e RXR. Porém, ao observarmos o gel do heterodímero DL (Figura 10b) observamos apenas uma banda. Isso ocorre provavelmente pela sobreposição das bandas de TR DL e RXR DL, visto que essas apresentam pesos moleculares muito próximos, assim como a altura em que essas proteínas correm no gel.
Os resultados de outros ensaios descritos mais adiante, nos ajudam a confirmar que, embora não seja possível visualizar as duas bandas no gel, as proteínas estão juntas e formam o heterodímero. Além disso, não foi possível observar a formação de precipitado durante a preparação do heterodímero, o que ajuda a descartar a hipótese de que há apenas uma banda no gel, ao invés da sobreposição das duas proteínas.
Na tentativa de separar as bandas no gel e facilitar a visualização em gel SDS-page fizemos algumas alterações na etapa de eletroforese. Utilizamos uma menor amperagem (60 mA – antes era utilizado 300 mA) e uma maior voltagem (300 V – antes era utilizado 150 V)
Figura 11. Gel SDS-PAGE 12% do heterodímero DL, mostrando a separação das duas bandas. O traço em
preto indica a posição da banda correspondente ao RXR DL, enquanto o traço em vermelho indica a posição da banda correspondente ao TR DL. Os valores do marcador molecular (kDa) estão representados ao lado de cada figura.
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Embora a amostra de heterodímero utilizada para esse teste não apresente bandas proporcionais, foi possível observar com maior clareza a presença de duas bandas (Figura 11).
4.3. Montagem dos complexos TR:RXR:GRIP (LBD E DL)
Os complexos montados por ensaio do tipo pull down foram avaliados por gel de SDS-PAGE (figura 12) a fim de verificar se as 3 proteínas se encontravam na mesma amostra.
Figura 12. Gel das amostras de flow through coletadas no experimento de montagem dos complexos
TR:RXR-GRIP (LBD e DL) formados por ensaio de pull down like. a) Gel do complexo DL, onde é possível observar a banda do TR DL e RXR DL sobrepostas indicadas pelos traços preto vermelho, e da GRIP clivada (23 kDa) indicado pelo traço azul. b) Gel do complexo LBD, onde os traços em preto, vermelho e azul, indicam as bandas correspondentes ao RXR LBD, TR LBD e GRIP clivada, respectivamente. Os valores (kDa) do marcador molecular se encontra ao lado de cada gel.
Conforme demonstrado na Figura 12b, podemos observar 3 bandas para o complexo TR:RXR:GRIP LBD, indicando que as 3 proteínas do complexo se encontravam na mesma amostra. Para o complexo TR:RXR:GRIP DL, é possível observar com clareza apenas duas bandas, uma na altura de 40 kDa e uma segunda na altura de 25 kDa que representa a GRIP clivada. Novamente, as proteínas TR e RXR DL encontram-se
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sobrepostas, mas assim como para a amostra de heterodímero DL, realizamos alguns ensaios que nos ajudam a comprovar que o complexo foi formado.
Assim como para o heterodímero, realizamos algumas alterações na etapa de eletroforese alterando a amperagem (60 mA – antes era utilizado 300 mA) e a voltagem (300 V – antes era utilizado 150 V).
Figura 13. Gel SDS-PAGE 12% do complexo TR:RXR:GRIP DL, mostrando a separação das duas bandas de
TR e RXR. O traço em preto indica a posição da banda correspondente ao RXR DL, enquanto o traço em vermelho indica a posição da banda correspondente ao TR DL. O traço em azul indica a posição da banda que corresponde a GRIP em fusão com GST. Os valores do marcador molecular (kDa) estão representados ao lado de cada figura
A amostra de complexo DL disponível não estava clivada, mas foi possível observar a separação das bandas correspondentes ao TR e RXR, que era o principal objetivo deste teste (Figura 13).
Embora os complexos formados neste ensaio apresentassem poucos contaminantes, o rendimento era sempre muito baixo. Mesmo quando eram utilizadas grandes concentrações de cada proteína, o grande número de etapas deste experimento resultava numa perda significativa destas proteínas. Muito era perdido nas etapas de incubação com a resina, onde algumas proteínas que não se ligavam a coluna eram perdidas no flow through e nas lavagens. Uma grande parte era perdida principalmente
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na etapa de clivagem, onde algumas proteínas não eram clivadas, ou então as proteínas clivadas começavam a se degradar, devido a sua baixa estabilidade, como o caso da GRIP.
4.4. Montagem do complexo TR:GRIP
A montagem do complexo TR:GRIP (LBD e DL) era inicialmente realizada de maneira similar ao ensaio do tipo pull down que foi descrito para a montagem do complexo TR:RXR:GRIP. Porém, na tentativa de evitar os mesmos problemas, como perda das proteínas, buscamos uma metodologia diferente para a formação deste complexo.
Dessa forma optamos por cotransformar as bactérias com as duas proteínas (TR:GRIP LBD e DL) para obter o complexo já formado, evitando a etapa de reincubar as proteínas na resina. Após a cotransformação, foram realizadas etapas de expressão e purificação das proteínas em conjunto (Figura 14). Estas etapas ocorreram exatamente como descrito para a expressão e purificação das proteínas isoladas. Porém, para garantir que o complexo sairia formado ao final da etapa de purificação por afinidade, foi necessário a adição de 1 mM de T3 nos tampões de lise, lavagem e eluição, para garantir a interação entre TR e GRIP.
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Figura 14. Gel de poliacrilamida do complexo TR-GRIP LBD (a) e TR-GRIP DL (b) após a etapa de
purificação por afinidade em resina de cobalto. Os traços vermelhos presentes na figura indicam a posição das bandas que correspondem à proteína TR e os traços azuis indicam a posição da GRIP no gel, ambas as proteínas não clivadas.
Após a purificação por afinidade, a concentração das eluições do complexo foram quantificadas no nanodrop (Thermo Scienctific). O coeficiente de extinção molar utilizado foi corresponde à soma do coeficiente de extinção molar de cada proteína, de forma que foi possível calcular o rendimento de cada complexo (LBD e DL). Para a construção menor o rendimento foi de 10 mg para cada litro de cultura, enquanto a construção maior o rendimento total foi de 15 mg para cada litro de cultura expresso.
Também foi realizado a clivagem destes complexos e, para retirar as caudas e as populações de proteínas/complexo não clivados foi adicionado uma segunda etapa de purificação por filtração em gel. Após essa etapa, obtivemos uma amostra dos complexos de TR-GRIP (LBD e DL) com menor número de contaminantes e em boa quantidade para realização dos demais experimentos. Os resultados deste experimento também foram observados em gel SDS-PAGE (Figura 15).
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Figura 15. Gel de poliacrilamida do complexo TR-GRIP DL (a) e TR-GRIP LBD (b). Os traços vermelhos
presentes na figura indicam a posição das bandas que correspondem à proteína TR e os traços azuis indicam a posição da GRIP no gel. .
Após a clivagem e a filtração em gel, foram juntadas todas as frações que continham os complexos devidamente clivados e essas frações foram concentradas. É possível observar que a banda do TR neste gel (Figura 15) se apresenta acima da banda que corresponde à proteína GRIP. Isto acontece, pois nessa etapa a GRIP se encontra clivada, apresentando uma massa de cerca de 23 kDa enquanto o TR DL clivado tem massa de 43 kDa e o TR LBD tem massa próxima de 31 kDa, sendo ambos as construções de TR com massa maior a da GRIP, justificando suas posições no gel SDS-PAGE.
É possível observar nos géis dos complexos LBD clivados (Figura 12b; Figura 15a) que a GRIP encontra-se abaixo de 25 kDa (em relação ao marcador) e nos géis dos complexos DL (Figura 12a; Figura 15b) a GRIP se encontra pouco acima de 25 kDa. Isso provavelmente ocorre, pois o TR LBD, por apresentar massa próxima à da GRIP clivada, pode interferir no padrão de migração desta proteína. Estudos de espectrometria massas realizados anteriormente em nosso laboratório já comprovaram que esta banda é da proteína GRIP.
Embora uma parte das proteínas ainda tenha se perdido nesta etapa de clivagem/gel filtração, esse método proposto para a formação do complexo TR:GRIP se mostrou muito mais eficiente do que o método usado anteriormente (tipo pull down). Foi possível obter amostras de complexos com uma melhor estequiometria aparente e
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um maior grau de pureza. Em questões de rendimento, embora seja impossível evitar que parte das proteínas se percam durante o processo, conseguimos uma boa quantia final.
4.5. Caracterização Biofísica por Dicroísmo circular (CD)
Os ensaios de dicroísmo circular foram realizados para avaliar a estabilidade e a estrutura secundária das proteínas e complexos. Os espectros de CD nos permitiam avaliar qual tipo de estrutura secundária predomina em cada proteína (Figura 16).
Proteínas que apresentam um espectro com mínimos próximos a 222 e 208 nm são aquelas que possuem uma estrutura, em sua maioria, formada por α-hélices. Por outro lado, as proteínas que apresentam um único mínimo próximo a 215 nm, possuem estrutura secundária principalmente na forma de folhas β. Há ainda proteínas que apresentam um mínimo próximo a 200 nm, indicando que estas proteínas possuem estrutura randômica ou apresenta regiões não estruturadas.
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Figura 16. Espectros de CD (dicroismo circular) das proteínas a) TR LBD, GRIP+GST e TR:GRIP LBD; b) TR
LBD, RXR LBD e heterodímero LBD. As curvas obtidas neste ensaio mostram a estrutura secundária das proteínas, podendo ser alfa-hélice (mínimos em 222 e 208 nm), folhas-beta (mínimo próximo a 215), randômicas ou desenoveladas
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Na figura 16 são apresentados os espectros obtidos para as proteínas e complexos nas construções LBD, sendo que as amostras utilizadas neste ensaio foram TR, RXR, TR:RXR, TR:GRIP e GRIP-GST.
Para as proteínas TR LBD (vermelho), RXR LBD (verde) e o heterodímero LBD (rosa) observamos uma curva com mínimos próximos a 222 e 208 nm, o que indica que estas proteínas, mesmo quando juntas na forma de heterodímero, possuem em sua maioria, α-hélices em sua estrutura.
Ao observamos o espectro obtido para a proteína coativadora, GRIP-GST (azul), percebemos que esta apresenta um mínimo próximo a 200 nm. Isso indica que esta proteína possui regiões que não são totalmente estruturadas. Porém, quando esta proteína forma complexo com o TR, vemos que ela adquire mais estrutura, principalmente α-hélices, o que pode ser indício de formação do complexo. Isso pode ser observado pelo espectro obtido da amostra de TR-GRIP LBD, que apresenta características intermediárias entre α-hélice (um mínimo em 222 nm) e regiões não estruturadas (um segundo mínimo, porém próximo a 200 nm).
Além da análise qualitativa que foi feita analisando-se o perfil das curvas, foi feito também uma deconvolução desses espectros (Tabela II) para que tivéssemos uma estimativa da porcentagem de cada tipo de estrutura em cada uma das amostras.
Tabela II. Dados da deconvolução dos espectros de CD das amostras TR, RXR, GRIP, TR:RXR e TR:GRIP (todas nas construções LBD), indicando a porcentagem de cada estrutura secundária presente nas amostras.
Proteína (LBD) % estrutura secundaria
α helice folha β voltas β randômica
TR 67 14 7 13
RXR 53 11 13 23
GRIP-GST 12 35 28 25
TR:RXR 38 17 18 27
