CROMATOGRAFIA LÍQUIDA

A cromatografia é um método de análise que apresenta ampla versatilidade destacando-se dentre outros, pois efetua separação, identificação e quantificação das substâncias químicas presente em uma mistura [48]. É uma técnica de separação baseada em um processo físico-químico e geralmente composta de dois componentes primários: a fase estacionária e a fase móvel gerando a distribuição da mistura pelas duas fases e a retenção seletiva na fase estacionária [48,49].

O princípio do processo de separação dos componentes de uma amostra por cromatografia e sua denominação são atribuídos ao russo Mikhael Semenovich Tswett em 1906. Desde então inúmeros progressos aconteceram no âmbito da cromatografia,

como o desenvolvimento de outras modalidades e várias modificações foram introduzidas à cromatografia líquida clássica utilizada por Tswett, caracterizando a cromatografia líquida moderna, inventada por Snyder e Kirkland com vantagens, segundo os autores, de ser mais conveniente, precisa, rápida e apta a realizar separações difíceis, sendo ilustrada esquematicamente na Figura 7 [48,50].

Figura 7 - Esquema básico de um sistema de cromatografia líquida com detector

espectrofotométrico e espectrometria de massas. Fonte: Baseado em NAUSHAD e

KHAN, 2014; MEYER, 2010 e SNYDER et al., 2010 [49,51,52].

Com isso, a denominada atualmente de cromatografia líquida de alta eficiência, CLAE, mais popularmente conhecida por HPLC, em inglês High Performance Liquid

Chromatography passou a ser um dos métodos analíticos mais utilizados para fins

qualitativos e quantitativos em menos de trinta anos. Tendo como razões para este crescimento a sua adaptabilidade para determinações quantitativas com boa sensibilidade, a possibilidade de separar espécies não voláteis e termicamente instáveis além de sua aplicação em determinações ambientais e em muitos outros campos da ciência [53].

A ampla variedade de combinações entre fases móveis e estacionárias torna esta técnica extremamente versátil e de grande aplicação. Quando utilizada para a identificação de compostos este dado é obtido através da comparação com padrões analíticos, permitindo também a purificação separando o analito de interesse de

Fase Móvel Bomba Misturador Amostra s Válvula de Injeção Fase Estacionária Lâmpada Detector Descarte Registrador TQD Espectrômetro de Massas

substâncias indesejadas [48]. A separação dos compostos de uma amostra pode ser realizada por um sistema com condições fixas (modo isocrático) ou por meio de uma composição variável da fase móvel durante a separação (modo gradiente) [54].

Hoje, compostos com concentrações em nível de traço chegando a partes por bilhão podem ser mais facilmente identificados e a HPLC está sendo muito aplicada para este fim em análises de alimentos, fármacos, cosméticos, matrizes ambientais, forense e produtos químicos industriais. Em 2004, a Waters®, realizou muitos avanços na instrumentação e tecnologia da coluna para alcançar aumentos mais significativos na resolução, na velocidade de análise e na sensibilidade na cromatografia líquida. Para tanto, surgiram fases estacionárias com tamanho de partículas menores (< 2 μm) e para empregar tais fases à instrumentação foram necessárias modificações que suportassem altas pressões para fluir a fase móvel e atingir este nível de eficiência, criando um novo sistema conhecido como cromatografia líquida de ultra eficiência (UPLC). Este sistema é baseado no mesmo princípio que a HPLC, ou seja, cromatografia de partição com um adsorvente de tamanho muito reduzido para aumentar a área superficial consequentemente a retenção [49].

No sistema UPLC em decorrência do aumento da eficiência, resolução e alta velocidade pode-se afirmar que a eficiência tem valores três vezes maior com colunas de 1,7 μm quando comparadas com aquelas de 5 μm. A resolução é 70% maior do que com colunas de 5 μm e 40% em colunas de 3,5 μm. A alta velocidade é obtida porque o comprimento da coluna é reduzido em um fator de 3 em relação as colunas de 5 μm e o fluxo pode ser três vezes maior. Portanto, as separações se tornam nove vezes mais rápidas com igual resolução, permitindo a obtenção de resultados mais rápidos com mais resolução, informação e robustez comportando a análise de mais amostras por sistema e analista [49].

No entanto, outro componente do sistema cromatográfico que contribui significativamente para a obtenção destas respostas é o detector. Existem diversos tipo de detectores disponíveis para a cromatografia líquida, em contrapartida, poucos são amplamente utilizados devido a limitações inerentes à técnica. Destacando-se os de absorção no UV-Vis, o índice de refração, a fluorescência e o espectrômetro de massas. Sendo o espectrômetro de massas de caráter universal, com boa sensibilidade além de possuir ruído bem reduzido, vem ampliando suas aplicações e números de usuários apesar do custo, tornando-se o detector mais promissor para a cromatografia líquida

fornecendo informações mais sensíveis em análises de traços, resíduos de agrotóxicos, contaminantes em alimentos entre outros [50].

Com o avanço das técnicas de separação e o seu respaldo na Química Analítica pela capacidade de realizarem análises qualitativas e quantitativas em amostras ambientais, farmacêuticas, biológicas e em alimentos, novas metodologias vem sendo desenvolvidas por cromatografia. Ampliando a necessidade de garantir a qualidade das medições químicas, através de sua comparabilidade, rastreabilidade e confiabilidade, realizada por meio do processo de validação [55]. Que segundo a ANVISA [56],

“A validação de determinado procedimento analítico objetiva demonstrar que o mesmo é adequado aos objetivos propostos, ou seja, que os parâmetros de desempenho avaliados atendem aos critérios de aceitação preconizados.”

Dessa forma, os parâmetros avaliados para validar um método analítico envolvem Especificidade/Seletividade, Linearidade, Sensibilidade, Exatidão, Precisão (repetitividade, precisão intermediária e reprodutividade), Limite de Detecção (LD) e Limite de Quantificação (LQ) [57]. Para tanto, testes ao longo do desenvolvimento da metodologia foram realizados com o intuito de atingir as especificações destes critérios, que serão posteriormente detalhados em correlação com os resultados obtidos neste trabalho, atingindo os objetivos propostos, descritos a seguir.

2. OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GERAL

O presente trabalho visa desenvolver uma metodologia simples e eficiente para a avaliação de resíduos de agrotóxicos em café torrado utilizando a técnica de extração por sonicação e clean-up por extração líquido-líquido e análise por cromatografia líquida de ultra eficiência (UPLC) acoplada a espectrometria de massas sequencial.

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

 Selecionar os agrotóxicos, de acordo com a utilização na cultura do café;

 Otimizar as condições cromatográficas para a análise simultânea dos agrotóxicos;  Desenvolver uma metodologia de extração;

 Desenvolver uma metodologia de clean-up;  Validar o método desenvolvido.

3. METODOLOGIA

3.1 REAGENTES

Acetonitrila grau Absolv (Tedia, EUA), diclorometano HPLC/SPECTRO (Tedia, EUA), água deionizada, adsorvente C18 (Agilent Tecnologies), Sílica gel 70-230

mesh (Tedia, Brasil)

3.2 MATERIAIS E EQUIPAMENTOS

Erlenmeyer (25 mL), Vials (40 mL), funil de vidro, béquer, tubo de ensaio de fundo cônico, seringa de vidro, balança analítica (Sartorius BL 2105), micropipetador automático (KASVI, China), lavadora ultrassônica (Unique USC-1400), agitador mecânico (IKA®), centrífuga (Universal).