Dans le but de déterminer quelles populations de cellules se divisent
activement dans un animal irradié et repeuplé, nous avons combiné deux procédures
expérimentales: un marquage au colorant PKH26 afin de différencier les cellules du
donneur et du receveur et un traitement au BrdU (5-Bromo-2’-Deoxyuridine), analogue
de la thymidine. Il peut être détecté grâce à un anticorps anti-BrdU couplé à un colorant
fluorescent.
Des souris Balb/c sont irradiées à 650 rads et repeuplées avec 2x10^ cellules de
rate naïve colorées au PKH26 (colorant rouge visualisé en Fl 2 au FACS). Elles
reçoivent une injection intrapéritonéale de 1 mg de BrdU toutes les douze heures ou
absorbent par voie orale 2 â 3 mg de BrdU/ml d’eau pendant trois à cinq jours. Trois,
quatre et cinq jours après le traitement au BrdU, les souris sont sacrifiées. Les différents
organes lymphoïdes (rate, moelle, ganglions, plaques de Peyer et sang périphérique)
Schéma 1 : Estimation de la vitesse de division des cellules du donneur et du
receveur irradié
Receveur Donneur
% de cellules du receveur
exprimant le marqueur X
% de cellules du receveur
n'exprimant pas le marqueur
% de cellules du donneur
exprimant le marqueur X
% de cellules du donneur
xn’exprimant pas le marqueur
.
\\
Incorporation de BrdU : FI1 Incorporation de BrdU : FI1
Pourcentage de cellules du receveur
portant le marqueur X qui se sont divisées
pendant 4 jours.
Pourcentage de cellules du donneur
portant le marqueur X qui se sont divisées
pendant la même période.
Les mêmes analyses sont effectuées après 6 jours.
Connaissant le nombre total de cellules de rate dans l’animal irradié et le pourcentage des
cellules appartenant au donneur (cellules marquées par le PKH26), on peut estimer le nombre
total des différents types cellulaires apparus en 2 jours dans les sous-populations du
sont prélevés. Les différentes molécules de surface des cellules T ou B sont colorées par
des anticorps couplés à la biotine et révélés par de l’avidine couplée à un troisième
fluorochrome (F13). Les cellules sont alors fixées, leur noyau est perméabilisé et le DNA
dénaturé afin de mettre en évidence le BrdU incorporé grâce à l’anticorps anti BrdU-
FITC (colorant vert FLl).
Un cytogramme F12 (cellules du donneur) en fonction de F13 (marqueurs de surface, tels
que HSA, B220, IgM, CD4 ...) permet de faire la distinction entre les cellules du
donneur et du receveur. Des régions peuvent être définies autour des différentes
populations cellulaires. Un histogramme indiquant l’intensité du marquage FU (BrdU
incorporé) en fonction du nombre de cellules dans ces différentes régions permet de
déterminer le pourcentage de cellules qui se sont divisées dans chacune des populations
(voir schéma n“l).
Si les mêmes paramètres sont déterminés au cours du temps, on peut calculer le nombre
de cellules néoformées apparues par jour pour chacun des types cellulaires étudiés.
Dans une expérience préliminaire, nous avons déterminé dans un animal naïf,
non irradié, la vitesse de division dans la rate et dans la moelle des différents types
cellulaires: cellules souches, précurseurs précoces, cellules B et cellules T.
Les cellules souches présentent le phénotype HSA*" B220', les cellules précurseurs de
lymphocytes B (cellules immatures) sont HSA*" B220"^ tandis que les cellules B matures
sont HSA^ B220^.
Les résultats ont montré que dans la moelle, la grande majorité des précurseurs
de cellules B (ou T) incorporent le BrdU en trois jours. Une petite population de cellules
B matures (10%) se divisent plus ou moins à la même vitesse que les cellules B de la
rate, ce sont vraisemblablement des cellules B recirculantes.
L’analyse des populations de cellules qui expriment le marqueur B220 montre que dans
la moelle, les cellules précurseurs B220'° incorporent beaucoup plus de BrdU que les
cellules matures B220*", alors que dans la rate la quasi-totalité des cellules sont B220*" et
incorporent peu de BrdU (figure n“12).
Figure 13 : Incorporation au cours du temps de BrdU dans les cellules du receveur et
du donneur dans la rate de Balb/c irradiées et repeuplées.
Jour 5
Receveur
A'
Intensité du PKH26 (R2)
Donneur
itio m "fte ito iio*
Incorporation de BrdU (RI)
1Ù0 ïüi ïb»
Incorporation de BrdU (R1)
Jour 7
Receveur
1.
Incorporation de BrdU (RI)
Donneur
Figure n”12 : Incorporation de BrdU dans les populations cellulaires exprimant le
marqueur B220 dans la moelle et dans la rate de souris adultes.
Moelle
O
CM CM CQIncorporation de BrdU
Rate
Incorporation de BrdU
Ensuite, des souris Balb/c ont été irradiées à 650 rads, repeuplées avec des
cellules de rate totale ou avec des cellules B purifiées préalablement colorées au PKH26
(F12) et traitées au BrdU. Après 3, 5 et 7 jours, les animaux sont sacrifiés et la vitesse de
division des différents types cellulaires du donneur et du receveur est déterminée dans la
rate et dans la moelle.
Les résultats montrent que dans la moelle, pratiquement toutes les cellules ont
incorporé du BrdU en trois jours. Ceci indique une vitesse de multiplication
extrêmement rapide. La vitesse de division des différents types cellulaires dans la
moelle d’un animal irradié est très semblable à celle d’un animal non irradié.
Dans la rate du receveur: les analyses cellulaires faites cinq jours après le
traitement au BrdU indiquent que 15% des cellules totales incorporent du BrdU.
Lorsqu’on analyse les marqueurs de surface des cellules du receveur et du
donneur dans la rate, on constate que les cellules qui incorporent le plus de BrdU après
cinq jours sont les cellules HSA^‘ du receveur, ainsi que le montre la fîgure n“13.
Les résultats obtenus au jour 7 confirment ces observations.
Lorsqu’on connaît le nombre total de cellules d’un organe et le pourcentage de cellules
marquées par le colorant PKH26, on peut déterminer le nombre total de cellules du
donneur et du receveur. Connaissant ensuite le % de cellules du donneur et du receveur
qui expriment un marqueur de surface donné et le pourcentage de cellules qui ont
incorporé le BrdU dans ces différentes populations au cours du temps, on peut estimer le
nombre de cellules néoformées par jour dans les différentes populations cellulaires
d’une souris irradiée (voir schéma précédent).
Le tableau n“2 indique un nombre approximatif de cellules T et B néoformées
par jour dans la rate d’un individu irradié.
Tableau n°2: Vitesse de division des cellules du donneur et du receveur dans la rate
de souris Balb/c irradiées et repeuplées.
Marqueur Donneur = rate totale Donneur = cellules B
membranaire Receveur
xlO*
Donneur
xlO*
Receveur
xlO*
Donneur
xlO’*
HSA 230 4.6 230 1.0
B220 240 4.6 280 0.1
IgM 7.5 5.3 1.8 0.5
IgD 2.1 5.4
-0.9
Thy 3.9 1.6 n.d. n.d.
Les chiffres indiqués représentent le nombre approximatif de cellules néoformées par
jour pour les différents types cellulaires.
Notons qu’en moyenne 2x10*^ cellules HSA"^ sont formées par jour dans la rate
d’une souris adulte irradiée. La majorité de ces cellules expriment fortement le
marqueur HSA et faiblement le marqueur B220. Le phénotype et la vitesse de division
de ces cellules sont compatibles avec l’idée que ces cellules proviendraient de la moelle
du receveur et coloniseraient la rate de l’irradié.
Les cellules du donneur se divisent à un rythme plus lent. Il apparaît 1 à 4x10’* cellules T
ou B nouvellement formées par jour.
En conclusion:
Après repeuplement d’un animal irradié, une sous-population de cellules du
donneur s’implante dans la rate et s’y divise lentement. Après quelques jours, on
observe l’apparition d’un grand nombre de cellules HSA^‘ B220' qui se divisent
extrêmement rapidement. Ces cellules particulières, qui ne présentent aucun marqueur
de cellules B ni de cellules T, ni aucune molécule d’adhésion, pourraient être des
cellules qui quittent la moelle et colonisent la rate de l’animal irradié 5 à 7 jour après
l’irradiation.
3. Origine des cellules responsables de la synthèse d’anticorps dans un
No documento
Uma abordagem Lean às vertentes de logística, manutenção e produção na MEGATECH Industries Marinha Grande
(páginas 83-88)