Cupriavidus pauculus

C. pauculus era antigamente chamado de Ralstonia paucula e grupo IV c-2

dos CDC (144). Em 2004 foi avaliada sua semelhança com o C. necator e descrito com sua atual nomenclatura (145). Trata-se de um bacilo gram-negativo, oxidase positiva, não sacarolítico, com motilidade por flagelos e urease fortemente positivo (1, 145).

A extensa maioria dos relatos deste microrganismo em infecção humana foram casos de bacteremia em pacientes imunocomprometidos, infecção através de equipamentos de uso prolongado e sepse (144, 146-151).

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1.3. IDENTIFICAÇÃO BACTERIANA FENOTÍPICA AUTOMATIZADA-

VITEK®_{2 e PHOENIX™}

A automação do diagnóstico, cada vez mais é requisitada pelos microbiologistas devido a enorme variedade de microrganismos nos dias de hoje e a baixa eficiência de identificação dos métodos manuais fenotípicos para identificação de todos. Recomenda-se que a precisão do sistema automatizado exceda 90% na sua habilidade em identificar micro-organismos do ambiente clínico e que este seja capaz de identificar organismos comumente isolados com no mínimo 95% de precisão comparada com as precisões de métodos convencionais (152).

O sistema Vitek®_{2 da BioMeriéux}® _{é um dos equipamentos, junto com o}

Phoenix™ da Beckton & Dickson, mais utilizados nos Laboratórios de Microbiologia Clínica para identificação de microrganismos como bactérias e alguns fungos (153-157). A primeira versão desse sistema de identificação bacteriana automatizado surgiu nos primórdios da corrida espacial quando a McDonnel Douglas Astronautics Co. Bioscience Laboratory introduziu o conceito de detecção, enumeração e identificação de microrganismos no ambiente de uma espaçonave. Empregava cartões plásticos contendo substratos liofilizados para a identificação microbiana e um sistema ótico, para a detecção microbiana, associado a um computador para controle e processamento. Surgiu então, em 1973, o Sistema AutoMicrobic (AMS) (MacDonnell Douglas Corp., St. Louis, Mo.). Pouco depois, o AMS foi reconfigurado para identificar Enterobacteriaceae de amostras clínicas, e mostrou uma precisão de 97,8% para 1.020 isolados comparados aos testes bioquímicos convencionais. O tempo necessário para a identificação bacteriana era cerca de oito horas. O AMS tornou-se comumente conhecido como Vitek. Em 1982, desenvolveu-se um novo cartão que permitiu identificar vários microrganismos

13 não entéricos e reduziu o tempo de processamento para quatro horas. Em 1988, o Sistema Vitek, Inc., foi comprado pela bioMérieux®_{, Inc. e novos melhoramentos foram}

feitos aumentando o número de microrganismos reconhecidos no banco de dados, melhorando a precisão da identificação ao mesmo tempo, em que, diminuía o tempo de liberação dos resultados de 5.7 para 4.1 horas. Em 1997, a bioMérieux® _{introduziu a nova}

geração do equipamento, o Vitek 2, e o cartão ID-GNB (158). Este sistema tem tecnologia baseada em fluorescência e é mais sensível na detecção de alterações metabólicas, fornecendo identificação de microrganismos em tempo aproximado de três horas (159). O ano de 2004 presenciou o advento do VITEK®_{2 Compact. Este sistema utiliza a}

tecnologia “Advanced colorimetry”, conta com a adição de novos substratos em relação às versões anteriores e um banco de dados mais amplo (155, 158).

O Phoenix™ é um sistema automatizado, produzido pela Becton & Dickinson, capaz de promover a identificação e teste de sensibilidade de microrganismos clinicamente significantes. O mesmo é capaz de fornecer rapidamente o resultado sobre a maioria das bactérias aeróbica e anaeróbias facultativas, Gram positivas e Gram negativas, além de alguns fungos que causam agravos nos seres humanos.

Os painéis de identificação bacteriana desse equipamento possuem ao todo 51 cavidades, sendo que 45 contêm substratos bioquímicos desidratados e duas outras cavidades servem como controle para avaliar a capacidade de emissão da fluorescência. Através dos substratos liofilizados, presentes no interior do painel de ID (identificação), são possíveis as análises da capacidade de fermentação, oxidação, degradação e hidrólise do microrganismo pesquisado. Esses testes efetuados são semelhantes aos métodos fenotípicos convencionais, porém são modificados, já que são utilizados

14 substratos cromogênicos e fluorogênicos. A detecção dos substratos cromogênicos a base de P-nitrofenil ou P-nitroanilida são apontadas pela formação da cor amarela, evidenciando a utilização do mesmo a partir de uma hidrólise enzimática. Já os substratos fluorogênicos, evidenciam a hidrólise a partir da liberação de um derivado fluorescente de cumarina.

Além destes, existem outras formas para que o equipamento consiga avaliar e detectar o metabolismo do microrganismo estudado, como por exemplo, utilizar somente um determinado componente como única fonte de carbono, através da redução do indicador a base de resazurina. E a partir dos resultados obtidos do metabolismo é efetuado o confronto com o banco de dados presente no equipamento, levando a identificação e liberando, em porcentagem, a probabilidade de realmente ser o microrganismo apontado (160-162).

1.4. PCR COMO RECURSO LABORATORIAL PARA IDENTIFICAÇÃO

BACTERIANA

Na busca de ferramentas para caracterização ao nível de gênero e espécie bactériana não fermentadoras, a Biologia Molecular a cada dia é mais utilizada. Entre estas destaca-se a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), que possibilita a amplificação específica de uma região do DNA delimitada por duas sequências iniciadoras – oligonicleotídeo, que possibilitam a identificação da bactéria ao nível de gênero, e em muitos casos de espécie. Isso ocorre porque o amplicon é específico para

15 cada microrganismo a ser analisado, utilizando regiões gênicas com variantes que possibilitam a identificação pela presença de amplificação direta do DNA extraído.

Existe para algumas bactérias oligonucleotídeos específicos, como por exemplo: R. pickettii, R. mannitolilytica e O. anthropi (116, 163, 164), que são usados para a identificação bacteriana e descritos na literatura científica. Porém, este método ainda não satisfaz, por completo, as necessidades de identificação de todas as bactérias não fermentadoras, sendo em alguns casos difícil de encontrar um primer espécie- específica, bem como ter total certeza do resultado obtido pela amplificação de um fragmento simples do DNA. Assim, em busca de um método mais específico e sensível, o sequenciamento genético vem sendo mais utilizado (165).

1.5. ESPECTROMETRIA DE MASSAS - MALDI-TOF

A espectrometria de massa é uma técnica micro analítica utilizada para obter informação do peso molecular e de características estruturais da amostra. A espectrometria de massa é uma das mais importantes ferramentas analíticas capazes de fornecer informação sobre: a composição elementar de amostras; a estrutura molecular; a composição qualitativa e quantitativa de misturas complexas; a estrutura e a composição de superfícies sólidas e as proporções isotópicas de átomos em amostras.

Na espectrometria de massa, a energia, fornecida pelo laser, é transferida à amostra para causar a sua ionização. O requisito básico para uma análise por espectrometria de massa é a formação de íons livres em fase gasosa. O alcance e a utilidade do método são ditados pelo processo de ionização. A aparência do espectro de

16 massa de uma espécie molecular é altamente dependente do método de ionização usado (166, 167).

Os agentes ionizantes empregados em espectrometria de massa são distribuídos em duas categorias: as que requerem a amostra em fase gasosa e os agentes que provocam dessorção em amostras sólidas ou liquidas. A vantagem dos últimos é que são aplicáveis a amostras não voláteis e termicamente instáveis. Este é o caso da técnica de espectrometria de massa utilizado para identificação de bactérias (168, 169).

O MALDI-TOF é composto por 4 componentes principais: a ionização das moléculas, a dessorção, o laser, e a matriz. A matriz consiste em uma molécula orgânica que irá contribuir para a oferta de carga elétrica às moléculas da bactéria. O laser será responsável em gerar esta energia para que ocorra a ionização e em seguida a dessorção, ou seja, separação, destas moléculas. Após a ionização, as moléculas ficam presas a um campo elétrico, evitando que as mesmas se percam no espaço. Logo após o campo elétrico, existe o tubo a vácuo, por onde as moléculas irão se deslocar devido a pressão negativa que irá sugá-las. Este deslocamento, juntamente com a carga elétrica e massa da molécula, serão componentes fundamentais para a elaboração do espectro de massas, que será formado através de um receptor localizado ao fim do tudo de vácuo, conectado à um transdutor de sinal ligado a um computador. Este espectro de massa irá compor a identidade de cada bactéria, pois cada microrganismo possui um conjunto de proteínas específicas de cada espécie. As moléculas interpretadas pelo aparelho são as proteínas ribossomais, devido a grande quantidade disponível nas bactérias e conservação dentro da mesma espécie (169-171).

17 Desse modo, o MALDI-TOF foi adaptado com sucesso para a identificação de microrganismos rotina em laboratórios de microbiologia clínica nos últimos 10 anos. Esta técnica revolucionária permite o diagnóstico mais fácil e mais rápido dos patógenos humanos do que os métodos fenotípicos convencionais e métodos de identificação molecular, com uma confiabilidade, rapidez e custo-efetividade elevados (169-171).

A relevância deste trabalho está em analisar os diferentes métodos de identificação de BGN-NFs raros de importância clínica, principalmente em pacientes com Fibrose Cística e em pacientes internados, pois estes são susceptíveis às infecções oportunistas destas bactérias. Como estes microrganismos são de rara frequência, muitos não são identificados corretamente por ausência de metodologias confiáveis na identificação ou por desconhecimento dos microbiologistas. Esta análise se justifica para melhor conhecimento das vantagens e limitações destes métodos, pelas repercussões clínicas e epidemiológicas e para considerações sobre a necessidade de métodos alternativos mais eficientes.

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2. OBJETIVOS