Cultura celular

3.10.1. Culturas Celulares: manutenção e manuseamento

As linhas celulares utilizadas neste trabalho foram a HepG2 (linha derivada do carcinoma hepatocelular humano; ATCC, Rockville, MD, USA) e as Caco-2 (linha derivada de adenocarcinoma do colon humano; CLS, Eppelheim, Germany). As células foram mantidas em meio de cultura completo numa incubadora (Binder) a 37 °C com 5 % CO2/ 95% ar no laboratório de Biologia Celular e Bioenergética do Departamento de Biologia e Ambiente da Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro (DeBA-UTAD).

As linhas celulares HepG2 e Caco-2 foram sempre manipuladas em condições assépticas numa câmara de fluxo laminar, classe I (Faster, BH–EN 2004) para prevenir uma possível contaminação celular.

3.10.2. Meios de Cultura e soluções

O meio de cultura é um dos fatores mais importantes na cultura de células e na cultura de tecidos, devendo este fornecer todos os nutrientes essenciais para o metabolismo, crescimento e proliferação celular. Este é constituído por vitaminas, aminoácidos, glucose e iões inorgânicos entre outros. O meio foi sempre mantido no frigorífico, a 4ºC. Neste ensaio foi utilizado um meio com soro (meio de cultura completo) e outro sem soro.

Todos os processos realizados foram feitos com os devidos cuidados, de modo a evitar contaminação.

3.10.2.1. Meio de cultura completo

Constituído pelo meio base DMEM (Dulbeco`s Modified Eagles Medium, Gibco), suplementado com 2 mM de L-glutamina (Gibco, Life technologies), 10 % (v/v) de soro fetal bovino, FBS (Gibco, Life technologies) e antibióticos (200 U/mL penicilina e 200 µg/mL estreptomicina, (Gibco, Life technologies). O meio base já contém 25 mM de glucose e 0,1 g/L de piruvato.

3.10.2.2. Meio de cultura sem soro

Constituído por meio base DMEM (Dulbeco`s Modified Eagles Medium, Gibco), suplementado com 2 mM de L-glutamina (Gibco, Life technologies), e antibióticos (200 U/mL Penicilina e 200 µg/mL Estreptomicina), (Gibco, Life technologies). Este meio base já contém 25 mM de glucose e 0,1 g/L de piruvato.

3.10.2.3. Solução PBS 1x

A solução tampão designada por PBS (tampão fosfato) contém (em mM): 137 NaCl, 2,7 KCl, 1,75 KH2PO4 e 10 Na2HPO4.2H2O,com pH ajustado a 7,4.

3.10.2.4. Soluções stock

As amostras selecionadas para avaliação dos seus efeitos nas células em cultura, foram pesadas e diluídas em PBS de forma a obter uma concentração de 10 mg/mL (solução stock ou solução-mãe). Destas foram posteriormente obtidas as soluções, com as concentrações finais a testar (50, 100, 200 e 500 µg/mL), por diluição da solução stock em meio de cultura sem soro.

3.10.3. Manutenção da linha celular

Neste trabalho utilizamos um meio de cultura que possui na sua composição vermelho de fenol (indicador de pH), à medida que este meio acidifica vai perdendo o tom avermelhado e passa a amarelado, isto indica que o meio já está gasto e pobre em nutrientes, quando isto ocorre e se as células ainda não atingiram uma confluência de 80-90 % então faz-se a mudança do meio de cultura sem tratamento com tripsina (passagem ou subcultura). Quando se muda apenas o meio, retiraram-se os frascos de cultura da incubadora e com uma pipeta remove-se o meio de cultura. Depois adiciona-se cerca de 5 mL de meio de cultura completo (a frascos de T25) e recoloca-se o frasco de cultura na incubadora a 37 °C com 5 % CO2.

3.10.4. Subcultura e tripsinização de células aderentes 3.10.4.1.Principio do método

A cultura de células é uma técnica que permite o crescimento e a propagação de diferentes tipos de células sobre determinadas condições controladas (Butler & Dawson, 1992)

O meio de crescimento da cultura de células contém aminoácidos, sais, vitaminas e é suplementado com soro fetal bovino. O crescimento das células organiza-se em monocamadas (em alguns casos multicamadas) na superfície do frasco/placa de cultura. As células multiplicam-se até entrarem em contacto umas com as outras, atingindo o estado de cultura confluente. As células normais param de crescer quando começam a contactar umas com as outras, este fenómeno é conhecido como inibição de contacto (Mather & Roberts, 1998). As linhas celulares aderentes crescem “in vitro” até cobrirem parcial ou totalmente a superfície disponível (confluência total ou parcial). As células Caco-2 atingem sempre 100% de confluência e crescem aderentes em monocamadas, as células HepG2 atingem cerca de 80-90%

de confluência e crescem aderentes em agregados. Quando as células atingem o máximo de confluência devem ser sujeitas a subcultura a fim de evitar a morte da cultura.

Para manter uma cultura celular é necessário que, periodicamente se renove o espaço e o meio de crescimento para que as células possam crescer. A frequência da subcultura e o rácio de divisão ou a densidade a que as células atingem depende das características de cada linha celular.

O grau de adesão às caixas de cultura a nível intercelular varia entre as várias linhagens celulares. A subcultura envolve a remoção do meio de cultura, a lavagem das células, a dissociação das células aderentes por ação enzimática, (na maioria dos casos utilizam tripsina e/ou colagenase), e diluição da suspensão celular num novo meio de cultura. No entanto, isso pode não ser apropriado para algumas linhas onde a exposição às proteases é prejudicial, ou quando as enzimas usadas removem marcadores de membrana/recetores de interesse. Nestes casos, as células devem ser colocadas em suspensão em um pequeno volume de meio usando soluções isentas de cálcio e ainda através de força mecânica com o auxílio de raspadores celulares.

Para analisar as características de crescimento de um tipo particular de célula ou de uma linha celular, pode ser estabelecida uma curva de crescimento, de modo a obter a fase de duplicação da população, a fase lag e a densidade de saturação. O crescimento do número total de células é uma ótima medida da resposta biológica, uma vez que é influenciada de um modo geral por diferentes fatores, incluindo mudanças no nível de nutrientes, transporte, integridade da membrana e entre outros fatores (Parks et al., 1979).

3.10.4.2. Procedimento

Células a crescer em frasco de 25 cm3 de área de adesão (T25; Orange Scientific), em estado de confluência de 80-90 % no caso das HepG-2 ou 100% no caso das Caco-2, foram sujeitas a sub-cultura. Inicialmente foi retirado o meio onde estas se encontravam, tendo o cuidado de não tocar com a pipeta de Pasteur em nenhum lado para garantir a esterilidade. De seguida fez-se a primeira lavagem com 1 mL de HBSS (Hanks balanced salt solution) para remover vestígios de soro e cálcio, apos a lavagem retira-se este meio e coloca-se 1 mL de tripsina (tripsina-EDTA 0,05 % (v/v), Gibco), fazendo movimentos oscilatórios para cobrir a camada de células com tripsina. Tapam-se os frascos e colocam-se durante 5 a 6 minutos a 37 °C (a tripsina possui o seu pico de atividade a esta temperatura), na incubadora de CO2.

Depois desta incubação, caso as células ainda se mantenham aderentes, recorre-se a uma ligeira "batida ou toque " nos frascos para ajudar o desprendimento das células. Para terminar a tripsinização adiciona-se cerca de 1,5 mL de meio de cultura com soro dado este inativar a tripsina. Homogeneíza-se a suspensão com o auxílio de uma pipeta de Pasteur. De seguida retiram-se aproximadamente 2,0 mL da suspensão para um tubo estéril cónico de 15 mL. Por último acrescentam-se 5 mL de meio de cultura completo ao frasco, e recoloca-se a cultura na incubadora a 37 °C e 5 % de CO2.

3.10.5. Contagem de células e viabilidade celular

Após a tripsinização, e com as células individualizadas, procede-se à contagem das células. O número de células foi determinado através da utilização de um contador automático (TC10 automated cell counter; BIO-RAD, Portugal) onde foi colocada uma alíquota de suspensão de células numa lâmina de leitura (BIO-RAD, Portugal) e realizou-se a contagem de células. Após determinado o número de células por mililitro de suspensão são realizados cálculos de forma a realizar as diluições para 5x104 _{células/ mL.}

3.10.5.1. Determinação da viabilidade celular: princípio do método

O ensaio de viabilidade celular é muito utilizado em ensaios de citotoxicidade, proliferação, viabilidade celular e determinação da função mitocondrial (Nociari et al., 1998; O'Brien et al., 2006).

Este ensaio foi realizado pelo método em microplaca utilizando o Alamar blue (AB), um corante de oxidação/redução que serve como indicador de crescimento e/ou viabilidade celular. A resazurina, principal componente ativo do AB, é azul e não fluorescente na forma oxidada (c.o. absorção 570 nm) e converte-se em resorufina de cor rosa e fluorescente (c.o. absorção 620 nm), após a redução como podemos verificar na figura 12 (Hamid et al., 2004; Nociari et al., 1998; O'Brien et al., 2006; Ribeiro et al., 2004). O AB é captado pelas células ativas e é reduzido pelas oxiredutases da cadeia respiratória, daí que seja um indicador direto da atividade mitocondrial da célula. Há uma correlação direta entre a redução do AB no meio de crescimento e a quantidade/proliferação de organismos vivos, desde as bactérias às células de mamíferos (O'Brien et al., 2006). Este método estima indiretamente o número de células a partir de uma associação colorimétrica ou fluorométrica (Nociari et al., 1998).

Figura 12 - Representação esquemática da reação de redução no teste de viabilidade celular

com alamar blue (adaptado de Hoem, 2013)

3.10.5.2. Procedimento

Para testarmos o efeito dos vários extratos e fracionamento na viabilidade celular das células Caco-2 e HepG2,estas foram sujeitas a subcultura e plantadas em placas de cultura de 96 poços à densidade de 5x104 células/ mL (100 L/poço) e foram deixadas a estabilizar (para adesão ás placas de cultura) por um período de 24 h.

Passado esse tempo, diluiu-se os volumes das soluções stock dos extratos (10 mg/mL) de forma a preparar as 4 concentrações que queríamos testar (50, 100, 200 e 500 µg/mL), em meio de cultura sem soro. Retirou-se o meio de cultura das células em cada poço, adicionou-se 100 µL das soluções teste preparadas anteriormente. As células foram expostas aos extratos e fracionamentos por períodos de 24, 48 e 72 h. No fim de cada tempo de exposição, o meio de cultura com o extrato foi removido, e foram adicionados 100 µL de solução de alamar blue (Invitrogen, Alfagene, Portugal) diluída em meio de cultura sem soro (10% v/v). Apos 4 e 24 h, após a adição do AB, foi medida a absorvência, a 570 e 620 nm no espetrofotómetro de microplacas (Labsystems original Multiskan EX). Foram realizados ensaios em quadruplicados. Os resultados foram analisados em termos do cálculo da % de redução do AB, segundo a expressão:

Equação 2 – Fórmula de cálculo da percentagem da redução de alamar blue.

Na fórmula λ1 e λ2 representa o coeficiente de extinção molar de AB a 570 e 620 nm, respetivamente, no estado oxidado (ox) e reduzido (red). Aλ1 e Aλ2 representam a absorvência da amostra a 570 e 620 nm, respetivamente. A’λ1 e A’λ2representam a média da absorvência do controlo a 570 e 620 nm, respetivamente.