Contagens de bolores e leveduras

Utensílios de fabrico

Foram realizadas várias análises a alguns dos utensílios de fabrico do queijo, nomeadamente, formas de prensagem, tacos, formas de acidificação, tapetes transportadores do queijo para fora da salga e prateleiras das estruturas de cura. Estas análises foram

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realizadas, em triplicado, com o uso de zaragatoas esterilizadas segundo a ISO 18593:2004 [40].

Recolha das amostras

Este método de análise consiste em humedecer primeiro a zaragatoa no soluto de Ringer disposto num tubo de ensaio (10 mL) e friccioná-la sobre a superfície que se quer analisar, movendo primeiro horizontalmente e rodando a mesma para que todos os seus lados sejam usados. Deve-se percorrer uma área de tamanho conhecido, aproximadamente 100 cm2, ou seja, um quadrado de 10 cm de lado. Depois coloca-se a zaragatoa no tubo com o soluto, partindo a haste de plástico/madeira contra o tubo. As zaragatoas no fim são guardadas em ambiente de refrigeração e processadas no próprio dia, quando possível.

Plaqueamento

O processamento das zaragatoas foi realizado recorrendo ao plaqueamento das amostras. As placas de Petri já continham o meio YGC (Yeast Extract Glucose Chloramphenicol Agar), sendo este um meio próprio para a análise de leveduras e fungos filamentosos em leites, produtos lácteos, carnes e produtos derivados de carnes, peixes, mariscos, alimentos secos, produtos de chocolate, gelados e produtos congelados [41]. Após homogeneização do meio da zaragatoa, em condições de assepsia, transferem-se alíquotas de 0,2 mL para 5 placas de Petri, de modo a completar 1 mL. De seguida, com o auxílio de uma ansa esterilizada espalha-se a amostra no meio YCG. O passo que se segue é a incubação das placas realizada entre 20 a 25°C durante 5 dias.

Leitura das placas

Após a incubação, segue-se a leitura das mesmas, onde se contabilizam o número de leveduras e bolores. As leveduras apresentam-se com um tom esbranquiçado, de pequenas dimensões e com contornos nítidos. Enquanto que os bolores têm a tendência de serem maiores e mais difusos, com colorações diferentes (pretos, amarelos, verdes, etc.) devido à produção de pigmentos naturais. No caso de as amostras terem sido diluídas, o resultado final da contagem deve ser multiplicado pelo inverso da diluição correspondente. Os resultados desta análise são expressos em UFC/zaragatoa ou UFC/cm2 (UFC: Unidades Formadoras de Colónias).

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Queijos

Os queijos analisados foram aqueles sem qualquer tratamento antifúngico, isto é, sem natamicina e queijos com o tratamento mencionado. É importante referir que estes conjuntos de queijos devem ser da mesma produção, para que as condições de fabrico sejam as mesmas. O método para efetuar a contagem de bolores e leveduras à superfície dos queijos foi o mesmo método que se utilizou para analisar os utensílios de fabrico (ver método anterior).

Contudo, a meio do projeto foi implementado um novo método de análise, este foi facultado por um microbiólogo do Grupo Bel da Holanda. Este método é usado na Holanda para analisar o queijo Leerdammer (este queijo é livre de natamicina). Como referência, a contagem de leveduras deste produto insere-se no intervalo de valores entre 106 e 107 UFC / g de queijo, analisado com cerca de 29 dias de cura.

Em comparação com o método anterior, este trata-se de um método destrutivo. O procedimento deste método está assente nos próximos tópicos.

Recolha das amostras

Com uma faca esterilizada, corta-se uma fatia de queijo à superfície de 10 g. Coloca-se esta porção num frasco esterilizado de 250 mL e corta-se em pedaços mais pequenos com a faca esterilizada. Adiciona-se soluto de Ringer até completar 100 g. Agita-se esta mistura e deixa-se a dispersão repousar durante 5 minutos, agitando gentilmente de vez em quando.

Plaqueamento

A dispersão do queijo no frasco é considerada a primeira diluição decimal (10-1). Faz-se a segunda diluição decimal ao tirar 1 mL da dispersão para 9 mL de soluto de Ringer (10-2). Completa-se este procedimento até à sexta diluição. Coloca-se 0,2 mL da diluição pretendida numa placa de Petri com meio YGC e espalha-se a amostra com uma ansa esterilizada até esta ter sido absorvida pelo meio. De seguida, incubam-se as placas a 25 °C durante 5 dias.

Leitura das placas

Após a incubação, contam-se as colónias e diferenciam-se os bolores das leveduras. Ao resultado final, multiplica-se por 5 (a conversão de 0,2 mL numa placa para 1 mL de amostra é de fator 5). A este valor multiplica-se pelo inverso da diluição correspondente. Os resultados deste método são expressos em UFC / g de queijo.

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Nota: Quando o queijo a ser analisado encontra-se fatiado, retira-se para a análise apenas a “casca” de várias fatias.

A tabela que se segue representa as várias análises efetuadas (método da zaragatoa e método destrutivo) e o respetivo momento da sua execução.

Tabela 9 - Enumeração das análises realizadas.

Amostras Método de análise Contagem de bolores e leveduras Fabrico  Formas de prensagem  Tacos  Formas de acidificação

 Tapetes que transportam o queijo para fora da salga

Método da zaragatoa

Após a salmoura

 Queijos sem tratamento antifúngico (natamicina)

 Queijos com tratamento antifúngico (padrão)

Método da zaragatoa e método destrutivo

Cura

4 dias de cura

 Queijos sem tratamento antifúngico (natamicina)

 Queijos com tratamento antifúngico (padrão)

Método da zaragatoa e método destrutivo

7 dias de cura

 Queijos sem tratamento antifúngico (natamicina)

 Queijos com tratamento antifúngico (padrão) Método da zaragatoa e método destrutivo Observações até ao fim da data de validade

 Queijos sem tratamento antifúngico (natamicina)

 Queijos com tratamento antifúngico (padrão)

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Água da salga

Recolha e preparação das amostras

Com dois frascos de 250 mL esterilizados, recolhe-se uma amostra da água da salga e outra à saída do filtro. A amostra da água da salga é diluída segundo um fator de diluição de 3, enquanto que a restante amostra é analisada sem diluições. Prepara-se um sistema de filtragem por vácuo dentro de uma hotte, portanto liga-se a mangueira ao balão Erlenmeyer e liga-se a água, de forma a retirar o vácuo. Monta-se a rolha ao balão Erlenmeyer, coloca-se o filtro cuidadosamente com uma pinça e seguidamente o copo. Coloca-se no copo 1 mL da amostra da água da salga diluída e deixa-se filtrar. Adiciona-se 100 mL de água esterilizada e filtra-se de novo. Retira-se primeiro o copo e com uma pinça o filtro. Para analisar a outra amostra, a rolha, o copo e o filtro devem ser substituídos. No copo, coloca-se 1 mL da amostra da água da salga à saída do filtro e deixa-se filtrar. Junta-se 100 mL de água esterilizada e filtra- se novamente. Como descrito anteriormente, retira-se o copo e o filtro.

Plaqueamento

Em duas placas de Petri com meio YGC, coloca-se um filtro em cada uma das placas devidamente identificadas. De seguida, as placas são incubadas a 25 °C durante 5 dias.

Leitura das placas

Quando terminada a incubação segue-se a contagem dos bolores e leveduras. Em relação à placa da água da salga, ao número total de colónias deve ser multiplicado pela diluição correspondente, ou seja, por 103. A contagem da placa da água da salga à saída do filtro não é multiplicada pois não possui diluição. Os resultados são expressos por UFC/mL.