Desenvolvimento de metodologia para avaliação de resíduos de agrotóxicos em café torrado

Texto

(1)UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA. NICAELLEN ROBERTA DA SILVA SOUZA. DESENVOLVIMENTO DE METODOLOGIA PARA AVALIAÇÃO DE RESÍDUOS DE AGROTÓXICOS EM CAFÉ TORRADO. DEVELOPMENT OF METHOD FOR EVALUATION OF PESTICIDES RESIDUES IN ROASTED COFFEE.

(2) UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA NICAELLEN ROBERTA DA SILVA SOUZA. DESENVOLVIMENTO DE METODOLOGIA PARA AVALIAÇÃO DE RESÍDUOS DE AGROTÓXICOS EM CAFÉ TORRADO Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Química, da Universidade Federal de Sergipe, para a obtenção do título de Mestre em Química.. Orientador: Prof. Dr. Sandro Navickiene. DEVELOPMENT OF METHOD FOR EVALUATION OF PESTICIDES RESIDUES IN ROASTED COFFEE Master Dissertation presented to the Graduate Program in Chemistry of the Federal University of Sergipe to obtain MSc. in Chemistry..

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(5) RESUMO A agricultura é uma das principais atividades econômicas do Brasil, possuindo a cultura do café como sua principal commodity primária. A fim de atingir altos níveis de produção e evitar a perda das safras, insumos agrícolas como os agrotóxicos são utilizados em grandes quantidades. Este tipo de prática e o aumento da preocupação do público consumidor estão motivando investigações científicas a respeito destes tópicos, com o intuito de garantir a segurança alimentar dos produtos fornecidos para o consumo. No entanto, a literatura não relata metodologias para a determinação de resíduos de agrotóxicos no café torrado, com os métodos de extração e análise propostos, que segundo dados bibliográficos apresentam resíduos destas substâncias mesmo após a torrefação. Neste contexto, o presente trabalho buscou desenvolver uma metodologia. analítica. para. determinar. carbofurano,. cipermetrina,. clorpirifós,. clotianidina, dissulfotom, endosulfan, espirodiclofeno, haloxifope, imidacloprido, tebuconazol, triadimefom e triadimenol em café torrado empregando método de extração sólido líquido por sonicação com etapa de clean-up por meio de extração líquido líquido (LLE) e análise instrumental por cromatografia líquida de ultra eficiência acoplada a detector por espectrometria de massas (LC-MS/MS). Para tanto, a otimização das condições cromatográficas e a avaliação do melhor método de clean-up foram realizadas. Com isso, as condições de melhor resposta quantitativa foi obtida com 0,5 g de café torrado, 5 mL de solvente de extração por sonicação, 1 mL de água e 1 mL de diclorometano na etapa de clean-up por LLE. Durante o procedimento de validação no LC-MS/MS foi observado efeito matriz positivo para todos os analitos com exceção da cipermetrina na qual houve supressão do sinal pela matriz, ocasionando, com base na curva preparada no extrato, recuperações entre 74,2% - 102,4%, com desvio padrão relativo entre 0,6% e 10,2%, nos níveis de concentração avaliados no processo, além disso, a linearidade obtida foi na faixa de 0,9979 a 0,9998 para os agrotóxicos, carbofurano, clotianidina dissulfotom, imidacloprido, tebuconazol, triadimefom e triadimenol, garantindo a eficiência da metodologia. Palavras-chave: café torrado; Coffea arabica; agrotóxicos; pesticidas; sonicação; ultrassom; LLE; HPLC/ UV-DAD; UPLC/ UV-DAD; LC-MS/MS..

(6) ABSTRACT. Agriculture is one of the main economic activities of the Brazil, possessing the culture of coffee as their main primary commodity. In order to achieve high levels of production and prevent the loss of crops, farm inputs such as pesticides are used in large quantities. This type of practice and the increased public concern consumer are motivating scientific research about these topics, with the aim of ensuring food safety of products supplied for consumption. However, the literature does not report methodologies for the determination of pesticide residues in roasted coffee, with the methods of extraction and analysis proposed, which according to bibliographic data present residues of these substances even after roasting. In this context, the present study sought to develop an analytical methodology to determine carbofuran, cypermethrin,. chlorpyrifos,. clothianidin,. disulfoton,. endosulfan,. spirodiclofen,. haloxyfop, imidacloprid, tebuconazole, triadimenol and triadimefom in roasted coffee using solid liquid extraction method by sonication with clean-up step through liquid liquid extraction (LLE) and instrumental analysis for ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry detector (LC-MS/MS). For both, the optimization of chromatographic conditions and assessing the best method of clean-up was carried out. With that, the conditions for better quantitative response was obtained with 0.5 g of roasted coffee, 5 mL extraction solvent by sonication, 1 mL of water and 1 mL of dichloromethane in the clean-up by LLE. During the validation procedure in LCMS/MS positive matrix effect was observed for all analytes except of cypermethrin in which there was suppression of the signal by array, causing, prepared in the curvebased extract, recoveries between 74.2%-102.4% standard relative deviation (SRD) between 0.6% and 10.2%, in levels concentration assessed in the process, Furthermore, the linearity obtained was in the range of 0.9979 to 0.9998 for pesticides , carbofuran, disulfoton, imidacloprid, clothianidin tebuconazole, triadimenol, triadimefom and ensuring the efficiency of the methodology.. Keywords: Sonication, pesticides, roasted coffee, Coffea arabica, LLE; HPLC/ UVDAD; UPLC/ UV-DAD; LC-MS/MS..

(7) Aos meus pais Mª Quitéria e Natalício, meus tios e minha irmã Natalilian, dedico este trabalho..

(8) O sucesso nasce do querer, da determinação e persistência em se chegar a um objetivo. Mesmo não atingindo o alvo, quem busca e vence obstáculos, no mínimo fará coisas admiráveis. (José de Alencar).

(9) AGRADECIMENTOS. A Deus pela força e dom da vida. A minha família, principalmente meus pais Natalício e Quitéria e minha irmã Natalilian pelo apoio e paciência. Ao meu orientador Prof. Dr. Sandro Navickiene pelos anos de orientação, me concedendo a oportunidade de adquirir conhecimento e experiência nas áreas de Química Analítica e Cromatografia. Aos amigos integrantes do LCP (antigos e novos) que também colaboraram com o desenvolvimento deste trabalho, em especial aos pertencentes ao grupo do Prof. Dr. Sandro, Fabricio, Mônica, Ruyanne, Danilo e Édica. Aos amigos do LEMON, principalmente, Bruno, Tassya, Jany Hellen, que também contribuíram com trocas de ideias e experiência. Aos amigos da pós-graduação. Aos meus amigos da vida, que estão sempre presentes, independente de qualquer coisa. Aos professores do DQI/UFS pela minha formação acadêmica. A comissão examinadora por aceitar participar da minha defesa. A Universidade Federal de Sergipe, ao Departamento de Química e ao Programa de Pós-Graduação em Química. Ao CNPq pelo apoio financeiro. Enfim, gostaria de agradecer a todos que contribuíram de alguma maneira e que não foram aqui mencionados. Obrigada a todos!.

(10) LISTA DE FIGURAS Figura 1 - Maiores exportadores mundiais de café. Fonte: Maps of World (2011) [7].................................................................................................................. 21 Figura 2 - Gráfico da composição do café em diferentes condições. Fonte: Oestreich-Janzen, 2010 [15]. ....................................................................... 23 Figura 3 - Principais pragas do cafezal (a) broca-do-café, Hypothenemus hampei e (b) Bicho-mineiro, Leucoptera coffeella. Fonte: Souza et.al, 2011 [23]............................................................................................................... 25 Figura 4 - Outras pragas do cafezal: (a) Ácaro vermelho Tetranychus evansi; (b) Lagarta dos cafezais, Eacles imperialis magnifica. Fonte: Mesquita. ........ 25 Figura 5 - Processo de cavitação. Fonte: SEIDI e YAMINI (2012) [51]. .................... 38 Figura 6 - Mecanismo de extração/lixiviação por sonicação (a) na ausência e (b) na presença das ondas ultrassônicas. Fonte: CASTRO e CAPOTE (2007) [50]. .................................................................................................. 40 Figura 7 - Esquema básico de um sistema de cromatografia líquida com detector espectrofotométrico e espectrometria de massas. Fonte: Baseado em NAUSHAD e KHAN, 2014; MEYER, 2010 e SNYDER et al., 2010 [54,56,57]..................................................................................................... 41 Figura 8 - Fluxograma utilizado para preparar as soluções de trabalho dos agrotóxicos em estudo seguido da elaboração das soluções analisadas para a obtenção das curvas analíticas. ......................................................... 46 Figura 9 - Café torrado moído e homogeneizado. ......................................................... 50 Figura 10 - Procedimento de extração da amostra de café torrado. .............................. 51 Figura 11 - Cromatograma da análise exploratória dos analitos em estudo no SISTEMA 1 (HPLC-DAD) .......................................................................... 53 Figura 12 - Espectros de absorção indicando o comprimento de onda de máxima absorção avaliados no SISTEMA 1. ............................................................ 55 Figura 13 - Cromatogramas dos extratos por sonicação utilizando ACN (preto) e DCM (vermelho) como solvente extrator. ................................................... 57 Figura 14 - Cromatogramas da Proposta 1 de clean-up, em vermelho o primeira fração e em preto o interferente retido seguindo as condições da Tabela 7 no SISTEMA 1. ............................................................................ 58.

(11) Figura 15 - Cromatogramas do método da Proposta 2, em vermelho o extrato e em preto o branco do adsorvente seguindo as condições da Tabela 7 no SISTEMA 1. ........................................................................................... 59 Figura 16 - Sobreposição dos cromatogramas da Proposta 2 com adsorvente C18 em vermelho e com a sílica em preto seguindo as condições da Tabela 7 no SISTEMA 1. ........................................................................................ 59 Figura 17 - Cromatogramas com a comparação dos extratos oriundo da Proposta 2 com o adsorvente C18 por sonicação na cor preta e por agitação na cor vermelha seguindo as condições da Tabela 7 no SISTEMA 1. ............. 60 Figura 18 - Cromatogramas da análise do extrato fortificado por sonicação utilizando a sílica (preto) e da solução conjunta dos agrotóxicos seguindo as condições da Tabela 7 no SISTEMA 1. ................................... 60 Figura 19 - Cromatogramas da análise da influência do solvente extrator Diclorometano no método de extração, sendo o volume de 1 mL em vermelho, 2 mL em preto e 3 mL em azul e a solução de comparação dos agrotóxicos em verde, utilizando o SISTEMA 1 e condições descritas na Tabela 7. ................................................................................... 62 Figura 20 - Cromatogramas das análises das amostras contaminadas utilizando a metodologia de extração da Proposta 3 e o SISTEMA 1 de análise nas condições da Tabela 7. Em vermelho, preto e azul constam os extratos com diferentes volumes de Diclorometano e em verde a solução conjunta dos agrotóxicos. ............................................................................ 62 Figura 21 - Cromatograma da análise exploratória dos agrotóxicos estudados a partir de uma solução conjunta em 25 ug mL-1, utilizando a fase estacionária composta por C18 e um fluxo de 0,6 mL min-1. ....................... 63 Figura 22 - Espectros de absorção em detector UV/Vis com arranjo de fotodiodos dos agrotóxicos em estudo. Em vermelho a varredura dada pelo SISTEMA 2, em preto para o SISTEMA 1. ................................................ 64 Figura 23 - Comparação de diferentes fluxos por meio de solução padrão dos agrotóxicos em 25 µg mL-1. O primeiro cromatograma corresponde ao fluxo de 0,3 mL min-1, o segundo de 0,6 mL min-1 e o terceiro de 0,7 mL min-1 utilizando gradiente de eluição em análise exploratória na coluna BEH C18. .......................................................................................... 67.

(12) Figura 24 - Esquema da estrutura das fases estacionárias testadas no trabalho. Fonte: (WATERS) [65] ............................................................................... 68 Figura 25 - Comparação do perfil dos picos nos cromatogramas obtidos da análise da solução conjunta dos agrotóxicos em 25 µg mL-1 com as diferentes fases estacionárias, o primeiro cromatograma corresponde à coluna BEH C18, o segundo corresponde à resposta da coluna CSH Phenyl-Hexyl e o último gráfico à HSS CN em gradiente de eluição em análise exploratória com vazão de 0,6 mL min-1. .................................. 69 Figura 26 - Cromatogramas da solução conjunta dos analitos em 10µg mL-1 comparando diferentes gradientes presentes na Tabela 9 utilizados para a otimização do programa de eluição dos analitos, utilizando a coluna CSH Phenyl-Hexyl, vazão de 0,6 mL min-1 e volume de injeção de 10 µL. ......................................................................................... 70 Figura 27 - Cromatogramas das análises da solução conjunta dos agrotóxicos com concentração de 10µg mL-1 para a otimização do tempo de equilíbrio, onde (a) 2,62 minutos, (b) 5,00 minutos, (c) 6,60 minutos e (d) 10 minutos. ............................................................................................. 73 Figura 28 - Otimização do volume de injeção, teste envolvendo a redução de 10 (preto) para 5 µL (vermelho) com o gradiente do tópico III da seção 4.2.1 e tempo de equilíbrio do tópico IV da seção 4.2.1 utilizando a solução conjunta dos analitos. ..................................................................... 74 Figura 29 - Otimização do volume de injeção, análises com volumes de 2,5 a 0,5 µL nas condições estabelecidas anteriormente presentes na Tabela 7 e Tabela 8. ...................................................................................................... 75 Figura 30 - Cromatogramas das fases (a) ACN: H2O e (b) ACN: DCM obtidas pela metodologia de extração da Proposta 3 da seção 4.1.2.1 seguindo as condições cromatográficas do SISTEMA 2 presentes na Tabela 7......... 76 Figura 31 - Cromatogramas da extração por sonicação e clean-up por LLE (Proposta 3), em verde - amostra testemunha, vermelho - fortificado, marrom - solução de comparação e em preto - solução dos padrões, obtidos pelas condições otimizadas da Tabela 7 no SISTEMA 2. .............. 76 Figura 32 - Gráfico com valores de recuperação no nível de 2μg mL-1(n = 2). ............ 77 Figura 33 - Gráfico com os valores de intensidades obtidos pelo teste de degradação dos agrotóxicos. ........................................................................ 78.

(13) Figura 34 - Cromatogramas obtido com a sonicação utilizando acetonitrila e diclorometano como solventes extratores. Seguindo as condições cromatográficas da Tabela 7 para o SISTEMA 2, onde o cromatograma em preto corresponde ao extrato com diclorometano, em vermelho com Acetonitrila, em verde, o Branco da amostra e em azul, a Solução Conjunta dos Agrotóxicos em 10µg mL-1. ......................... 79 Figura 35 - Dados de recuperação utilizando acetonitrila e diclorometano como solvente extrator na sonicação (n = 2). Intensidade utilizadas foram obtidas através das condições cromatográficas da Tabela 7 ........................ 79 Figura 36 - Cromatogramas referentes à otimização do solvente de clean-up, onde (a) Acetato de Etila, (b) Clorofórmio e (c) Diclorometano. No cromatograma em vermelho a resposta equivalente ao Branco, em preto ao Fortificado e em azul a Solução de Comparação, todas as análises de acordo com as condições da Tabela 7. ...................................... 81 Figura 37 - Valores de recuperação obtidos através das análises cromatográficas (n = 2) segundo a Tabela 7, evidenciando os solventes de clean-up utilizados na otimização do método. ........................................................... 82 Figura 38 - Dados de recuperação do teste realizado para verificar a influência da ordem dos solventes utilizados no clean-up, separados com as condições cromatográficas da Tabela 7. ...................................................... 83 Figura 39 - Fragmentos utilizados para a quantificação e confirmação dos dados quantitativos das amostras analisadas no SISITEMA 3 segundo as condições da Tabela 7. ................................................................................. 84 Figura 40 - Cromatograma dos íons de quantificação dos agrotóxicos avaliados utilizando as condições cromatográficas descritas nas Tabelas 7 e 8. ......... 88 Figura 41 - Cromatograma da análise do extrato fortificado na concentração de 0,1 mg mL-1 com detector espectrofotométrico em 220 nm, seguindo as condições de análise descritas nas Tabelas 7 e 8..................................... 88 Figura 42 - Representação gráfica dos valores de recuperação dos agrotóxicos com seus respectivos desvios padrão presentes na Tabela 15 para os quatro níveis de concentração avaliados...................................................... 96.

(14) LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Composição do café arábica torrado. Fonte: [10] .........................................21 Tabela 2 - Classificação dos agrotóxicos selecionados para o trabalho quanto ao grupo químico, ao modo de ação, à classe toxicológica e fórmula estrutural. Fonte: Agência de Vigilância Sanitária [25]............................... 27 Tabela 3 - Limites máximos de resíduos para os agrotóxicos selecionados na cultura do café. Fonte: [26,25] .....................................................................30 Tabela 4 - Modo de aplicação dos agrotóxicos e produtos comerciais utilizados na cafeicultura. Fonte: [28] ............................................................................... 31 Tabela 5 - Características físico-químicas dos agrotóxicos em estudo. Fonte: [32,33,34,35]................................................................................................. 32 Tabela 6 - Alguns trabalhos com técnicas de extração combinadas e amostras sólidas. ..........................................................................................................37 Tabela 7 - Condições de análise nos sistemas cromatográficos utilizados. .................... 48 Tabela 8 - Gradientes de eluição para cada sistema cromatográfico utilizado. .............. 49 Tabela 9 - Composições dos gradientes de eluição dos cromatogramas apresentados na Figura 26. ...........................................................................71 Tabela 10 - Parâmetros otimizados no SISTEMA 3 (UPLC-MS/MS) .......................... 87 Tabela 11 - Equação da reta e coeficientes de correlação da análise dos agrotóxicos em um intervalo linear de 0,01 a 10 μg mL-1. Obtidos através. dos. valores. de. intensidade. fornecidos. pela. análise. cromatográficas segundo a Tabela 7 e a Tabela 8 no SISTEMA 2 (n = 3). .................................................................................................................. 89 Tabela 12 - Equação da reta e coeficientes de correlação da análise dos agrotóxicos em um intervalo linear de 0,01 a 1,0 mg L-1. Obtidos através. dos. valores. de. intensidade. fornecidos. pela. análise. cromatográficas segundo a Tabela 7 e a Tabela 8 no SISTEMA 3 (n = 3). .................................................................................................................. 90 Tabela 13 - Equação da reta e coeficientes de correlação da análise dos agrotóxicos preparados no extrato da matriz em um intervalo linear de 0,01 a 1,0 mg L-1. Dados obtidos através dos valores de intensidade fornecidos pela análise cromatográficas segundo a Tabela 7 e a Tabela 8 no SISTEMA 3. ......................................................................................... 92.

(15) Tabela 14 - Valores das razoes dos coeficientes angulares das curvas analíticas preparadas no extrato da matriz e no solvente. ............................................. 92 Tabela 15 - Valores de desvio padrão e coeficiente de variação dos agrotóxicos estudados.......................................................................................................94 Tabela 16 - Valores do limite de detecção dos agrotóxicos de trabalho. ....................... 97.

(16) LISTA DE ABREVIATURAS ACN - Acetonitrila AGROFIT - Sistema de Agrotóxicos Fitossanitários ANVISA - Agência de Vigilância Sanitária. CBN - Carbofurano CIP - Cipermetrina CLF - Clorpirifós CTD - Clotianidina DCM - Diclorometano DDD - Diclorodifenildicloroetano DIS – Dissulfotom END - Endosulfan EPA - Agência de Proteção Ambiental ESI - Electrospray Ionization (Ionização por Eletronebulização) ESP - Espirodiclofeno GC-MS - Gas Chromatography Mass Spectrometry (Cromatografia Gasosa/ Espectrometria de Massas) GC-MS (NCI-SIM) - Gas Chromatography-Negative Chemical Ionization Mass Spectrometry In Selective Ion Monitoring Mode (Cromatografia Gasosa/ Espectrometria de Massas com Ionização Química Negativa no Modo De Monitoramento de Íon Seletivo) GPC - Gel Permeation Chromatography (Cromatografia com Permeação em Gel) HLX - Haloxifope HPLC - High Performance Liquid Chromatography (Cromatografia Líquida de Alta Eficiência) HPLC-UV/Vis - High Performance Liquid Chromatography coupled with detector UV/Vis. (Cromatografia. Líquida. de. Alta. Eficiência. com. Detector. no. Ultravioleta/Visível) ICC - International Coffee Corporation (Coorporação Internacional do Café) IL-UMAE - Ionic Liquids Based Simultaneous Ultrasonic and Microwave Assisted Extraction (Extração Assistida por Ultrassom e Microondas Simultaneamente com Líquidos Iônicos) IMD - Imidacloprido.

(17) LC-MS/MS - Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry (Cromatografia Líquida acoplada à Espectrometria de Massas/Massas) LLE - Liquid- Liquid Extraction (Extração Líquido-Líquido) MAPA - Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento MMA - Ministério do Meio Ambiente. MSPD - Matrix Solid Phase Dispersion (Dispersão de Matriz em Fase Sólida) PLE - Pressurized Liquid Extraction (Extração com Líquido Pressurizado) QuEChERS - Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged and Safe SE – Solid Extraction (Extração de Matriz Sólida) SPE - Solid Phase Extraction (Extração em Fase Sólida) TBC - Tebuconazol TDF - Triadimefom TDN - Triadimenol TQD - Triple Quadrupole Detector (Detector Triplo Quadrupolo) UMAE - Ultrasonic and Microwave Assisted Extraction (Extração Assistida por Microondas e Ultrassom) UPLC - Ultra Performance Liquid Chromatography (Cromatografia Líquida de Ultra Eficiência) USASFE - Ultrasound assisted supercritical fluid extraction (Extração com fluido supercrítico assistida por ultrassom).

(18) SUMÁRIO 1.. INTRODUÇÃO .................................................................................................... 20 1.1 CAFÉ (COFFEA ARABICA E COFFEA CANEPHORA) ................................................. 20 1.2 AGROTÓXICOS NA CAFEICULTURA .......................................................... 24 1.2.1. Agrotóxicos Envolvidos neste Trabalho ..................................................... 30. 1.3 MÉTODO DE EXTRAÇÃO............................................................................... 35 1.3.1. Método de Extração Sólido Líquido por Sonicação................................... 38. 1.4 CROMATOGRAFIA LÍQUIDA ........................................................................ 40 2.. OBJETIVOS ......................................................................................................... 44 2.1 OBJETIVO GERAL ........................................................................................... 44 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS.............................................................................. 44. 3.. METODOLOGIA................................................................................................. 45 3.1 REAGENTES ..................................................................................................... 45 3.2 MATERIAIS E EQUIPAMENTOS ................................................................... 45 3.3 PADRÕES DOS AGROTÓXICOS E SOLUÇÕES ............................................. 45 3.4 SELEÇÃO DOS AGROTÓXICOS EM ESTUDO ............................................. 47 3.5 CONDIÇÕES CROMATOGRÁFICAS DE ANÁLISE ..................................... 47 3.6 OBTENÇÃO E ACONDICIONAMENTO DA AMOSTRA DE CAFÉ TORRADO ......................................................................................................... 50 3.7 METODOLOGIA DE EXTRAÇÃO .................................................................. 50 3.7.1. Fortificação das Amostras Para a Extração .............................................. 50. 3.7.2. Procedimento de Clean-up ......................................................................... 50. 3.8 LIMPEZA DOS MATERIAIS ............................................................................ 51 3.9 DESCARTE DE RESÍDUOS DOS REAGENTES ............................................ 52 4.. RESULTADOS E DISCUSSÃO ......................................................................... 53 4.1 SISTEMA CROMATOGRÁFICO 1 (HPLC-DAD) ........................................... 53 4.1.1. Otimização das Condições de Análise ....................................................... 53. 4.1.1.1 4.1.2. Seleção dos comprimentos de onda de máxima absorção .................. 54. Otimização do método de extração ............................................................ 57. 4.1.2.1. Procedimento de seleção do método de clean-up ............................... 58. 4.2 SISTEMA CROMATOGRÁFICO 2 (UPLC-DAD) ........................................... 63.

(19) 4.2.1. Parâmetros Avaliados no Sistema UPLC-DAD (SISTEMA 2)................... 67. 4.2.2. Avaliação da Metodologia no SISTEMA 2 (UPLC-DAD) ......................... 75. 4.2.3. Otimização da Metodologia de Extração no SISTEMA 2 .......................... 77. 4.3 SISTEMA CROMATOGRÁFICO 3 (LC-MS/MS)............................................. 83 4.4 VALIDAÇÃO..................................................................................................... 89 4.4.1. Linearidade e Sensibilidade ....................................................................... 89. 4.4.2. Efeito matriz ............................................................................................... 91. 4.4.3. Precisão ...................................................................................................... 93. 4.4.4. Exatidão ...................................................................................................... 95. 4.4.5. Limite de Detecção e Quantificação .......................................................... 97. 5.. CONCLUSÃO....................................................................................................... 99. 6.. PERSPECTIVAS DO TRABALHO ................................................................... 99. REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 100.

(20) 20. 1. INTRODUÇÃO O Brasil atualmente se destaca como maior produtor e exportador de café [1]. Esta commodity é considerada um dos mais valiosos produtos primários no comércio mundial além de gerar milhares de empregos em toda a sua linha de produção [2]. Para tanto, os agrotóxicos são utilizadas rotineiramente com intuito de evitar perdas na produção, que representam em torno de 50% do total [1-5]. O emprego destes insumos agrícolas nas plantações gera uma preocupação mais intensa do público consumidor, incentivando investigações científicas que envolvam estes produtos a fim de garantir a segurança alimentar, no caso, do café fornecido [3]. Desta forma, este trabalho visa desenvolver uma metodologia simples e eficiente que objetiva avaliar os resíduos de agrotóxicos presentes no café torrado.. 1.1 CAFÉ (Coffea arabica e Coffea canephora) Existem mais de 100 espécies diferentes de plantas de café no mundo, agrupadas em um gênero botânico denominado Coffea, sendo as mais conhecidas Coffea arabica (café arábica) e Coffea canephora (café robusta ou conilon). Estas, apesar da diversidade do gênero, detém a relevância econômica no mercado mundial de cafés [4,5]. Sua descoberta na Etiópia entre os anos 600-800 acarretou diversos eventos que marcaram a evolução do café como um produto de alto valor econômico. Isto provocou a disseminação do café pelo mundo, no entanto, a indústria do café no Brasil começou somente em 1727 [5,6]. Apesar da inserção tardia desta commodity no mercado do Brasil, atualmente este se destaca como maior produtor e exportador global de café (Figura 1) [1]. O café é considerado um dos mais valiosos produtos primários no comércio mundial, tendo uma importância que não pode ser subestimada, principalmente em países em desenvolvimento, nos quais toda a sua linha de produção gera emprego para milhões de pessoas em todo o mundo [2]..

(21) 21 Figura 1 - Maiores exportadores mundiais de café. Fonte: Maps of World (2011) [7]. No que se refere à composição química do café, a cafeína pode ser destacada como a substância mais conhecida, porém não majoritária. Vários compostos conferem ao café sabor e aroma peculiares, como fatores genéticos e ambientais, além de condições de manejo na produção e processamento pós-colheita [8,9]. O grão do café verde possui de modo geral, minerais, aminoácidos, lipídios, açúcares, polissacarídeos, vitamina do complexo B e em maior quantidade os ácidos clorogênicos [8]. No entanto, o consumo do café é realizado após o processo de torrefação dos grãos verdes, o que produz a maioria das mudanças notáveis na sua composição, conferindo ao café seus componentes aromáticos através das substâncias formadas pelo processo por meio de reações de polimerização oxidativa ou degradação de compostos fenólicos (Tabela 1) [6,10]. Tabela 1 - Composição do café arábica torrado. Fonte: [10] Componentes Proteínas. Carboidratos. Total (%). Solubilidade em Água (%). Aminoácidos. 9. 1,5. Polissacarídeos:. -. -. Insolúveis em água. 24. -. Solúveis em água. 6. 6.

(22) 22 (continuação da Tabela 1). Lipídios. Sacarose. 0,2. 0,2. Glicose, frutose, arabinose. 0,1. 0,1. Triglicerídeos. 9,5. -. 2. traços. Terpenos: livres, ésteres, glicosídeos. Ácidos. Ácido fórmico. 0,1. 0,1. Voláteis. Ácido acético. 0,2. 0,2. Ácidos Não-. Ácidos lático, pirúvico, oxálico, tartárico, cítrico. 0,4. 0,4. Voláteis. Ácidos clorogênicos. 3,8. 3,8. Cafeína. 1,2. 1,2. Trigonelina. 0,4. 0,4. Cinza. Minerais. 4. 3,5. Água. -. 2,5. 2,5. 0,1. 0,1. 35. 7,5. 100. 27,5. Alcaloides. Compostos voláteis do Parcialmente. aroma. conhecido. Compostos “browning”, fenóis, entre outros. Total. Este processo de torrefação ocorre quando os grãos são “torrados” a altas temperaturas entre 180-240 ºC, durante um período de sete a quinze minutos conforme a torra que queira obter, até atingir sabor, aroma e cor desejáveis. Após as reações desencadeadas pelo calor fornecido, os componentes descritos na Figura 2 são gerados e variam de acordo com a espécie e processo [11,12]. Outro ponto a ser observado na torrefação é a permanência dos agrotóxicos utilizados no plantio para a produção do café após este processo [3,13]. A aplicação constante destes produtos químicos está ligada a uma tentativa de redução de perdas das safras em decorrência das pragas que atacam os cafezais como broca-do-café, ácaro vermelho, bicho-mineiro e a lagarta dos.

(23) 23. cafezais [14]. Com isso, testes realizados por Rice e Ward, 1996 [13] em amostras de café. brasileiro. detectaram. nível. original. do. agrotóxico. DDD. (Diclorodifenildicloroetano) nos grão após a torrefação, apesar desta reduzir estes níveis, o mesmo foi observado por Yang et al, 2010 para 69 agrotóxicos [3]. Figura 2 - Gráfico da composição do café em diferentes condições. Fonte: OestreichJanzen, 2010 [15].. 100 80. Outros Compostos Cinzas. 60 40 20. Melanoidinas Ácidos Orgânico Aminoácidos Lipídios Ácidos Clorogênicos. 0. Carboidratos Trigonelina Cafeína.

(24) 24. 1.2 AGROTÓXICOS NA CAFEICULTURA O Brasil tem como uma das principais atividades econômicas, a agricultura, responsável pela geração de empregos e fator importante para o desenvolvimento da economia. Desta forma, a cultura do café, principal commodity primário do país, utiliza insumos agrícolas, entre eles, os agrotóxicos, a fim de atingir os níveis esperados de produção [1,2,16,17]. Com isso, visando um maior controle e regulamentação do uso destes, os órgãos públicos elaboram normas legais que os definem e relatam as diretrizes e exigências para registro dos agrotóxicos. Sendo assim, a Lei nº 7802/89, regulamentada pelo Decreto nº 4074/02 do MAPA (Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento) apresenta a seguinte definição para estes insumos agrícolas: agrotóxicos são produtos e agentes de processos físicos, químicos ou biológicos, destinados ao uso nos setores de produção, armazenamento e beneficiamento de produtos agrícolas, pastagens, proteção de florestas nativas ou implantadas e de outros ecossistemas, bem como de ambientes urbanos, hídricos e industriais. [18]. Contudo, estas legislações e suas exigências não impediram que o Brasil se tornasse o maior consumidor destes produtos no mundo [19,20]. Várias pragas assolam a cultura do café, a principal é o Bicho-mineiro na cafeicultura brasileira, seguido da Broca-do-café (Figura 3), porém existem outras pragas que atingem as plantações de café (Figura 4). O Bicho-mineiro é considerado praga-chave da cafeicultura na maioria das regiões produtoras. As larvas deste inseto se alimentam do parênquima foliar, causando necrose e redução da área fotossintética, provocando a queda das folhas e o decréscimo da produção dos frutos [21,22]. O controle químico desta praga é realizado por meio de inseticidas, principalmente organofosforados, carbamatos e diversos piretróides [14,21]..

(25) 25 Figura 3 - Principais pragas do cafezal (a) broca-do-café, Hypothenemus hampei e (b) Bicho-mineiro, Leucoptera coffeella. Fonte: Souza et.al, 2011 [23]. a. b. Figura 4 - Outras pragas do cafezal: (a) Ácaro vermelho Tetranychus evansi; (b) Lagarta dos cafezais, Eacles imperialis magnifica. Fonte: Mesquita a. b. Outra praga que agride intensivamente os cafezais, a Broca-do-café Hypothenemus hampei, é um inseto que ataca os frutos do cafeeiro e é originário do Continente Africano, sendo visto pela primeira vez no Brasil em 1913, na região de Campinas dispersando-se pelos cafezais brasileiros [23]. Apesar do longo tempo desde sua constatação ainda não foi erradicada das lavouras e o controle mais eficiente desta infestação ocorre principalmente por meio do inseticida endosulfan [14,23]. No geral, a principal forma de combate e prevenção destas pragas nas plantações de café é por meio de agrotóxicos, o mesmo é válido para o Ácaro-vermelho, utilizando acaricidas e para a Lagarta dos cafezais inseticidas seletivos [14,22]. No intuito de evitar grandes perdas, os cafeicultores aplicam estes agrotóxicos em toda a lavoura, tanto em decorrência de seu baixo custo como por sua rápida ação ou ainda pela evolução da resistência das pragas a estes produtos. Isto corrobora o surgimento de efeitos adversos como a destruição de organismos benéficos (vespas.

(26) 26 predadoras, vespinhas parasitóides e bicho-lixeiro) além da contaminação do meio ambiente provocada pelo aumento da quantidade de resíduos poluentes [14,21,22]. Devido ao protecionismo nos mercados externos cada vez mais se estabelecem requisitos técnicos no que diz respeito a aplicação, exportação e importação dos agrotóxicos sobretudo quando relacionados a produtos agrícolas mais competitivos, tornando essas substâncias as mais sujeitas a rígidas legislações no mundo [24]. Estas legislações visam garantir a segurança do consumidor bem como regulamentar o comércio externo, funcionando como o mais importante parâmetro para a saúde pública e para o comércio internacional, por meio do estabelecimento e regulamentação dos limites máximos de resíduos (LMRs), algumas destas legislações estão descritas na Tabela 3. Estes LMRs podem ser definidos como a quantidade máxima de resíduo de agrotóxico, ou afim, oficialmente aceita no alimento, em decorrência da aplicação adequada numa fase específica, desde sua produção até o consumo, expressa em miligramas do agrotóxico afim ou de seus resíduos por quilo do alimento analisado (mg kg-1). Na qual, resíduo pode ser definido como substância ou mistura de substâncias remanescentes ou existentes em alimentos ou no meio ambiente, decorrente do uso ou da presença de defensivos e afins, inclusive quaisquer derivados específicos, tais como produtos de conversão e de degradação, metabólitos, produtos de reação e impurezas, consideradas toxicológica e ambientalmente importantes [24]..

(27) 27. Tabela 2 - Classificação dos agrotóxicos selecionados para o trabalho quanto ao grupo químico, ao modo de ação, à classe toxicológica e fórmula estrutural. Fonte: Agência de Vigilância Sanitária [25].. Agrotóxico. Fórmula Estrutural. Grupo Químico. O. O. (CBN). Classe. Ação. Toxicológica *. Acaricida. HN. Carbofurano. Modo de. O. Metilcarbamato de. Cupinicida. Benzofuranila. Inseticida. I. Nematicida O. Cipermetrina (CIP). CN O. O. Cl. Piretroide. Formicida Inseticida. II. Cl. Clorpirifós (CLF). OCH2CH3 H3CH2CO P S O Cl. (CTD). Organofosforado. Formicida. II. Inseticida Cl. Clotianidina. Acaricida. Cl. O 2N N NH NH. Cl. S N. Neonicotinoide. Inseticida. III.

(28) 28 (continuação da Tabela 2). Dissulfotom. S S. P OCH2CH3. S. (DIS). OCH2CH3. Acaricida Organofosforado. Fungicida. I. Inseticida Cl. Cl. Cl. Endosulfan. Cl. Organoclorado. (END). O SO. Cl Cl. O. Acaricida Inseticida. I. O. Espirodiclofeno. O. (ESP). O. O. Cetoenol. Acaricida. III. Herbicida. -. Cl. Cl F. Haloxifope (HLX). N. F. O. Ácido. F Cl O O H. OH. Ariloxifenoxipropiônico.

(29) 29 (continuação da Tabela 2). Imidacloprido. N Cl. N NO 2. N. (IMD). Neonicotinoide. Inseticida. III. Triazol. Fungicida. IV. Triazol. Fungicida. III. Triazol. Fungicida. II. NH Cl. Tebuconazol. OH. (TBC) N. N. N Cl O. Triadimefom O. (TDF). N N N Cl. Triadimenol (TDN). HO O N N N. * Classificação Toxicológica: I – Extremamente Tóxico; II – Altamente Tóxico; III – Medianamente Tóxico; IV – Pouco Tóxico..

(30) 30 Tabela 3 - Limites máximos de resíduos para os agrotóxicos selecionados na cultura do café. Fonte: [26,25] Codex. Convenção. Alimentarius *. de Estocolmo**. (mg kg-1). (mg kg-1). (mg kg-1). Carbofurano. 1,00. 0,100. 0,1. Cipermetrina. 0,05. -. 0,05. Clorpirifós. 0,05. 0,050. 0,05. Clotianidina. 0,05. -. -. Dissulfotom. 0,20. 0,100. 0,1. Endosulfan. 0,20. 0,050. 0,05. Espirodiclofeno. 0,03. 0,050. 0,03. Haloxifope. 0,02. -. -. Imidacloprido. 1,00. 0,070. 0,05. Tebuconazol. 0,10. 0,200. 0,2. Triadimefom. 0,50. 0,100. 0,1. Triadimenol. 0,50. 0,500. 0,5. Agrotóxico. ANVISA. Fórum internacional de normatização do comércio de alimentos estabelecido pela Organização das Nações Unidas (ONU) [18]. ** Convenção de Estocolmo sobre Poluentes Orgânicos Persistentes (POPs). *. 1.2.1 Agrotóxicos Envolvidos neste Trabalho Os agrotóxicos selecionados para este trabalho visaram abranger duas formas mais comuns de modalidade de emprego destes na cafeicultura, a foliar e a no solo, podendo variar em relação à praga a ser combatida bem como sua forma de atuação (Tabela 4). Em seus respectivos produtos comerciais os agrotóxicos/ ingredientes ativos possuem outros compostos responsáveis por facilitar seu manuseio e aplicação [27,28]. Além destas características estes defensivos agrícolas têm propriedades físico-químicas (Tabela 5) que possibilitam conhecer teoricamente seu comportamento frente a alguns parâmetros que podem ser utilizados no método de extração a ser desenvolvido..

(31) 31 Tabela 4 - Modo de aplicação dos agrotóxicos e produtos comerciais utilizados na cafeicultura. Fonte: [28]. Aplicação. Classe do Agrotóxico. Agrotóxico Dissulfotom. Fungicida. Produto Comercial. Baron®1, Baysiston GR®1. Triadimenol Solo Carbofurano Inseticida Imidacloprido Acaricida. Espirodiclofeno. Diafuran 50®1, Furadan®1 ® 1,2. Imaxi 700 WG. , Premier. ®1,2,3. Envidor®4 ®1,5. Tebuconazol. Tebuconazole Nortox. Triadimefom. Bayletom BR®5. Clorpirifós. Klorpan 480 EC ®2,3. Cipermetrina. Perito®2, Cipertrin®2,3. Endosulfan. Endosulfan AG®, Thiodan®2,3. Fungicida Foliar Inseticida. 1. Sistêmico; 2 Não sistêmico de contato; 3 Não sistêmico de ingestão; 4 Não sistêmico; 5 Loco-sistêmico.. Quanto à forma de atuação os agrotóxicos podem ser dispostos em quatro grupos: sistêmicos, não sistêmicos, mesostêmicos e loco-sistêmicos. Os sistêmicos são aqueles que se fixam e penetram na superfície da planta, dispersando-se através dela, ou seja, estas substâncias são absorvidas pelas raízes e translocadas pelo sistema condutor da planta via xilema e floema. Os classificados como não sistêmicos também denominados de tópicos ou imóveis agem diretamente nos organismos nocivos, não são nem absorvidos nem translocados, possuindo ação de contato (via dérmica), de penetração, de ingestão (via oral) e fumigante (via respiratória). Os mesostêmicos caracterizam principalmente o grupo dos fungicidas estrobulinas, apresentando afinidade com a superfície foliar sendo absorvida pela camada de cera formando um depósito na superfície da área susceptível, sendo penetrante com ação de profundidade ou movimento translaminar. Por fim, os loco-sistêmicos, de profundidade ou translaminares podem ser translocados para qualquer parte da planta, independente de sua parte ou de sua espécie botânica [29,30,31]..

(32) 32. Tabela 5 - Características físico-químicas dos agrotóxicos em estudo. Fonte: [32-35]. Agrotóxico. Ponto de Ebulição (ºC). Log kow. Solubilidade (g L-1). Densidade (g cm-3). Água, 0,351 Carbofurano. 153. 2,32. Diclorometano>200. 1,18. Isopropanol, 20-50 Acetona, 620 Diclorometano, 550 Cipermetrina. 200. 6,94. 1,28 Ciclohexano, 515 Clorofórmio Acetona 650. Clorpirifós. 160. 4,96. Clorofórmio, 630. 1,40. Solventes Orgânicos Clotianidina. 176,8. 5. Água, 0,327. 1,61. Dissulfotom. 62. -. -. 1,14.

(33) 33 (continuação da Tabela 5). Acetato de Etila, 200 Endosulfan. 3,83 (alfa). Diclorometano, 200. 3,62 (beta). Etanol, 65. 106. 1,74 Hexano, 24 Acetona, Diclorometano,. Espirodiclofeno. -. 5,1. Acetonitrila, Acetato de. 1,29. Etila>250 4,33 Haloxifope. 55-58. 3,52. Diclorometano, Acetona, Etanol, Acetonitrila. 1,30-1,37. 4,00* Imidacloprido. 144. 0,57. Água, 0,61. 1,5. Água, 0,032 Tebuconazol. 102,4. 3,7. Diclorometano, 200. -. Isopropanol, 100-200 Triadimefom. 78 e 82 **. 3,11. Água, 0,064. 1,28.

(34) 34 (continuação da Tabela 5). Diclorometano, Acetona, Acetonitrila >200 Diclorometano >250 Acetona, 190 Triadimenol. 133 e 135 ***. 3,08 e 3,28. 1,23 e 1,30 Acetato de Etila, 150 Isopropanol, 140. *Haloxifope-etotil, haloxifope-metil e haloxifope-R-metil; **Depende da estrutura do cristal; *** Depende do Diasteroisômero; kow – coeficiente de partição octanol-água..

(35) 35. 1.3 MÉTODO DE EXTRAÇÃO A determinação de resíduos de agrotóxicos envolve etapas como amostragem, preparo da amostra, extração dos analitos, clean-up (remoção dos interferentes) e préconcentração para a posterior análise instrumental. Na maioria dos casos, alimentos e amostras ambientais não podem ser analisados diretamente, o que exige a execução destas etapas que caracterizam a metodologia de extração, permitindo desta forma a identificação e detecção dos baixos níveis dos agrotóxicos nestas matrizes complexas [3,32]. Diversos métodos de extração e quantificação estão sendo utilizados para determinar resíduos de agrotóxicos em alimentos. Visando sempre métodos com características como baixo custo, facilidade e aplicabilidade a diferentes matrizes [33,34]. Além disso, são necessários alguns cuidados durante a execução do método selecionado, pois a determinação de resíduos de agrotóxicos é complexa e com várias etapas que podem afetar o resultado final, podendo ser citados como alguns destes cuidados: I.. A amostra tem que ser homogênea e representativa, isto é, ter uma composição química que se assemelhe ao máximo com a composição média da totalidade do objeto de estudo.. II.. O isolamento e/ou enriquecimento de analitos alvos tem que ser realizado de forma a obter a transferência de analitos a partir da matriz primária com remoção simultânea dos interferentes e aumento da concentração dos analitos a níveis acima do limite de determinação da técnica analítica aplicada.. III.. Emprego adequado de um método de limpeza, em decorrência da evolução dos métodos empregados na determinação de multi-resíduos de agrotóxicos, com isso diferentes classes e propriedades físico-químicas, o que torna a etapa de clean-up quase sempre necessária. Desta forma, para garantir uma eficiente determinação de multi-resíduos de. agrotóxicos em alimentos, diferentes técnicas de limpeza são aplicadas. Estas técnicas em alguns trabalhos realizados nos últimos anos foram utilizadas de forma combinada, como nos trabalhos de MUKHERJEE, 2009 [35] (extração líquido-líquido e extração em fase sólida (em inglês, SPE, Solid Phase Extraction)), de HERCEGOVÁ el al, 2005 [36] (extração sólido líquido por sonicação e SPE) e de BLASCO et al., 2005 [37] (extração com líquido pressurizado (em inglês, PLE, Pressurized Liqui Extraction) e.

(36) 36 dispersão de matriz em fase sólida (em inglês, MSPD, Matrix Solid Dispersive Extraction)). Assim, o desenvolvimento de novas metodologias utilizando diversas técnicas de extração para a redução de interferentes vem se tornando uma prática comum [38-42]. Esta ideia foi utilizada no presente trabalho buscando aliar o método de extração por sonicação com a extração líquido-líquido como clean-up. Utilizando os grãos de café como matriz poucos trabalhos desenvolveram metodologias para a determinação de resíduos de agrotóxicos. No geral, a aplicação de métodos de extração nos grãos de café visa substâncias como cafeína, trigonelina e ácido nicotínico, que são as responsáveis pelas principais características desta commodity como sabor, aroma e cor. Desta forma, um dos trabalhos que desenvolveu uma metodologia para a determinação de 69 agrotóxicos de diferentes grupos químicos em café foi realizado por YANG et al., 2010 [3]. Neste trabalho os autores utilizaram extração líquido líquido para obter uma fração representativa da amostra, aplicando a este extrato uma etapa de clean-up por cromatografia com permeação em gel separando a fração entre 4-15 minutos, realizando outro clean-up por meio da técnica SPE com cartuchos Envi-Carb® acoplado aos cartuchos de NH2-LC. Por fim, a análise instrumental foi realizada cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas. Outro trabalho que desenvolveu uma metodologia para a análise de multi-resíduos de agrotóxicos em 15 amostras de cafés brasileiros foi realizado por DIAS et al., 2013 [38] aplicando QuEChERS para a extração e análise em LC-MS/MS. Contrastando com outras publicações da literatura que utilizam o café, não necessariamente torrado, foi notada a presença de trabalhos com diversas técnicas de extração como, MSPD, sonicação, QuEChERS, entre outras, alguns com etapa de cleanup, como pode ser visto na Tabela 6. Destacando SALINAS-VARGAS e CAÑIZARESMACÍAS, 2014 [39] que tiveram como objetivo a elaboração de uma metodologia aplicando a técnica de extração sólido líquido por sonicação para obter um extrato que foi submetido a um clean-up com um sistema de SPE on-line visando a determinação da cafeína, a qual foi uma das referências do presente estudo em decorrência da técnica de extração ser rápida e eficiente na preparação da amostra [40]. Em suma, nenhum trabalho agregando a utilização da matriz café torrado, o método de extração por sonicação e clean-up com LLE para a determinação de multiresíduos de agrotóxicos com análise instrumental por cromatografia líquida/ espectrometria de massas foi encontrado. A Tabela 6 mostra trabalhos com café e.

(37) 37 matrizes semelhantes, reunindo algumas técnicas que podem ser utilizadas para o desenvolvimento da metodologia de extração e análise instrumental deste trabalho. Tabela 6 - Alguns trabalhos com técnicas de extração combinadas e amostras sólidas. MÉTODO REFERÊNCIA. MATRIZ. ANALITO. DE. CLEAN-UP. EXTRAÇÃO ALVES e BRAGAGNOLO,. Chás. 2002 [41]. Teobromina,. LLE. Teofilina, Cafeína. SE. ANÁLISE INSTRUMENTAL. Espectrofotômetro HPLC-UV/Vis. Ácido nicotínico, ALVES et al., 2006 [42]. Café torrado. trigonelina, ácido clorogênico e. SE. -. HPLC-UV/Vis. -. LC-MS/MS. QuEChERS. GC–MS (NCI-SIM). cafeína DIAS et al., 2013 [38]. Café arábica. PIZZUTTI et al.,. Grãos de café. 2012 [2]. verdes. SALINA-VARGAS E CAÑIZARESMACÍAS, 2014 [39]. Multi-resíduos de. QuEChERS. agrotóxicos. 51 Agrotóxicos. SE-agitação. On-line SPE. Grãos de café verdes e. Cafeína. SE-Sonicação. torrados. Mini-coluna. UV-vis. de C18. Café moído torrado, SOARES et al.,. descafeinado,. 2010 [43]. instantâneo e. Acrilamida. MSPD. 69 Agrotóxicos. LLE. SPE. GC-MS. misturado com cereais YANG, et al.,2010 [3]. ZHAO et al., 2011 [44]. GPC Grão de Café. GC-MS SPE. Chás verde, verde pu-ehr e branco. 18 compostos do chá. SE-Sonicação. -. UPLC/DAD/MS.

(38) 38 1.3.1 Método de Extração Sólido Líquido por Sonicação O uso da energia ultrassônica em meios líquidos e sólidos tem sido extenso em aplicações nos processos alimentícios e tem incentivado a utilização em tratamento de amostras, durante muitos anos. Seus efeitos mecânicos provêm de uma maior penetração do solvente no material celular o que aumenta a transferência de massa devido aos efeitos de micro-fluxos gerados pelas ondas. Durante o processo de sonicação ondas longitudinais são criadas quando a onda sônica entra em contato com um meio líquido, criando regiões alternadas de ondas de compressão e rarefação induzidas em moléculas do meio caracterizando o processo de cavitação [40,45] visto detalhadamente na Figura 5. Figura 5 - Processo de cavitação. Fonte: SEIDI e YAMINI (2012) [46].. Estas ondas que caracterizam o ultrassom são ondas mecânicas que precisam de um meio elástico para se propagar, podendo ter baixa ou alta intensidade. Esta pode alterar as propriedades físicas ou químicas do alimento e tem entre outras aplicações a capacidade de acelerar e melhorar a eficiência do preparo da amostra. Com isso o uso de ultrassom com alta intensidade/baixa frequência (16-100 kHz) é mais frequente [47]..

(39) 39 Dessa forma, o processo de cavitação com o ciclo de formação, crescimento e colapso implosivo de vacúolos de gás em solução, vistos na Figura 5, caracteriza o procedimento de extração. Que tem o aumento da cavidade dependente da intensidade da onda sonora, podendo ocorrer o colapso como uma compressão adiabática e gerar altas temperatura e pressão. A alta temperatura resulta em uma maior solubilidade dos analitos no solvente extrator e a difusividade dos analitos da matriz para a região externa. Já o aumento da pressão favorece a penetração do solvente extrator na matriz e o transporte entre a matriz sólida e a fase líquida na interface, mecanismo este demonstrado na Figura 6 [45,47]. Este método de extração sólido-líquido também denominado de “lixiviação” é ditado por mecanismos de solubilidade e fenômenos de transporte, além disso, possui três etapas cruciais: I.. O solvente extrator é colocado em contato com a superfície e com o interior da matriz iniciando o processo de extração;. II.. Os analitos retidos serão removidos por deslocamentos dos sítios ativos da matriz seja por maior afinidade e/ou concentração das moléculas do solvente.. III.. Os analitos serão transportados do interior da matriz para a superfície essencialmente por forças de difusão e fora da matriz por forças principalmente de convecção, a lixiviação fornecida é executada em modo dinâmico. Com isso o mecanismo de lixiviação envolve alguns efeitos como o colapso dos. vacúolos formados na proximidade da superfície sólida produzindo micro-fluxos de alta velocidade que corroem a superfície e podem aumentar as taxas de transporte e a área superficial; ocorre também a fragmentação das partículas através da colisão que aumenta a superfície de contato e facilita a penetração do solvente extrator no interior da matriz. E ainda a transmissão acústica promove a interrupção da camada de difusão na superfície e a energia ultrassônica facilita a difusão das substâncias analisadas para a zona externa [45]..

(40) 40 Figura 6 - Mecanismo de extração/lixiviação por sonicação (a) na ausência e (b) na presença das ondas ultrassônicas. Fonte: CASTRO e CAPOTE (2007) [45].. A prolixidade do método de extração sólido-líquido por sonicação pode ser verificada na Tabela 6 com sua utilização como uma etapa de preparo de diferentes amostras para um posterior método de extração, bem como sua aplicação em metodologias de extração de compostos orgânicos e inorgânicos. Contudo esta técnica possui hifenizações a exemplo da UMAE (extração assistida por microondas e ultrassom), IL-UMAE (extração assistida por microondas e ultrassom com líquidos iônicos), USASFE (extração por fluido supercrítico assistida por ultrassom), entre outros exemplos encontrados na literatura garantindo uma ampla aplicação deste método para as mais diversas matrizes [46].. 1.4 CROMATOGRAFIA LÍQUIDA A cromatografia é um método de análise que apresenta ampla versatilidade destacando-se dentre outros, pois efetua separação, identificação e quantificação das substâncias químicas presente em uma mistura [48]. É uma técnica de separação baseada em um processo físico-químico e geralmente composta de dois componentes primários: a fase estacionária e a fase móvel gerando a distribuição da mistura pelas duas fases e a retenção seletiva na fase estacionária [48,49]. O princípio do processo de separação dos componentes de uma amostra por cromatografia e sua denominação são atribuídos ao russo Mikhael Semenovich Tswett em 1906. Desde então inúmeros progressos aconteceram no âmbito da cromatografia,.

(41) 41 como o desenvolvimento de outras modalidades e várias modificações foram introduzidas à cromatografia líquida clássica utilizada por Tswett, caracterizando a cromatografia líquida moderna, inventada por Snyder e Kirkland com vantagens, segundo os autores, de ser mais conveniente, precisa, rápida e apta a realizar separações difíceis, sendo ilustrada esquematicamente na Figura 7 [48,50]. Figura 7 - Esquema básico de um sistema de cromatografia líquida com detector espectrofotométrico e espectrometria de massas. Fonte: Baseado em NAUSHAD e KHAN, 2014; MEYER, 2010 e SNYDER et al., 2010 [49,51,52].. Misturador. Válvula de Injeção. Bomba. Fase Móvel. Amostra s. Fase Estacionária. Espectrômetro de Massas. Detector. TQD. Lâmpada. Descarte Registrador. Com isso, a denominada atualmente de cromatografia líquida de alta eficiência, CLAE, mais popularmente conhecida por HPLC, em inglês High Performance Liquid Chromatography passou a ser um dos métodos analíticos mais utilizados para fins qualitativos e quantitativos em menos de trinta anos. Tendo como razões para este crescimento a sua adaptabilidade para determinações quantitativas com boa sensibilidade, a possibilidade de separar espécies não voláteis e termicamente instáveis além de sua aplicação em determinações ambientais e em muitos outros campos da ciência [53]. A ampla variedade de combinações entre fases móveis e estacionárias torna esta técnica extremamente versátil e de grande aplicação. Quando utilizada para a identificação de compostos este dado é obtido através da comparação com padrões analíticos, permitindo também a purificação separando o analito de interesse de.

(42) 42 substâncias indesejadas [48]. A separação dos compostos de uma amostra pode ser realizada por um sistema com condições fixas (modo isocrático) ou por meio de uma composição variável da fase móvel durante a separação (modo gradiente) [54]. Hoje, compostos com concentrações em nível de traço chegando a partes por bilhão podem ser mais facilmente identificados e a HPLC está sendo muito aplicada para este fim em análises de alimentos, fármacos, cosméticos, matrizes ambientais, forense e produtos químicos industriais. Em 2004, a Waters®, realizou muitos avanços na instrumentação e tecnologia da coluna para alcançar aumentos mais significativos na resolução, na velocidade de análise e na sensibilidade na cromatografia líquida. Para tanto, surgiram fases estacionárias com tamanho de partículas menores (< 2 μm) e para empregar tais fases à instrumentação foram necessárias modificações que suportassem altas pressões para fluir a fase móvel e atingir este nível de eficiência, criando um novo sistema conhecido como cromatografia líquida de ultra eficiência (UPLC). Este sistema é baseado no mesmo princípio que a HPLC, ou seja, cromatografia de partição com um adsorvente. de. tamanho. muito. reduzido. para. aumentar. a. área. superficial. consequentemente a retenção [49]. No sistema UPLC em decorrência do aumento da eficiência, resolução e alta velocidade pode-se afirmar que a eficiência tem valores três vezes maior com colunas de 1,7 μm quando comparadas com aquelas de 5 μm. A resolução é 70% maior do que com colunas de 5 μm e 40% em colunas de 3,5 μm. A alta velocidade é obtida porque o comprimento da coluna é reduzido em um fator de 3 em relação as colunas de 5 μm e o fluxo pode ser três vezes maior. Portanto, as separações se tornam nove vezes mais rápidas com igual resolução, permitindo a obtenção de resultados mais rápidos com mais resolução, informação e robustez comportando a análise de mais amostras por sistema e analista [49]. No entanto, outro componente do sistema cromatográfico que contribui significativamente para a obtenção destas respostas é o detector. Existem diversos tipo de detectores disponíveis para a cromatografia líquida, em contrapartida, poucos são amplamente utilizados devido a limitações inerentes à técnica. Destacando-se os de absorção no UV-Vis, o índice de refração, a fluorescência e o espectrômetro de massas. Sendo o espectrômetro de massas de caráter universal, com boa sensibilidade além de possuir ruído bem reduzido, vem ampliando suas aplicações e números de usuários apesar do custo, tornando-se o detector mais promissor para a cromatografia líquida.

(43) 43 fornecendo informações mais sensíveis em análises de traços, resíduos de agrotóxicos, contaminantes em alimentos entre outros [50]. Com o avanço das técnicas de separação e o seu respaldo na Química Analítica pela capacidade de realizarem análises qualitativas e quantitativas em amostras ambientais, farmacêuticas, biológicas e em alimentos, novas metodologias vem sendo desenvolvidas por cromatografia. Ampliando a necessidade de garantir a qualidade das medições químicas, através de sua comparabilidade, rastreabilidade e confiabilidade, realizada por meio do processo de validação [55]. Que segundo a ANVISA [56], “A validação de determinado procedimento analítico objetiva demonstrar que o mesmo é adequado aos objetivos propostos, ou seja, que os parâmetros de desempenho avaliados atendem aos critérios de aceitação preconizados.” Dessa forma, os parâmetros avaliados para validar um método analítico envolvem Especificidade/Seletividade, Linearidade, Sensibilidade, Exatidão, Precisão (repetitividade, precisão intermediária e reprodutividade), Limite de Detecção (LD) e Limite de Quantificação (LQ) [57]. Para tanto, testes ao longo do desenvolvimento da metodologia foram realizados com o intuito de atingir as especificações destes critérios, que serão posteriormente detalhados em correlação com os resultados obtidos neste trabalho, atingindo os objetivos propostos, descritos a seguir..

(44) 44. 2. OBJETIVOS 2.1 OBJETIVO GERAL O presente trabalho visa desenvolver uma metodologia simples e eficiente para a avaliação de resíduos de agrotóxicos em café torrado utilizando a técnica de extração por sonicação e clean-up por extração líquido-líquido e análise por cromatografia líquida de ultra eficiência (UPLC) acoplada a espectrometria de massas sequencial.. 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS . Selecionar os agrotóxicos, de acordo com a utilização na cultura do café;. . Otimizar as condições cromatográficas para a análise simultânea dos agrotóxicos;. . Desenvolver uma metodologia de extração;. . Desenvolver uma metodologia de clean-up;. . Validar o método desenvolvido..

(45) 45. 3. METODOLOGIA 3.1 REAGENTES Acetonitrila grau Absolv (Tedia, EUA), diclorometano HPLC/SPECTRO (Tedia, EUA), água deionizada, adsorvente C18 (Agilent Tecnologies), Sílica gel 70-230 mesh (Tedia, Brasil). 3.2 MATERIAIS E EQUIPAMENTOS Erlenmeyer (25 mL), Vials (40 mL), funil de vidro, béquer, tubo de ensaio de fundo cônico, seringa de vidro, balança analítica (Sartorius BL 2105), micropipetador automático (KASVI, China), lavadora ultrassônica (Unique USC-1400), agitador mecânico (IKA®), centrífuga (Universal).. 3.3 PADRÕES DOS AGROTÓXICOS E SOLUÇÕES Os padrões certificados dos agrotóxicos utilizados para o trabalho foram: Carbofurano (AccuStandard, EUA), cipermetrina (Fluka, Suíça), clorpirifós (Dr. Ehrenstorfer GmbH, Alemanha), clotianidina (Fluka, Suíça), dissulfotom (SUPELCO, EUA), endosulfan (Sigma-Aldrich, Alemanha), espirodiclofeno (Sigma-Aldrich, Alemanha), haloxifope (Sigma-Aldrich, Alemanha), imidacloprido (Rieldel-de Haën, Alemanha),. tebuconazol. (AccuStandard,. EUA),. triadimefom. (Sigma-Aldrich,. Alemanha), triadimenol (Sigma-Aldrich, Alemanha). A partir destes padrões as soluções estoque foram preparadas nas seguintes concentrações: carbofurano 590 μg mL-1 em metanol, tebuconazol 500 μg mL-1, cipermetrina, clorpirifós, clotianidina, endosulfan espirodiclofeno, haloxifope, imidacloprido, triadimefon e triadimenol 1000 μg mL-1 em acetonitrila e dissulfotom 4000 μg mL-1 em acetonitrila. Por meio destas soluções individuais foram preparadas soluções intermediárias individuais para então posterior elaboração de soluções conjuntas de trabalho, segundo a Figura 8. Todas as soluções utilizadas neste trabalho foram armazenadas em freezer e tiveram suas respectivas características confirmadas antes das análises realizadas..

(46) 46. Figura 8 - Fluxograma utilizado para preparar as soluções de trabalho dos agrotóxicos em estudo seguido da elaboração das soluções analisadas. *. 2000 μL. 500 μL *. 5000 μL. SCJ ** 1 μg mL-1. 200 μL *. SCJ ** 10 μg mL-1. Padrão Individual 100 μg mL-1. para a obtenção das curvas analíticas.. 500 μL. 1000 μL. 0,50 μg mL-1. 250 μL. 1000 μL. 0,25 μg mL-1. 100 μL. 1000 μL. 0,10 μg mL-1. 10 μL. 1000 μL. 0,01 μg mL-1. Este volume é dependente da concentração da solução individual do agrotóxico (SEÇÃO 3.3);** SCJ - Solução Conjunta dos Agrotóxicos..