Espectrometria de MASSAS

Este ensaio foi realizado em colaboração com o Prof. Dr. Fábio Gozzo, de forma que as proteínas foram expressas e purificadas e enviadas ao seu laboratório para que fossem realizadas todas as etapas necessárias previamente à analise de espectrometria de massas. Como as amostras foram produzidas em nosso laboratório, mas foi necessário o transporte das mesmas até o laboratório do Prof. Dr. Fábio Gozzo, optamos por manter a cauda GST da GRIP para garantir maior estabilidade para esta proteína e complexos com ela formados.

Para as amostras de TR (LBD e DL), RXR (LBD e DL), heterodímero (LBD e DL) bem como o complexo formado exclusivamente entre TR e GRIP-GST (LBD e DL) foi utilizado o equipamento Synapt para realização das medidas e que posteriormente foram analisados pelos softwares Mascot Distiller, Mascot Server, CRUX e SIM-XL. Os dados permitiram somente confirmar a sequência destas proteínas devido à baixa sensibilidade do equipamento, o que não permitiu a identificação das ligações de DSS nos resíduos dessas amostras.

Porém, as medidas das amostras de TR:RXR:GRIP LBD com e sem 9C foram realizadas no equipamento Q Exactive e os dados foram analisados através dos programas Mascot Distiller, Mascot Server e SIM-XL, o que permitiram a identificação de 61 ligações do DSS em peptídeos intramoleculares e outras 14 ligações em peptídeos intermoleculares para o complexo com 9C (Figura 22) e 60 ligações intramoleculares e mais 16 ligações intermoleculares para o complexo sem 9C (Figura 23).

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Figura 22. Mapa de ligações cruzadas do DSS com peptídeos intramoleculares e intermoleculares entre

resíduos de lisina (K), serina (S) metionina (M) e tirosina (Y) para o complexo TR:RXR:GRIP LBD na presença de T3 e 9C. O TR está representado em cor azul, o RXR em cor verde e a GRIP em cor rosa (fundida com a GST em cor laranja). As cisteínas (C) representadas na cor preta foram alquiladas

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Figura 23. Mapa de ligações cruzadas do DSS com peptídeos intramoleculares e intermoleculares entre

resíduos de lisina (K), serina (S), metionina (M) e tirosina (Y) para o complexo TR:RXR:GRIP LBD na presença de T3, porém, na ausencia do ligante 9C. O TR está representado em cor azul, o RXR em cor verde e a GRIP em cor rosa (fundida com a GST em cor laranja). As cisteínas (C) representadas na cor preta foram alquiladas

Foi elaborada uma tabela com algumas das principais interações encontradas de forma a tornar mais clara a discussão dos resultados obtidos neste ensaio (Tabela VII).

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Tabela VII. Tabela dos cross-linkings encontrados nas amostras de complexo LBD com e sem 9C. A tabela foi dividida em duas partes (Sem 9C/Com 9C). Os resíduos dispostos na mesma linha, dentro da mesma parte, correspondem aos resíduos que estão interagindo entre si. A proteína a qual o resíduo pertence está indicado pela coluna em que ele se encontra. K corresponde a Lisina, S corresponde a Serina e M, Metionina. Os resíduos grifados destacam as interações comuns em ambas as condições.

Sem 9C Com 9C TR RXR GRIP TR RXR GRIP K244 K738 K242 S222 K244 K739 K288 K381 K288 K381 K394 M191 K288 S380 K288 S380 K411 K213 S222 S575 S437 380 S222 S575 K381 K740 S380 K740

Com base nas ligações destacadas foi possível elaborar, utilizando-se da estrutura já publicada do heterodímero TR:RXR LBD (Putcha, 2012) retirada do PDB (Protein Data Bank - http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do), um modelo que permitisse explorar melhor as interações encontradas e se essas estavam de acordo com o esperado (Figura 24).

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Figura 24. Modelo das interações encontradas entre TR (vermelho), RXR (azul) e GRIP-GST (amarelo). É

possível verificar através do modelo, as principais interações entre essas proteínas de acordo com a interface de interação já conhecida entre essas proteínas. O modelo da GRIP foi feito usando o software I- tasser. Foram encontradas ligações inespecíficas de longas distâncias que não respeitam a interface de interação já conhecida entre essas proteínas. Porém também foram observadas ligações de curta distância que respeitam essas mesmas interfaces.

Podemos observar que, em ambos os complexos (com e sem 9C), o TR faz 4 interações com o RXR, sendo duas delas (TR K288-RXR K380 e TR K288-RXR K381) comuns em ambos os complexos. Entretanto, não foram encontradas muitas interações do TR com a GRIP, as únicas interações vistas (TR K244-GRIP K738/739) foram encontradas no complexo sem 9C. Em contrapartida, observamos que o RXR faz interações com a GRIP independente da presença do 9C, porém, o número de interações entre essas proteínas é maior na ausência deste ligante.

É importante notar que as ligações encontradas para a GRIP (com exceção da ligação RXR S222-GRIPS575) correspondem à região já conhecida de interação entre coativadores e NRs. Na sequencia abaixo é possível observar a proximidade entre os aminoácidos K738, K739 e K740 da GRIP envolvidos na ligação de DSS (destacados em negrito e sublinhado) e a região LRYLL (ou motivo LxxLL) onde ocorre a interação com receptores nucleares (destacado em verde).

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aa735 – ASPKKKENALLRYLLDKDDTKDIGLPEITPKLE – aa767

Também se observa que a região do TR que interage com a GRIP nas condições sem 9C (TR k244), interage com o RXR quando há adição deste ligante (9C) (TR K242- RXR S222). Mais informações seriam necessárias para avaliar se, de fato, o 9C causa alguma mudança estrutural que impede a interação do TR com a GRIP, ou se essa interação não foi detectada pela técnica.

Como citado, o complexo sem 9C apresentou 16 ligações intermoleculares (2 ligações a mais que o complexo com 9C). É possível observar através do mapa de ligação cruzada do DSS, que o complexo sem 9C apresenta um maior numero de ligações na proteína GRIP (não considerando a cauda GST) se comparado ao complexo com 9C. Uma das hipóteses que levariam a esse resultado seria que o 9C age no complexo de maneira a desestabilizar a ligação entre heterodímero e coativador.

Ao comprarmos estes dados com os resultados obtidos em nossos ensaios de anisotropia, podemos notar que estes também apontam para uma desestabilização do complexo LBD quando há presença de 9C, de forma que este ligante diminuía a afinidade entre o dímero e o coativador (Kd sem 9C = 0,7 e Kd com 9C = 2,9), onde o Kd aumentou mais de 4 vezes, passando da ordem de nM para µM.

Porém vale ressaltar que nossos ensaios de anisotropia de fluorescência mostraram que construções mais completas dos receptores garantiram maior afinidade entre as proteínas do complexo, de forma que a presença do ligante 9C pouco alterou a estabilidade destes complexos (Kd sem 9C = 0,3 e Kd com 9C = 0,6) de forma que o Kd permaneceu numa mesma ordem de grandeza. Vale ressaltar que estes são resultados preliminares, sendo que experimentos com construções maiores deverão ser realizados.

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