Máquinas 351 e 352

Les PKH2 (vert) et PKH26 (rouge) sont des colorants fluorescents non

toxiques qui se fixent sur les lipides des membranes sans modifier l’expression des

différents marqueurs de la cellule. Le colorant est lié de manière stable à la membrane et

permet de suivre le “homing” ou la migration des cellules injectées. A chaque division

cellulaire, l’intensité du colorant diminue de moitié.

Des cellules de rate totale de souris Balb/c, colorées au PKH2 sont injectées

dans des souris syngéniques irradiées à 650 rads. Après des temps variables, les souris

sont sacrifiées. La rate, les plaques de Peyer, les ganglions, la moelle et le sang

périphérique sont prélevés. Les différentes molécules de surface des lymphocytes T et B

sont mises en évidence par des anticorps couplés à un autre colorant fluorescent. Ces

doubles marquages permettent d’évaluer le pourcentage de cellules du donneur qui

survivent dans l’hôte irradié et de tracer une cinétique d’apparition des différents types

cellulaires dans l’animal irradié.

Le tableau n°l indique que c’est dans la rate que les cellules B du donneur se

greffent (“homing”) préférentiellement. En effet 50% des cellules totales de la rate de la

Figure 9: Pourœntage des différents types cellulaires du donneur et du receveur

dans la rate de souris Balb/c irradiées, repeuplées avec des cellules de rate

naïve marquées au PKH2.

60

40

20

H 48h

3.,JLUJ1 ■Don

^

DRec

60

40

20

CD4 CD8 IgM IgD B220 HSA

H

Il , ■ , IbtiH

72 h

■ Don

□ Rec

CD4 CD8 IgM IgD B220 HSA

J5

■ Don

□ Rec

souris irradiée sont des cellules B du donneur. Un pourcentage plus faible (6 à 28%) de

cellules du donneur se greffent dans les autres organes lymphoïdes.

Tableau n°l: Pourcentage de cellules du donneur (marquées au PKH2) présentes

dans les différents organes des receveurs irradiés 24, 48 et 72 heures après le

repeuplement.

Organes 24 heures 48 heures 72 heures

Rate 43 45 50

Ganglions 14 17 25

Sang

périphérique

5 16 27

Plaques de Peyer 7 n.d. n.d.

Moelle 12 n.d. n.d.

n.d. = non déterminé.

Lorsqu’on compare les différentes populations de lymphocytes du donneur et

du receveur, on remarque que le pool des cellules T est constitué majoritairement de

lymphocytes T CD4^ du receveur, résistants à l’irradiation, les cellules T CDS"^ étant

plus radiosensibles (figure n“9).

Quant aux cellules B, on constate que la plus grande partie des cellules proviennent du

donneur. La faible proportion de cellules B du receveur qui subsiste après 24 heures

disparaît progressivement.

Vers le cinquième jour après l’irradiation, nous avons constaté l’apparition dans la rate

de l’animal d’une population importante de cellules qui ne portent aucun marqueur de

lymphocytes ni T ni B. Ces cellules sont PKH2’ et expriment des taux élevés du

marqueur HSA.

La présence de cette population cellulaire soulève de nombreuses questions:

• Quelle est l’origine de ces cellules, proviennent-elles du donneur ou du

receveur irradié?

• Vers quel type cellulaire se différencient-elles au cours de leur maturation?

• A quelle vitesse se divisent-elles?

L’origine de ces cellules reste hypothétique. Ces cellules sont PKH2' et

pourraient dès lors provenir du receveur qui subirait un important stress dû à

l’irradiation. Ce stress pourrait activer une série de mécanismes de divisions de cellules

souches d’origine lymphoïde ou non.

Ces cellules pourraient aussi appartenir au pool de cellules très immatures provenant du

donneur qui, suite à de nombreuses divisions cellulaires, perdraient rapidement le

colorant PKH2.

Dans le but d’étudier une éventuelle différenciation des cellules

en lymphocytes T ou B, nous avons transféré dans des souris Balb/c irradiées

à 650 rads ces cellules T B’ marquées au PKH2 (ces cellules provenaient d’un

receveur qui avait été irradié 5 jours plus tôt et repeuplé avec des cellules B J1 1D'°. A ce

moment la rate du receveur est constituée à 95% de ces cellules HSA''®^*”).

24, 48 et 72 heures après le transfert, les différents organes lymphoïdes du receveur sont

prélevés, les cellules sont colorées avec des anticorps spécifiques des cellules T ou des

cellules B.

L’expérience montre qu’on retrouve un pourcentage insignifiant (0.6%) de cellules

marquées au PKH2 dans le receveur. L’analyse des marqueurs de membrane de ces

cellules montre que ce sont des cellules T CD4^ radiorésistantes (0.2%) et des cellules B

HSA'° B220^ (0.4%) provenant vraisemblablement du premier donneur.

Les cellules HSA''^'^'^' T‘ B' ne se greffent pas dans un animal irradié,

probablement parce qu’elles ne possèdent pas de molécules d’adhésion ou d’antigène de

homing (L-selectin) leur permettant de traverser les veinules.

Par ailleurs, lorsqu’on transfère des cellules différenciées B220'^ HSA**' provenant d’un

individu irradié 2 semaines plus tôt, on constate que ces cellules se greffent

normalement dans le deuxième hôte irradié. Ceci suggère que les cellules immatures

HSA*'®'^*" non différenciées doivent subir une différenciation au sein du receveur irradié

avant d’être fonctionnelles dans un autre hôte irradié.

Figure 10: Evolution au cours du temps des différents marqueurs de cellules B

dans la rate de souriceaux Balb/c.

,7^

>

^ 'VVoWh^

v\

,_rA

_2T

60 jours

42

29

22

15

7

4

.*-K, _TV

TV

A

t

Intensité du HSA Intensité du B220

VQ

—————r

Intensité de l’IgM

60 jours

42

29

22

15

7

4

JN

KnW

>v

_{‘-t ,}

A.

Ml. "■“VrV

Intensité de l’IgD

Le phénotype des cellules apparaissant lors des repeuplements

d’individus irradiés: expression élevée de la molécule HSA, absence d’une quelconque

expression de molécules de surface spécifiques des cellules T ou B, absence de

molécules d’adhésion, est fort semblable au phénotype des cellules de rate de souris

nouveaux-nés.

Par analogie, nous avons donc transféré dans des hôtes irradiés des cellules de

souris très jeunes.

Dans une expérience préliminaire, nous avons suivi au cours du temps

l’apparition de certains marqueurs de surface des cellules B et T dans la rate et dans la

moelle de souriceaux Balb/c.

A la naissance, toutes les cellules de la rate des souriceaux expriment

intensément le marqueur HSA. Pendant la première semaine, un petit nombre de ces

cellules expriment des marqueurs de cellules B (B220, IgM). Ensuite on observe

l’apparition progressive de cellules T et B. Les premières cellules B qui apparaissent

expriment un taux élevé de HSA et d’IgM membranaire. Au cours du temps,

l’expression de HSA et d’IgM diminue. Après deux semaines, l’IgD membranaire

apparaît sur les cellules B, elles sont alors devenues des cellules B matures (figure

n“10).

- Lorsqu’on transfère dans des souris Balb/c adultes irradiées à 650 rads des

cellules de rate HSA''®'’'*" non différenciées provenant de jeunes souris âgées de 4 jours

et marquées au PKH2, elles se greffent très mal dans le receveur irradié. Dans la rate de

l’hôte, seulement 0,2 à 2% des cellules sont des cellules du donneur. Les cellules

implantées portent à la fois les marqueurs de surface HSA, B220, IgM et IgD et sont

donc les quelques cellules B matures présentes dans la rate du souriceau.

- Par contre lorsqu’on transfère des cellules de rate provenant de souris âgées

de 12 jours ou plus, on remarque qu’un pourcentage plus grand de cellules se greffe

dans la rate de l’hôte. Comme dans le cas précédant, seules les cellules qui expriment à

la fois les marqueurs IgM, IgD, B220 et HSA s’implantent.

Figure 11 : Evolution des marqueurs HSA et B220 des cellules de rate néonatale, de

rate ou de moelle d’un receveur irrardié ou de rate adulte dans un environnement

irradié.

Les histogrammes représentent le marquage des cellules du donneur 24 et 72 h.

Rate RX 14 j.

Moelle RX 14 j.

Rate adulte totale Intensité de HSA

72 h

24 h

72 h

24 h

- Lorsqu’on suit l’évolution des marqueurs de surface HSA et B220 des

cellules B marquées au PKH2, provenant de la rate ou de la moelle de souriceaux âgés

de 14 jours et transférées dans des hôtes irradiés, on observe un phénomène de

maturation de ces cellules B au sein de l’hôte irradié. On remarque que ces cellules qui

expriment fortement le marqueur HSA (cellules B HSA^') lors du transfert, deviennent

progressivement des cellules B HSA'°. Parallèlement, cette diminution d’intensité du

marqueur HSA s’accompagne d’une expression plus intense de la molécule B220 à la

surface de ces cellules B greffées.

Les cellules B immatures HSA^', B220'° se sont différenciées en quelques jours, au sein

de l’irradié en cellules B matures HSA"’®, B220*".

- Si on transfère des cellules hautement différenciées comme les cellules B

HSA'° par exemple, le phénotype des cellules du donneur ne subit pas de modification

dans l’hôte irradié. La figure n®ll résume l’évolution des marqueurs HSA et B220 du

donneur dans les différents cas décrits.

2. Vitesse de division des différentes populations lymphocytaires au sein

No documento Uma abordagem Lean às vertentes de logística, manutenção e produção na MEGATECH Industries Marinha Grande (páginas 68-77)