MÉTODO DE EXTRAÇÃO

A determinação de resíduos de agrotóxicos envolve etapas como amostragem, preparo da amostra, extração dos analitos, clean-up (remoção dos interferentes) e pré- concentração para a posterior análise instrumental. Na maioria dos casos, alimentos e amostras ambientais não podem ser analisados diretamente, o que exige a execução destas etapas que caracterizam a metodologia de extração, permitindo desta forma a identificação e detecção dos baixos níveis dos agrotóxicos nestas matrizes complexas [3,32].

Diversos métodos de extração e quantificação estão sendo utilizados para determinar resíduos de agrotóxicos em alimentos. Visando sempre métodos com características como baixo custo, facilidade e aplicabilidade a diferentes matrizes [33,34]. Além disso, são necessários alguns cuidados durante a execução do método selecionado, pois a determinação de resíduos de agrotóxicos é complexa e com várias etapas que podem afetar o resultado final, podendo ser citados como alguns destes cuidados:

I. A amostra tem que ser homogênea e representativa, isto é, ter uma composição química que se assemelhe ao máximo com a composição média da totalidade do objeto de estudo.

II. O isolamento e/ou enriquecimento de analitos alvos tem que ser realizado de forma a obter a transferência de analitos a partir da matriz primária com remoção simultânea dos interferentes e aumento da concentração dos analitos a níveis acima do limite de determinação da técnica analítica aplicada.

III. Emprego adequado de um método de limpeza, em decorrência da evolução dos métodos empregados na determinação de multi-resíduos de agrotóxicos, com isso diferentes classes e propriedades físico-químicas, o que torna a etapa de

clean-up quase sempre necessária.

Desta forma, para garantir uma eficiente determinação de multi-resíduos de agrotóxicos em alimentos, diferentes técnicas de limpeza são aplicadas. Estas técnicas em alguns trabalhos realizados nos últimos anos foram utilizadas de forma combinada, como nos trabalhos de MUKHERJEE, 2009 [35] (extração líquido-líquido e extração em fase sólida (em inglês, SPE, Solid Phase Extraction)), de HERCEGOVÁ el al, 2005 [36] (extração sólido líquido por sonicação e SPE) e de BLASCO et al., 2005 [37] (extração com líquido pressurizado (em inglês, PLE, Pressurized Liqui Extraction) e

dispersão de matriz em fase sólida (em inglês, MSPD, Matrix Solid Dispersive

Extraction)). Assim, o desenvolvimento de novas metodologias utilizando diversas

técnicas de extração para a redução de interferentes vem se tornando uma prática comum [38-42]. Esta ideia foi utilizada no presente trabalho buscando aliar o método de extração por sonicação com a extração líquido-líquido como clean-up.

Utilizando os grãos de café como matriz poucos trabalhos desenvolveram metodologias para a determinação de resíduos de agrotóxicos. No geral, a aplicação de métodos de extração nos grãos de café visa substâncias como cafeína, trigonelina e ácido nicotínico, que são as responsáveis pelas principais características desta

commodity como sabor, aroma e cor.

Desta forma, um dos trabalhos que desenvolveu uma metodologia para a determinação de 69 agrotóxicos de diferentes grupos químicos em café foi realizado por YANG et al., 2010 [3]. Neste trabalho os autores utilizaram extração líquido líquido para obter uma fração representativa da amostra, aplicando a este extrato uma etapa de

clean-up por cromatografia com permeação em gel separando a fração entre 4-15

minutos, realizando outro clean-up por meio da técnica SPE com cartuchos Envi-Carb® acoplado aos cartuchos de NH2-LC. Por fim, a análise instrumental foi realizada

cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas. Outro trabalho que desenvolveu uma metodologia para a análise de multi-resíduos de agrotóxicos em 15 amostras de cafés brasileiros foi realizado por DIAS et al., 2013 [38] aplicando

QuEChERS para a extração e análise em LC-MS/MS.

Contrastando com outras publicações da literatura que utilizam o café, não necessariamente torrado, foi notada a presença de trabalhos com diversas técnicas de extração como, MSPD, sonicação, QuEChERS, entre outras, alguns com etapa de clean-

up, como pode ser visto na Tabela 6. Destacando SALINAS-VARGAS e CAÑIZARES-

MACÍAS, 2014 [39] que tiveram como objetivo a elaboração de uma metodologia aplicando a técnica de extração sólido líquido por sonicação para obter um extrato que foi submetido a um clean-up com um sistema de SPE on-line visando a determinação da cafeína, a qual foi uma das referências do presente estudo em decorrência da técnica de extração ser rápida e eficiente na preparação da amostra [40].

Em suma, nenhum trabalho agregando a utilização da matriz café torrado, o método de extração por sonicação e clean-up com LLE para a determinação de multi- resíduos de agrotóxicos com análise instrumental por cromatografia líquida/ espectrometria de massas foi encontrado. A Tabela 6 mostra trabalhos com café e

matrizes semelhantes, reunindo algumas técnicas que podem ser utilizadas para o desenvolvimento da metodologia de extração e análise instrumental deste trabalho.

Tabela 6 - Alguns trabalhos com técnicas de extração combinadas e amostras sólidas.

REFERÊNCIA MATRIZ ANALITO

MÉTODO DE EXTRAÇÃO CLEAN-UP ANÁLISE INSTRUMENTAL ALVES e BRAGAGNOLO, 2002 [41] Chás Teobromina, Teofilina, Cafeína LLE SE - Espectrofotômetro HPLC-UV/Vis ALVES et al., 2006 [42] Café torrado Ácido nicotínico, trigonelina, ácido clorogênico e cafeína SE - HPLC-UV/Vis DIAS et al., 2013 [38] Café arábica Multi-resíduos de agrotóxicos QuEChERS _{- LC-MS/MS} PIZZUTTI et al., 2012 [2] Grãos de café

verdes 51 Agrotóxicos SE-agitação QuEChERS GC–MS (NCI-SIM)

SALINA-VARGAS E CAÑIZARES- MACÍAS, 2014 [39] Grãos de café verdes e torrados Cafeína SE-Sonicação On-line SPE Mini-coluna de C18 UV-vis SOARES et al., 2010 [43] Café moído torrado, descafeinado, instantâneo e misturado com cereais Acrilamida MSPD SPE GC-MS YANG, et al.,2010

[3] Grão de Café 69 Agrotóxicos LLE

GPC SPE GC-MS ZHAO et al., 2011 [44] Chás verde, verde pu-ehr e branco 18 compostos do chá SE-Sonicação - UPLC/DAD/MS

1.3.1 Método de Extração Sólido Líquido por Sonicação

O uso da energia ultrassônica em meios líquidos e sólidos tem sido extenso em aplicações nos processos alimentícios e tem incentivado a utilização em tratamento de amostras, durante muitos anos. Seus efeitos mecânicos provêm de uma maior penetração do solvente no material celular o que aumenta a transferência de massa devido aos efeitos de micro-fluxos gerados pelas ondas. Durante o processo de sonicação ondas longitudinais são criadas quando a onda sônica entra em contato com um meio líquido, criando regiões alternadas de ondas de compressão e rarefação induzidas em moléculas do meio caracterizando o processo de cavitação [40,45] visto detalhadamente na Figura 5.

Figura 5 - Processo de cavitação.Fonte: SEIDI e YAMINI (2012) [46].

Estas ondas que caracterizam o ultrassom são ondas mecânicas que precisam de um meio elástico para se propagar, podendo ter baixa ou alta intensidade. Esta pode alterar as propriedades físicas ou químicas do alimento e tem entre outras aplicações a capacidade de acelerar e melhorar a eficiência do preparo da amostra. Com isso o uso de ultrassom com alta intensidade/baixa frequência (16-100 kHz) é mais frequente [47].

Dessa forma, o processo de cavitação com o ciclo de formação, crescimento e colapso implosivo de vacúolos de gás em solução, vistos na Figura 5, caracteriza o procedimento de extração. Que tem o aumento da cavidade dependente da intensidade da onda sonora, podendo ocorrer o colapso como uma compressão adiabática e gerar altas temperatura e pressão. A alta temperatura resulta em uma maior solubilidade dos analitos no solvente extrator e a difusividade dos analitos da matriz para a região externa. Já o aumento da pressão favorece a penetração do solvente extrator na matriz e o transporte entre a matriz sólida e a fase líquida na interface, mecanismo este demonstrado na Figura 6 [45,47].

Este método de extração sólido-líquido também denominado de “lixiviação” é ditado por mecanismos de solubilidade e fenômenos de transporte, além disso, possui três etapas cruciais:

I. O solvente extrator é colocado em contato com a superfície e com o interior da matriz iniciando o processo de extração;

II. Os analitos retidos serão removidos por deslocamentos dos sítios ativos da matriz seja por maior afinidade e/ou concentração das moléculas do solvente. III. Os analitos serão transportados do interior da matriz para a superfície

essencialmente por forças de difusão e fora da matriz por forças principalmente de convecção, a lixiviação fornecida é executada em modo dinâmico.

Com isso o mecanismo de lixiviação envolve alguns efeitos como o colapso dos vacúolos formados na proximidade da superfície sólida produzindo micro-fluxos de alta velocidade que corroem a superfície e podem aumentar as taxas de transporte e a área superficial; ocorre também a fragmentação das partículas através da colisão que aumenta a superfície de contato e facilita a penetração do solvente extrator no interior da matriz. E ainda a transmissão acústica promove a interrupção da camada de difusão na superfície e a energia ultrassônica facilita a difusão das substâncias analisadas para a zona externa [45].

Figura 6 - Mecanismo de extração/lixiviação por sonicação (a) na ausência e (b) na

presença das ondas ultrassônicas. Fonte: CASTRO e CAPOTE (2007) [45].

A prolixidade do método de extração sólido-líquido por sonicação pode ser verificada na Tabela 6 com sua utilização como uma etapa de preparo de diferentes amostras para um posterior método de extração, bem como sua aplicação em metodologias de extração de compostos orgânicos e inorgânicos. Contudo esta técnica possui hifenizações a exemplo da UMAE (extração assistida por microondas e ultrassom), IL-UMAE (extração assistida por microondas e ultrassom com líquidos iônicos), USASFE (extração por fluido supercrítico assistida por ultrassom), entre outros exemplos encontrados na literatura garantindo uma ampla aplicação deste método para as mais diversas matrizes [46].