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ÉLIO BARRETO DE CARVALHO FILHO
IDENTIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS NÃO FERMENTADORAS ISOLADAS DE
PACIENTES COM FIBROSE CÍSTICA E EM HEMOCULTURAS DE
PACIENTES INTERNADOS NO HC DA UNICAMP.
Campinas
2015
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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
Faculdade de Ciências Médicas
ÉLIO BARRETO DE CARVALHO FILHO
IDENTIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS NÃO FERMENTADORAS ISOLADAS DE PACIENTES COM FIBROSE CÍSTICA E EM HEMOCULTURAS DE PACIENTES INTERNADOS NO HC
UNICAMP
Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para obtenção de título de Mestre em Ciências, na área de concentração Saúde da Criança e do Adolescente.
Orientador: Prof. Dr. Carlos Emílio Levy
Campinas 2015
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDENTE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELO ALUNO ÉLIO BARRETO DE CARVALHO FILHO E ORIENTADO PELO PROF. DR. CARLOS EMÍLIO LEVY.
__________________________ Assinatura do(a) Orientador(a)
Ficha catalográfica
Universidade Estadual de Campinas Biblioteca da Faculdade de Ciências Médicas
Maristella Soares dos Santos - CRB 8/8402
Carvalho Filho, Élio Barreto,
C253i CarIdentificação de bactérias não fermentadoras isoladas de pacientes com fibrose cística e em hemoculturas de pacientes internados no HC da Unicamp / Élio Barreto de Carvalho Filho. – Campinas, SP : [s.n.], 2015.
CarOrientador: Carlos Emílio Levy.
CarDissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas.
Car1. Bactérias aeróbias gram-negativas. 2. Espectrometria de massas por ionização e dessorção a laser assistida por matriz. 3. Reação em cadeia da polimerase. 4. Fibrose cística. I. Levy, Carlos Emílio,1949-. II. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Ciências Médicas. III. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Identification of non fermentative bacteria isolated from patients with cystic fibrosis and from blood cultures of hospitalized patients at Hospital de Clinicas Unicamp Palavras-chave em inglês:
Gram-negative aerobic bacteria
Spectrometry, Mass, Matrix-assisted laser desorption-ionization Polymerase chain reaction
Cystic fibrosis
Área de concentração: Saúde da Criança e do Adolescente Titulação: Mestre em Saúde da Criança e do Adolescente Banca examinadora:
Carlos Emílio Levy [Orientador] Jorge Luiz Mello Sampaio Maria Luiza Moretti
Data de defesa: 05-03-2015
Programa de Pós-Graduação: Saúde da Criança e do Adolescente
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RESUMO
Introdução: Bacilos gram-negativos não fermentadores (BGN-NFs) são microrganismos que se caracterizam
pela incapacidade de utilizar a glicose como fonte de energia pela fermentação, degradando-a pela via oxidativa. A identificação dos BGN-NFs continua sendo um desafio para os laboratórios de rotina em microbiologia pela dificuldade de identificação, em virtude, da baixa ocorrência em amostras ambulatoriais, assim como, pela falta de recursos rápidos, eficientes e pela complexidade e alto custo dos testes de identificação. Estes microrganismos têm importância clínica para pacientes imunocomprometidos com infecções sistêmicas e pacientes com Fibrose Cística, com infecções oportunistas pulmonares. Nosso objetivo foi utilizar técnicas fenotípicas e de espectrometria de massas para identificar BGN-NFs pouco frequentes isolados em amostras clínicas de pacientes com FC e de pacientes internados no Hospital de Clínicas-Unicamp. Método: Foram analisados 71 isolados de amostras clínicas recuperadas do Banco de bactérias do Laboratório de Microbiologia do HC-Unicamp,
envolvendo Chryseobacterium indologenes, Elizabethkingia meningoseptica, Cupriavidus pauculus,
Ochrobactrum anthropi, Ralstonia pickettii, Ralstonia mannitolilytica, Ralstonia insidiosa, identificados por técnicas
fenotípicas (provas bioquímicas manuais padronizadas pelo Laboratório de Microbiologia [método fenotípico
manual] e automatizadas pelo Vitek®2, Phoenix™) e por espectrometria de massa MALDI-TOF MS (BioMerieux®)
e MALDI BD (Becton& Dickson®). Para 41 isolados de Ralstonia sp. e Ochrobactrum anthropi estes métodos também foram comparados com PCR, pois não foram encontrados oligonucleotídeos específicos para os demais BGN-NFs estudados. Resultados: pelo método Fenotípico Manual foi possível identificar ao nível de espécie 54,9% dos isolados, apenas gênero 19,7% e 25,4% não puderam ser identificados. Houve uma baixa
concordância entre as técnicas Fenotípica Manual e a Automatizada Vitek®2, sendo de 50,7%, quando
considerada a concordância pelo menos ao nível de gênero. A maior concordância verificou-se entre os dois equipamentos de MALDI-TOF, de 87,3%, quando considerada a concordância pelo menos ao nível de gênero.
Discussão: Quando comparamos todos os métodos utilizados para identificação dos 71 isolados encontramos
uma concordância simultânea de 23,9% (17/71), quando considerado pelo menos ao nível de gênero e apenas 2
(2,8%) ao nível de espécie. Quando comparamos os métodos Fenotípico Manual, Vitek®2, Phoenix™, MALDI
MS, MALDI BD e incluindo PCR para a identificação de 41 amostras de Ralstonia sp. e Ochrobactrum anthropi, encontramos uma concordância simultânea de 19,5% (8/41) quando considerado pelo menos ao nível de gênero e 2 (2,8%) de espécie. Possíveis justificativas para a baixa concordância entre as metodologias seriam a diversidade de princípios, de acurácia e de bancos de dados dos métodos. Conclusão: É muito baixa a concordância entre as diferentes metodologias utilizadas, sendo que os equipamentos de MALDI-TOF possuem entre si uma correlação muito boa para identificação de BGN-NFs, porém mostram-se discordantes aos níveis de confiança dos resultados. Foi encontrada uma importante limitação na PCR apresentando reação cruzada com gêneros testados, sugerindo não ser confiável para este fim. Para os gêneros estudados e as metodologias empregadas, a discordância dos resultados sugerem cautela pela possibilidade de erro de identificação.
viii
Palavras-chave: Bactérias Gram-negativas aeróbias; Espectrometria de Massas por Ionização e Dessorção a
Laser Assistida por Matriz; Reação em Cadeia da Polimerase; Fibrose Cística; Infecção relacionada à assistência à saude.
ix
ABSTRACT
Introduction: Gram-negative non-fermenting (GN-NFB) are microorganisms that are characterized by the inability
to use glucose by fermentation as an energy source, degrading it by the oxidative pathway. The identification of BGN-NFS remains a challenge for the routine of microbiology laboratories, due to the low occurrence in outpatient samples, the lack of fast and efficient resources and the complexity and high cost of the tests. These microorganisms are clinically important for immunocompromised patients with systemic infections and patients with Cystic Fibrosis, with opportunistic pulmonary infections. Our goal was to use phenotypic and mass spectrometry techniques to identify uncommon GN-NFB isolated in samples from CF patients and patients admitted to the Hospital de Clinicas Unicamp. Method: 71 isolates recovered from clinical specimens were selected from the from the Microbiology Laboratory bacteria collection, previously identified by fenotipic methods as Chryseobacterium indologenes, Elizabethkingia meningoseptica, Cupriavidus pauculus, Ochrobactrum
anthropi, Ralstonia pickettii, Ralstonia mannitolilytica, Ralstonia insidiosa. The samples were identified by in house
Phenotypic manual method, automated by Vitek®2, by Phoenix™ and MALDI-TOF mass spectrometry MS
(BioMerieux®) and MALDI BD (Becton Dickson®). These methods were also compared to PCR for only 41 isolates of Ralstonia sp. and Ochrobactrum anthropi, because they were not found specific primers for the other GN-NFB analised. Results: the phenotypic Manual method identified to species level 54.9% of the isolates, 19.7% only to genera and 25.4% were not identified. There was a poor correlation between the techniques phenotypic Manual
method and Automated Vitek®2, with 50.7% of agreement, when considering at least in terms of gender. The best
agreement of 87.3% occurred between the results of the two MALDI-TOF equipment, when considering the correlation of at least at the level of genus. Discussion: When comparing all the methods used for the identification of 71 isolates were found simultaneous agreement of 23.9% (17/71) when considered at least to genus level and
only 2 (2.8%) to species level. When analyzed the phenotypic Manual method, Vitek®2, Phoenix™, MALDI MS,
MALDI BD and PCR applied to 41-GN-NFB samples, simultaneous agreement were found for 19.5% (8/41) when considered at least to genus level and 2 (2.8%) to species. Possible reasons for the low agreement between the methodologies could be the diversity of principles, accuracy and databases of the methods. Conclusion: The two methods of MALDI-TOF have a very good correlation for GN-NFB identification, however showed discordance for the confidence levels of results. With the primers tested one important limitation of the PCR is the cross-reaction among many genera, suggesting not to be safe for the discrimination of the analyzed genera. For the genera and methods analised the discrepancy of results suggests caution because of the possibility of wrong identification.
Keywords: Gram-Negative Aerobic Bacteria; Spectrometry, Mass, Matrix-Assisted Laser
xi
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO _____________________________________________________________ 1 1.1. IMPORTÂNCIA DAS BACTÉRIAS NÃO FERMENTADORAS _________________________ 1 1.1.1. INFECÇÃO HOSPITALAR E BACTÉRIAS NÃO FERMENTADORAS _______________________ 2 1.1.2. FIBROSE CÍSTICA E BACTÉRIAS NÃO FERMENTADORES _____________________________ 4 1.2. BACILOS GRAM- NEGATIVOS NÃO FERMENTADORAS ___________________________ 6
1.2.1. Chryseobacterium indologenes_______________________________________________________ 6
1.2.2. Elizabethkingia meningoseptica ______________________________________________________ 8
1.2.3. Ochrobactrum anthropi ____________________________________________________________ 9
1.2.4. Ralstonia sp. ____________________________________________________________________ 10
1.2.5. Cupriavidus pauculus _____________________________________________________________ 11
1.3. IDENTIFICAÇÃO BACTERIANA FENOTÍPICA AUTOMATIZADA- VITEK®2 e PHOENIX™ ___ 12
1.4. PCR COMO RECURSO LABORATORIAL PARA IDENTIFICAÇÃO BACTERIANA _________ 14 1.5. ESPECTROMETRIA DE MASSAS - MALDI-TOF __________________________________ 15 2. OBJETIVOS _______________________________________________________________ 19 3. MÉTODO ________________________________________________________________ 21 3.1. ASPECTOS ÉTICOS DA PESQUISA ________________________________________________ 21 3.2. DESENHO DO ESTUDO ________________________________________________________ 22 3.3. CRITÉRIOS PARA SELEÇÃO DOS GENEROS ESTUDADOS ______________________________ 22 3.4. ISOLADOS ESTUDADOS _______________________________________________________ 23 3.5. ARMAZENAMENTO DOS ISOLADOS _____________________________________________ 23 3.6. IDENTIFICAÇÃO BACTERIANA __________________________________________________ 24
IDENTIFICAÇÃO MANUAL FENOTÍPICA ________________________________________________ 25 IDENTIFICAÇÃO FENOTÍPICA AUTOMATIZADA PELO VITEK®2 BioMerieux (Vitek® 2) ___________ 32
IDENTIFICAÇÃO FENOTÍPICA PELA AUTOMAÇÃO PHOENIX™ BD ___________________________ 36 IDENTIFICAÇÃO POR PCR __________________________________________________________ 38
3.6.4.1. EXTRAÇÃO DO DNA GENÔMICO PARA PCR __________________________________________ 38
3.6.4.2. QUANTIFICAÇÃO DO DNA PARA PCR _______________________________________________ 39
3.6.4.3. ALINHAMENTO DOS OLIGONUCLEOTÍDEOS PARA PCR_________________________________ 40
3.6.4.4. GRADIENTE PARA TEMPERATURAS DE ANELAMENTO _________________________________ 40
3.6.4.5. PCR _________________________________________________________________________ 41
IDENTIFICAÇÃO POR MALDI-TOF ____________________________________________________ 42
3.6.5.1. PREPARAÇÃO DA AMOSTRA _____________________________________________________ 42
3.6.5.2. EQUIPAMENTOS UTILIZADOS _____________________________________________________ 43
3.6.5.3. INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS _______________________________________________ 43
xii
4. RESULTADOS _____________________________________________________________ 45 5. DISCUSSÃO ______________________________________________________________ 63 6. CONCLUSÃO _____________________________________________________________ 81
xiii
DEDICATÓRIA
Dedico esta dissertação aos meus pais que muito me incentivaram a desbravar novos desafios, novos caminhos, focando sempre no crescimento pessoal e profissional. Esforcei-me ao máximo para fazer valer todo o sacrifício de vocês. Todo esse suor, resumido nestas páginas, é para vocês. Obrigado por tudo!
xv
AGRADECIMENTOS
Agradeço, primeiramente, a Deus pela oportunidade de me presentear com pais maravilhosos, me apresentar a verdadeiros amigos, algumas vezes anjos e derramar sobre mim serenidade quando mais precisei.
A minha família, em especial aos meus pais, Élio Barreto de Carvalho e Solimar Moreira Mendes de Carvalho, por todo o esforço em possibilitar a realização de um sonho.
A minha noiva, Loredana Gomes da Costa, por todo Amor, paciência e apoio durante todo este tempo.
Ao amigo, Fernando Marson, que me ajudou desde o início, sanando dúvidas, compartilhando anseios, sendo fundamental para meu crescimento profissional e finalização deste trabalho. Meus eternos agradecimentos à você, querido amigo.
Aos amigos de Campinas-SP, que me abriram portas, e aos que fecharam também, pois só assim consegui seguir o caminho correto. Quero destacar o enorme incentivo do Prof. Dr. Nilson Antunes, o primeiro a me receber em Campinas, sem ele seria, imensamente, mais difícil esta trajetória. Muito obrigado, Professor. Ao meu orientador, Prof. Dr. Carlos Emilio Levy, que abriu as portas da Microbiologia, quando eu ainda não era aprimorando do Laboratório. Com o senhor aprendi a ser um pesquisador de verdade, com metas e foco. Serei, eternamente, grato pela oportunidade, confiança e longas conversas, com as quais sempre aprendo sobre pesquisa e sobre a vida. Muito obrigado.
Ao Laboratório de Microbiologia Clínica do Laboratório de Patologia Clínica – HC Unicamp, em nome da Dra. Angela von Nowakonski, que possibilitou a realização da pesquisa.
xvi
Não só, agradeço à Dra. Angela por todos os ensinamentos de microbiologia e incentivo durante este tempo. Aos funcionários da Microbiologia, meu agradecimento, em especial a Denise Abonicio que tanto ajudou no trabalho, sempre disposta a ajudar, e ainda, a duas pessoas especiais, que me possibilitaram um sentimento fraterno em meio a tuburlências, Elisete e Kelly Krempser, meu eterno agradecimento a nossa amizade.
Aos amigos: Pamella Firmino, Debora Sant´Anna e Agesilau Bastos Martins, que próximos ou distantes, sempre estão presentes em qualquer vitória minha, pois amigos verdadeiros alimentam e sustentam a alma, e não o corpo. Meu muito obrigado.
Nesta caminhada, agradeço pela companhia e aprendizados daqueles que chegaram e fizeram a diferença: Talita Aiello, Mauro Arrym, muito obrigado por toda ajuda e disponibilidade. Erika Franciolli e Lorena Alves, minhas queridas aprimorandas e agora especialistas em microbiologia, obrigado por permitirem que meu aprendizado como futuro mestre se fizesse mais completo, por ter vocês como minhas orientandas. Obrigado pela amizade e aprendizado.
Agradeço a instituição fomentadora, CAPES, pela bolsa de estudo, que sem ela, as dificuldades só exponenciariam.
Agradeço ao Laboratorio Fleury, LacTad, FAEPEX pelo suporte técnico e financeiro.
Aos colaboradores deste trabalho: Prof. Dr. Marcelo Lancelloti, Profa. Dra. Luciana Holanda, Prof. Dr. Jorge Sampaio, Prof. Dr. Marcelo Ramos de Oliveira, Profa. Dra. Maria Luiza Moretti, Prof. Dr. John McCulloch, Profa. Dra.Elsa M. Mamizuka. À biomédica Lorena Alves pelo interesse e ajuda significativa.
xvii
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Pags
Figura 1: Prova da oxidase utilizando-se a solução N-N-N Tetrametylparaphenilenediamine
dihydrochloride em papel de filtro... 25
Figura 2: Interpretação da prova de oxidação-fermentação de Hugh e Leifson... 26
Figura 3: Preparação do inoculo para identificação no sistema automatizado Vitek®2
(BioMeriéux)... 32
Figura 4: Folha de pré registro... 34
xix
LISTA DE QUADROS
Pags
Quadro 1: Provas bioquímicas realizadas utilizadas na identificação fenotípica de bacilos
gram negativos não-fermentadores de glicose...
27
Quadro 2: Interpretação de provas bioquímicas para BGN-NF pouco frequentes segundo
VERSALOVIC,2011... 31
Quadro 3: Lista de provas no cartão GN de identificação bioquímica para bacilos Gram
negativos – Vitek®2 Compact (bioMeriéux® Vitek Inc., St. Louis, MO) ... 33
Quadro 4: Oligonucleotídeos, temperatura de anelamento e sua respectiva referência
xxi
LISTA DE TABELAS
Pags
Tabela 1 – Número e percentual de bactérias não fermentadoras identificadas pelo método
fenotípico Manual, segundo o nível de identificação...
49
Tabela 2 – Número e percentual de bactérias não fermentadoras identificadas pelo VITEK-2
segundo a qualidade de identificação... 50
Tabela 3 – Número e percentual de bactérias não fermentadoras identificadas pelo
MALDI-MS segundo o Score de identificação... 51
Tabela 4 – Número e percentual de bactérias não fermentadoras identificadas pelo
MALDI-BD segundo o Score de identificação... 52
Tabela 5 – Número e percentual de bactérias não fermentadoras identificadas pelo Phaenix
segundo a qualidade de identificação... 53
Tabela 6. Comparação entre as técnicas Fenotípicas Manuais, Vitek®2, MALDI MS, MALDI
BD com o Phoenix™ para 71 BGN-NF... 54
Tabela 7 – Comparação entre as técnicas Fenotípicas Manuais, Vitek2, MALDI MS, MALDI
BD entre si, segundo o nível de identificação para 71 BGN-NF... 55
Tabela 8 – Concordância entre as técnicas Fenotípicas Manuais, Vitek2, MALDI MS, MALDI
BD e PCR, segundo o nível de identificação para 41 amostras de BGN-NF... 56
Tabela 9 – Comparação entre scores de confiança das técnicas MALDI MS e Vitek®2 com o
nível de identificação para 71 BGN-NF... 57
Tabela 10 – Comparação entre scores de confiança das técnicas MALDI BD e Vitek®2 e o
nível de identificação para 71 BGN-NF... 58
Tabela 11 – Comparação entre scores de confiança das técnicas MALDI BD e MALDI MS e
o nível de identificação para 71 BGN-NF... 59
Tabela 12 – Identificação de Cepas padrão pelas técnicas: Manual Fenotípica, Vitek2, MALDI
MS, PCR... 60
Tabela 13. Teste de especificidade dos oligonucleotídeos Rp, Rm, Ri, e Oa para 10 espécies
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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
BGN-NFs: Bacilos Gram negativos não fermentadores. FC: Fibrose Cística
IH: Infecção Hospitalar
IRAS: Infecção associada a assistência à Saúde HC: Hospital das Clínicas
CFTR: Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator CDC: Centers for Disease Control and Prevention
MALDI-TOF MS: Matrix assisted laser desorption ionization–time of flight mass spectrometry UNICAMP: Universidade Estadual de Campinas
APPA: Ala-Fe-pro-Arilamidase: ADO: Adonitol
lARL: L-Pirrolidonil – Arilamidase L-Arabitol dCEL: D-Celobiose
BGAL: Beta-Galactosidase H2S: Produção de H2S
BNAG: Beta-N-Acetil-Glucosaminidase AGLTp: Glutamil Arilamidase pNA dGLU: D-Glucose
GGT: Gama-Glutamil-Transferase OFF: Oxidação / Fermentação BGLU: Beta-Glucosidase dMAL: D-Maltose
xxiv
dMNE: D-Manose BXYL: Beta-xilosidase
BAlap: Beta-Alanina arilamidase pNA ProA: L-Prolina Arilamidase
LIP: Lipase PLE: Palatinose
TyrA: Tirosina Arilamidase URE: Urease
dSOR: D-Sorbitol
SAC: Sacarose / Sucrose dTAG: D-Tagatose
dTRE: D-Trealose CIT: Citrato (sódio) MNT: Malonato
5KG: 5-Keto-D-Gluconato
ILATk: Alcalinização L-Lactato AGLU: Alfa-Glucosidase
SUCT: Alcalinização Sucinato
NAGA: Beta-N-Acetil-Glucosaminidase AGAL: Alfa-Galactosidase
PHOS: Fosfatase
GlyA: Assimilação Glicina Arilamidase ODC: Ornitina descarboxilase
LDC: Lisina descarboxilase ODEC: Base descarboxilase
xxv
lHISa: Assimilação L-histidina CMT: Cumarato
BGUR: Beta-Glucoronidase
O129R: Resistência O/129 (comp.vibrio) GGAA: Glu-Gli-Arg-Arilamidase
lMLTa: Assimilação L-Malato ELLM: ELLMAN
xxvii LISTA DE SÍMBOLOS ®, ™ : Marca registrada. µL: microlitro. mL: mililitro. ºC: graus Celcius.
1
1. INTRODUÇÃO
1.1. IMPORTÂNCIA DAS BACTÉRIAS NÃO FERMENTADORAS
Os bacilos gram-negativos classificados como não fermentadores (BGN-NFs) são microrganismos, não esporulados, que se caracterizam por serem incapazes de utilizar carbohidrato como fonte de energia pela fermentação, degradando-os pela via oxidativa (1-3).
A identificação dos BGN-NFs é um desafio para os laboratórios de rotina em microbiologia, considerando que a maioria deles tem dificuldades para realizar esta identificação, fazendo de maneira elementar, em virtude da pouca incidência de amostras ambulatoriais, assim como pela falta de recursos rápidos, eficientes, pela complexidade e alto custo dos testes de identificação(1-4).
A maioria dos laboratórios clínicos conta com métodos manuais, automatizados ou semi-automatizados para identificação dos BGN-NFs. Os perfis fenotípicos, incluindo atividade enzimática e/ou metabólicas não são características estáticas e mudam com o stress e a evolução dos microrganismos. Assim, quando estes apresentam fenótipos raros e não estão inclusos na base de dados de referência, sua identificação é comprometida. Há significativo número de referências na literatura sobre a frequência de erros laboratoriais na identificação BNFs, mas muito escasso sobre seu impacto no atendimento ao paciente (5, 6).
A caracterização deste grupo de bactérias é de importância tanto para os casos de infecções oportunistas, destacando-se as infecções hospitalares, assim como para pacientes com fibrose cística (FC) com infecções pulmonares crônicas. Embora sua
2 incidência seja baixa, quando comparada a outros microrganismos, geralmente, estes apresentam resistência elevada a vários antibióticos sendo relacionadas a surtos, capazes de causar infecções graves (1-4, 7, 8).
1.1.1. INFECÇÃO HOSPITALAR E BACTÉRIAS NÃO FERMENTADORAS
A infecção hospitalar (IH), ou infecção relacionada à assistência a saúde (IRAS) é adquirida após a admissão do paciente na unidade hospitalar e se manifesta durante a internação ou após a alta, quando está relacionada com a internação ou procedimentos hospitalares (9).
A IRAS consiste em grave problema de saúde mundial que relacionao-e com altas taxas mortalidade e morbidade, aumento do tempo de internação e dos custos para o sistema de saúde, constituindo um desafio para a medicina (10).
O envelhecimento da população, que no Brasil chega a quase 11% da população, e a ocorrência de situações que predispõe à incapacidade imunológica, como, por exemplo, o emprego de fármacos imunossupressores, adoção de técnicas invasivas de diagnóstico e tratamento, favoreceram o surgimento de agentes oportunistas que, em situações propícias, assumem papel relevante como patogênicos (9, 11).
A IRAS não é somente complicação frequente em pacientes de terapia intensiva, mas também indicador da qualidade da assistência médica, inclusas, neste contexto, as práticas profissionais e as condições operacionais e estruturais oferecidas pelas instituições de saúde(10).
As bactérias mais isoladas em casos de IRAS variam para cada hospital, em função do tipo de pacientes atendidos e tratamentos oferecidos, mas em geral predominam as enterobactérias Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae e Enterobacter
3
sp, os Staphylococcus coagulase negativos e Staphyloccus aureus e a seguir bactérias
não fermentadoras como Acinetobacter baumannii e Pseudomonas aeruginosa(12-18). No Hospital de Clínicas-Unicamp, durante o ano de 2008, de 4.793 pacientes internados, com diversos diagnósticos, colheram-se 15.518 amostras de hemoculturas, sendo 2.132 positivas perfazendo um total de 13,73%. Os microorganismos com maior porcentagem de isolamento foram: Staphylococcus coagulase negativa (26,6%),
Klebsiella sp. (10,3%), E. coli (9,5%), Staphylococcus aureus (9,1%), Enterobacter sp.
(7,0%), Acinetobacter sp. (6,2%), P. aeruginosa 5,7% e Candida sp (4,8%). Outros não fermentadores como Stenotrophomonas maltophilia, complexo Burkholderia cepacia,
Ralstonia sp., representaram individualmente menos de 1% dos casos (19).
Em recente revisão das 14.000 hemoculturas do HC-Unicamp positivas no período de 2007 a 2012 isolaram-se 299 amostras positivas para BNFs raros (2,1%), referentes a 172 pacientes (1,23%) (excluídos P. aeruginosa, Acinetobacter sp. e S.
maltophilia) encontrou-se a seguinte frequência das bactérias não fermentadoras raras: Pseudomonas sp. (18%), Ralstonia pickettii (8,7%), Ralstonia mannitolilytica (2,3%) e Chryseobacterium indologenes (2,3%), Achromobacter denitrificans (2,3%),
Ochrobactrum anthropi (1,7%), Elizabethkingia meningoseptica (1,7%) e Cupriavidus pauculus (1,7%) e Achromobacter xylosoxidans (1,2%),(20).
Em um levantamento de três hospitais localizados no Rio de Janeiro, Florianópolis e São Paulo de janeiro 1997 a dezembro de 1999, Sader e colaboradores (14) coletaram amostras provenientes de hemoculturas, infecção de trato respiratório e ferida ou pele de tecidos moles. De um total de 3728 casos, 2008 foram de hemoculturas, 822 de infecções do trato respiratório, 468 de casos em infecção do trato urinário e 430 de feridas ou pele de tecidos moles. Os microrganismos de maior ocorrência foram:
4
Staphylococcus aureus 22,8% (852/3728), E. coli 13,8% (516/3728),K. pneumoniae 8,5%
(318/3728) P. aeruginosa 13.3% (496/3728). Quando consideramos apenas hemoculturas, os percentuais são semelhantes, sendo 23,6%, 11,3%, 8,9% e 7,5% respectivamente (14).
1.1.2. FIBROSE CÍSTICA E BACTÉRIAS NÃO FERMENTADORES
A FC consiste em uma exocrinopatia, mais comum em caucasianos e é comumente letal. Esta se caracteriza pelo defeito no transporte iônico da membrana celular nas células epiteliais das vias aeríferas, pâncreas, glândulas salivares, sudoríparas, intestino e aparelho reprodutor, resultando em secreções mucosas espessas e viscosas, que causam obstrução de ductos e canalículos glandulares. A doença possui uma tríade clínica característica: doença pulmonar obstrutiva, supurativa crônica, com evolução progressiva para dor pulmonar; insuficiência pancreática com má absorção, desnutrição secundária e níveis anormalmente elevados de cloro no suor (21-28).
A FC possui prevalência que varia de acordo com a localização geográfica. De modo geral, estima-se que cerca de 70.000 a 100.000 pessoas são acometidas pela doença no mundo, sendo mais comum na Europa, com ocorrência de 1 para cada 3.000 nascimentos. Entre os latino-americanos a relação é de 1 para cada 4.000 a 10.000 habitantes (22, 29).
A FC é uma doença autossômica recessiva, cujo gene está localizado na região 7q31, sendo composto por aproximadamente 27 éxons. O gene transcreve um mRNA de 6,4 Kb, que codifica uma proteína denominada de CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator), composta de 1480 aminoácidos, responsável,
5 principalmente, pela regulação do transporte iônico do Cl-, Na+ e da H2O pela membrana
celular, e consequentemente, pela manutenção do equilíbrio iônico e osmótico das células. Dessa forma, a doença ocorre pela deficiência ou ausência da atividade funcional da CFTR, decorrente da mutação de dois alelos no gene CFTR (30-32).
Aproximadamente 2.000 mutações foram descritas, porém, a mais frequente é a F508del, presente em cerca de 70% dos alelos mutados. As mutações no gene CFTR são divididas em seis classes, de acordo com o mecanismo de cada defeito. A F508del é uma mutação de classe II, na qual a CFTR sofre defeito na maturação durante sua passagem pelo Complexo de Golgi (27, 32, 33).
Devido a este problema na síntese ou funcionamento da proteína CFTR, existem inúmeras manifestações clínicas, nas quais a principal é a doença pulmonar. Esta doença acomete cerca de 80% dos pacientes com FC, sendo a principal causa de mortalidade. O acometimento do trato respiratório é progressivo e de intensidade variável, caracterizado por inflamações e infecções permanentes. A relação entre inflamação e infecção se torna um ciclo vicioso, causando danos pulmonares progressivos e irreversíveis (28, 29, 34-40).
Na infância, geralmente os pacientes se infectam primeiramente por S.
aureus, Haemophilus influenzae e por P. aeruginosa, considerada o principal agente
infeccioso envolvido na pneumopatia crônica dos pacientes. A colonização inicial geralmente ocorre com cepas móveis, “não mucoides”, ou “planctônicas” que, com a evolução da doença, tornam-se mais virulentas, alteram sua morfologia, perdem os flagelos, tornam-se imóveis e passam a produzir cápsula de alginato, que lhes confere a capacidade de crescer formando “biofilmes” com característica “mucoide” (4, 41).
6 Um dos principais motivos para que isso ocorra é a presença de muco espesso e viscoso, que dificulta a erradicação dos microrganismos do trato respiratório, em especial P. aeruginosa. Assim, o uso prolongado de antibióticos é necessário e contribui para a seleção natural de microrganismos, tais como, cepas mucoides de P. aeruginosa, além de favorecer a colonização e infecção por outros agentes com resistência intrínseca aos antibióticos, como o Complexo B. cepacia. Outros microrganismos oportunistas são selcionados como bactérias não fermentadoras, com importância clínica ainda pouco conhecida como: Chryseobacterium indologenes, Elizabethkingia meningoseptica,
Ochrobactrum anthropi, Ralstonia pickettii, Ralstonia mannitolilytica, Ralstonia insidiosa, Cupriavidus pauculus (9, 31, 42-44).
A importância na identificação de bactérias não fermentadoras raras é reconhecida devido à gravidade das doenças em que estas são associadas, bem como, a dificuldade atual dos Laboratórios de microbiologia na sua identificação. Isto se deve a diversidade de agentes, a dificuldade de caracterização, a falta de experiência de microbiologistas com microrganismos menos frequentes, a limitação dos recursos manuais e automatizados para a caracterização e a carência de dados na literatura (3, 9, 44, 45).
1.2. BACILOS GRAM- NEGATIVOS NÃO FERMENTADORAS
1.2.1. Chryseobacterium indologenes
O gênero Chryseobacterium sp. compreende seis espécies que foram previamente designadas como Flavobacterium. Estes microrganismos são bacilos aeróbios gram-negativos, não fermentadores, imóveis, catalase e oxidase positivo (1, 46).
7 Apresentam produção do pigmento flexirrubina, que confere coloração amarelada. Também é responsável por ampla beta hemólise em cultura de ágar sangue dentro de três dias (47, 48).
O C. indologenes se encontra no solo, plantas, alimentos e na água. No ambiente hospitalar está presente no sistema de água, superfície de equipo e aparato médico úmido (respiradores, tubos, umidificadores e outros) (49, 50).
Em 1993 foi isolada a primeira cepa de C. indologenes de um aspirado traqueal em um paciente com pneumonia associada à ventilação mecânica, entretanto a patogenicidade de tal bactéria não estava clara. Porém, já se sabia da formação do biofilme e da produção de uma protease importante na sua patogenicidade (51). Espécies de Chryseobacterium sp. são comumente encontrados em amostras humanas, porém sem importância clínica. Contudo há diversos relatos de casos em crianças e adultos com infecções associadas na corrente sanguínea, pneumonia, cateter e ferida operatória (52-57).
Após 1993, as infecções em humanos causadas por esta bactéria foram cada vez mais estudadas. Em 1996 foi publicado um estudo que encontrou a presença de
Chryseobacterium indologenes, na época ainda classificada como Favobacterium sp.,
em pacientes que utilizavam dispositivos de longa permanência no Hospital Nacional de Taiwan (58-60). No ano seguinte, foi publicada a implicação desta espécie em infecções hospitalares oportunistas por uma ceratite, e os relatos de infecção por este microrganismo se tornaram mais frequentes (61, 62).
A partir deste momento iniciaram os estudos para identificação e melhor caracterização da bactéria (63-65) e a partir de 1999 os artigos começam a trazer a nova nomenclatura de C. indologenes.
8 Devido ao maior conhecimento do C. indologenes, foram publicados trabalhos evidenciando infecções: urinária, em implantes cardiovasculares, em pacientes transplantados, infecções pulmonares, sepse, infecção de cateter venoso e infecções hospitalares (50, 52-54, 66-73). Em um dos artigos de infecção hospitalar, foi encontrada a causa da infecção na contaminação da água destilada de injeção. Desse modo, podemos visualizar de forma clara a importância clínica desta bactéria, principalmente no ambiente hospitalar.
Impulsionado por esta importância, este BGN-NF teve seu genoma sequenciado em 2011 (74) gerando maior conhecimento sobre seus genes, possibilitando novos estudos para diagnóstico e tratamento, ao tempo que permite estudos para resistência a antimicrobianos.
1.2.2. Elizabethkingia meningoseptica
E. meningoseptica foi anteriormente classificada como Flavobacterium meningosepticum do grupo IIa pelo CDC (Centers for Disease Control and Prevention) e
posteriormente renomeada de Chryseobacterium meningosepticum com base na análise fenotípica, até sua classificação atual por sequenciamento do 16S rRNA (75-78). Caracteriza-se por ser um bacilo gram-negativo, imóvel, não formador de esporo. As colônias são brancas amareladas, não pigmentadas, semi-translúcido, circular e brilhante. As provas bioquímicas catalase e oxidase são positivas e H2S negativo. É
amplamente distribuído na natureza, especialmente em solo e água. (75, 79).
Foi reconhecido como causador de meningite neonatal por Elizabeth King, em 1959. Posteriormente vários casos de infecção, especialmente de meningite, septicemia
9 e pneumonia foram relatados, tanto em neonatos como adultos, assim como em pacientes imunocomprometidos (78, 80-84).
A meningite causada por E. meningoseptica ocorre principalmente em crianças prematuras, nas duas primeiras semanas de vida, sendo fatal em mais da metade dos casos e as sequelas são comuns entre os sobreviventes. Embora a meningite causada por esta bactéria represente proporção pequena da meningite neonatal, o diagnóstico preciso é importante, pois o microrganismo é geralmente resistente a vários antibióticos, incluindo ampicilina, cefotaxima e gentamicina (81, 84).
Muitos casos de infecções por E. meningoseptica foram relatados como partes de surtos atribuídos a contaminação da água do hospital, chegando a contaminar soluções de antibióticos, salinas, drenos e equipamentos respiratórios (85, 86).
1.2.3. Ochrobactrum anthropi
O. anthropi faz parte da Familia Brucellaceae, antigamente designadas grupos
Vd-1 e Vd-2 dos CDC e Achromobacter dos grupos A, C e D de Holmes et al (77). O O.
anthropi apresenta características fenotípicas idênticas a Brucella. É oxidase positiva,
sacarolíticas e móveis através de flagelos peritríquios. Os testes chaves para diferenciação do O. anthropi incluem a capacidade de hidrolisar a ureia, incapacidade de hidrolisar a esculina e teste negativo para ONPG (1, 87, 88).
Mesmo não sendo muito conhecida entre os microbiologistas, O. anthropi tem uma literatura de mais de 40 artigos nos últimos 20 anos. Um dos primeiros relatos de caso desta bactéria foi descrito em paciente imunossuprimido após transplante (89). Outros diversos casos de septicemia, meningite, infecções intravenosas, de cateter
10 venoso central, infecções em pacientes HIV positivos, infecções do trato respiratório de pacientes com FC (90-103).
1.2.4. Ralstonia sp.
As espécies de Ralstonia sp. são bacilos gram-negativos não fermentadores, comumente encontrados em ambientes úmidos. Ralston et al foi o primeiro a descrever esta bactéria, em 1973, após visualizar bacilos de 0.5 a 3.0 µm, apresentando mobilidade por flagelo, colônias não pigmentadas, e descrevendo o comportamento diante de diversas provas bioquímicas (104). Posteriormente viera Riley e Garcia caracterizaram esta bactéria como Pseudomonas pickettii (105, 106).
Uma de suas características consiste na dificuldade de identificação, sendo confundida com P. fluorescens ou Complexo B. cepacia. Dentre as principais espécies relacionadas a infecções em pacientes com FC e Infecção hospitalar estão: R. pickettii,
R. mannitolilytica, R. insidiosa (107, 108).
A R. pickettii é um bacilo gram-negativo não fermentador e de virulência relativamente baixa. A maioria das infecções é vista no ambiente hospitalar, resultando de bacteremia e/ou septicemia e infecções respiratórias, como pacientes com FC (57, 109-120). Alguns casos relados na literatura (121-125) por IRAS são causados devido a soluções intravenosas contaminadas, água estéril e salina.
Devido sua baixa virulência, esta bactéria infecta pacientes, em sua maioria, imunossuprimidos (126, 127). Existem diversos exemplos na literatura de pacientes com câncer (128, 129), transplantados (130, 131), neonatos) com infecções graves por R.
11 A R. mannitolilytica é a denominação do microrganismo anteriormente classificado como R. pickettii biovariante 3/thomasii. Um dos primeiro relatos de infecção desta bactéria foi em 2001 com um caso de meningite (132). É encontrada, principalmente, isolada do escarro de pacientes com FC (116, 133), imunossuprimidos pós-transplante (134) ou com câncer (135), por contaminação de equipamentos cirúrgicos (136-138) e infecções hospitalares (139).
A espécie de R. insidiosa foi descrita, discriminando-a da R. pickettii em 2003 (140, 141). É raramente isolada em amostras clínicas, até pela dificuldade de identificação, mas é encontrada em secreções respiratórias, principalmente de pacientes com FC e imunocomprometidos (142, 143).
1.2.5. Cupriavidus pauculus
C. pauculus era antigamente chamado de Ralstonia paucula e grupo IV c-2
dos CDC (144). Em 2004 foi avaliada sua semelhança com o C. necator e descrito com sua atual nomenclatura (145). Trata-se de um bacilo gram-negativo, oxidase positiva, não sacarolítico, com motilidade por flagelos e urease fortemente positivo (1, 145).
A extensa maioria dos relatos deste microrganismo em infecção humana foram casos de bacteremia em pacientes imunocomprometidos, infecção através de equipamentos de uso prolongado e sepse (144, 146-151).
12
1.3. IDENTIFICAÇÃO BACTERIANA FENOTÍPICA AUTOMATIZADA-
VITEK®2 e PHOENIX™
A automação do diagnóstico, cada vez mais é requisitada pelos microbiologistas devido a enorme variedade de microrganismos nos dias de hoje e a baixa eficiência de identificação dos métodos manuais fenotípicos para identificação de todos. Recomenda-se que a precisão do sistema automatizado exceda 90% na sua habilidade em identificar micro-organismos do ambiente clínico e que este seja capaz de identificar organismos comumente isolados com no mínimo 95% de precisão comparada com as precisões de métodos convencionais (152).
O sistema Vitek®2 da BioMeriéux® é um dos equipamentos, junto com o
Phoenix™ da Beckton & Dickson, mais utilizados nos Laboratórios de Microbiologia Clínica para identificação de microrganismos como bactérias e alguns fungos (153-157). A primeira versão desse sistema de identificação bacteriana automatizado surgiu nos primórdios da corrida espacial quando a McDonnel Douglas Astronautics Co. Bioscience Laboratory introduziu o conceito de detecção, enumeração e identificação de microrganismos no ambiente de uma espaçonave. Empregava cartões plásticos contendo substratos liofilizados para a identificação microbiana e um sistema ótico, para a detecção microbiana, associado a um computador para controle e processamento. Surgiu então, em 1973, o Sistema AutoMicrobic (AMS) (MacDonnell Douglas Corp., St. Louis, Mo.). Pouco depois, o AMS foi reconfigurado para identificar Enterobacteriaceae de amostras clínicas, e mostrou uma precisão de 97,8% para 1.020 isolados comparados aos testes bioquímicos convencionais. O tempo necessário para a identificação bacteriana era cerca de oito horas. O AMS tornou-se comumente conhecido como Vitek. Em 1982, desenvolveu-se um novo cartão que permitiu identificar vários microrganismos
13 não entéricos e reduziu o tempo de processamento para quatro horas. Em 1988, o Sistema Vitek, Inc., foi comprado pela bioMérieux®, Inc. e novos melhoramentos foram
feitos aumentando o número de microrganismos reconhecidos no banco de dados, melhorando a precisão da identificação ao mesmo tempo, em que, diminuía o tempo de liberação dos resultados de 5.7 para 4.1 horas. Em 1997, a bioMérieux® introduziu a nova
geração do equipamento, o Vitek 2, e o cartão ID-GNB (158). Este sistema tem tecnologia baseada em fluorescência e é mais sensível na detecção de alterações metabólicas, fornecendo identificação de microrganismos em tempo aproximado de três horas (159). O ano de 2004 presenciou o advento do VITEK®2 Compact. Este sistema utiliza a
tecnologia “Advanced colorimetry”, conta com a adição de novos substratos em relação às versões anteriores e um banco de dados mais amplo (155, 158).
O Phoenix™ é um sistema automatizado, produzido pela Becton & Dickinson, capaz de promover a identificação e teste de sensibilidade de microrganismos clinicamente significantes. O mesmo é capaz de fornecer rapidamente o resultado sobre a maioria das bactérias aeróbica e anaeróbias facultativas, Gram positivas e Gram negativas, além de alguns fungos que causam agravos nos seres humanos.
Os painéis de identificação bacteriana desse equipamento possuem ao todo 51 cavidades, sendo que 45 contêm substratos bioquímicos desidratados e duas outras cavidades servem como controle para avaliar a capacidade de emissão da fluorescência. Através dos substratos liofilizados, presentes no interior do painel de ID (identificação), são possíveis as análises da capacidade de fermentação, oxidação, degradação e hidrólise do microrganismo pesquisado. Esses testes efetuados são semelhantes aos métodos fenotípicos convencionais, porém são modificados, já que são utilizados
14 substratos cromogênicos e fluorogênicos. A detecção dos substratos cromogênicos a base de P-nitrofenil ou P-nitroanilida são apontadas pela formação da cor amarela, evidenciando a utilização do mesmo a partir de uma hidrólise enzimática. Já os substratos fluorogênicos, evidenciam a hidrólise a partir da liberação de um derivado fluorescente de cumarina.
Além destes, existem outras formas para que o equipamento consiga avaliar e detectar o metabolismo do microrganismo estudado, como por exemplo, utilizar somente um determinado componente como única fonte de carbono, através da redução do indicador a base de resazurina. E a partir dos resultados obtidos do metabolismo é efetuado o confronto com o banco de dados presente no equipamento, levando a identificação e liberando, em porcentagem, a probabilidade de realmente ser o microrganismo apontado (160-162).
1.4. PCR COMO RECURSO LABORATORIAL PARA IDENTIFICAÇÃO
BACTERIANA
Na busca de ferramentas para caracterização ao nível de gênero e espécie bactériana não fermentadoras, a Biologia Molecular a cada dia é mais utilizada. Entre estas destaca-se a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), que possibilita a amplificação específica de uma região do DNA delimitada por duas sequências iniciadoras – oligonicleotídeo, que possibilitam a identificação da bactéria ao nível de gênero, e em muitos casos de espécie. Isso ocorre porque o amplicon é específico para
15 cada microrganismo a ser analisado, utilizando regiões gênicas com variantes que possibilitam a identificação pela presença de amplificação direta do DNA extraído.
Existe para algumas bactérias oligonucleotídeos específicos, como por exemplo: R. pickettii, R. mannitolilytica e O. anthropi (116, 163, 164), que são usados para a identificação bacteriana e descritos na literatura científica. Porém, este método ainda não satisfaz, por completo, as necessidades de identificação de todas as bactérias não fermentadoras, sendo em alguns casos difícil de encontrar um primer espécie-específica, bem como ter total certeza do resultado obtido pela amplificação de um fragmento simples do DNA. Assim, em busca de um método mais específico e sensível, o sequenciamento genético vem sendo mais utilizado (165).
1.5. ESPECTROMETRIA DE MASSAS - MALDI-TOF
A espectrometria de massa é uma técnica micro analítica utilizada para obter informação do peso molecular e de características estruturais da amostra. A espectrometria de massa é uma das mais importantes ferramentas analíticas capazes de fornecer informação sobre: a composição elementar de amostras; a estrutura molecular; a composição qualitativa e quantitativa de misturas complexas; a estrutura e a composição de superfícies sólidas e as proporções isotópicas de átomos em amostras.
Na espectrometria de massa, a energia, fornecida pelo laser, é transferida à amostra para causar a sua ionização. O requisito básico para uma análise por espectrometria de massa é a formação de íons livres em fase gasosa. O alcance e a utilidade do método são ditados pelo processo de ionização. A aparência do espectro de
16 massa de uma espécie molecular é altamente dependente do método de ionização usado (166, 167).
Os agentes ionizantes empregados em espectrometria de massa são distribuídos em duas categorias: as que requerem a amostra em fase gasosa e os agentes que provocam dessorção em amostras sólidas ou liquidas. A vantagem dos últimos é que são aplicáveis a amostras não voláteis e termicamente instáveis. Este é o caso da técnica de espectrometria de massa utilizado para identificação de bactérias (168, 169).
O MALDI-TOF é composto por 4 componentes principais: a ionização das moléculas, a dessorção, o laser, e a matriz. A matriz consiste em uma molécula orgânica que irá contribuir para a oferta de carga elétrica às moléculas da bactéria. O laser será responsável em gerar esta energia para que ocorra a ionização e em seguida a dessorção, ou seja, separação, destas moléculas. Após a ionização, as moléculas ficam presas a um campo elétrico, evitando que as mesmas se percam no espaço. Logo após o campo elétrico, existe o tubo a vácuo, por onde as moléculas irão se deslocar devido a pressão negativa que irá sugá-las. Este deslocamento, juntamente com a carga elétrica e massa da molécula, serão componentes fundamentais para a elaboração do espectro de massas, que será formado através de um receptor localizado ao fim do tudo de vácuo, conectado à um transdutor de sinal ligado a um computador. Este espectro de massa irá compor a identidade de cada bactéria, pois cada microrganismo possui um conjunto de proteínas específicas de cada espécie. As moléculas interpretadas pelo aparelho são as proteínas ribossomais, devido a grande quantidade disponível nas bactérias e conservação dentro da mesma espécie (169-171).
17 Desse modo, o MALDI-TOF foi adaptado com sucesso para a identificação de microrganismos rotina em laboratórios de microbiologia clínica nos últimos 10 anos. Esta técnica revolucionária permite o diagnóstico mais fácil e mais rápido dos patógenos humanos do que os métodos fenotípicos convencionais e métodos de identificação molecular, com uma confiabilidade, rapidez e custo-efetividade elevados (169-171).
A relevância deste trabalho está em analisar os diferentes métodos de identificação de BGN-NFs raros de importância clínica, principalmente em pacientes com Fibrose Cística e em pacientes internados, pois estes são susceptíveis às infecções oportunistas destas bactérias. Como estes microrganismos são de rara frequência, muitos não são identificados corretamente por ausência de metodologias confiáveis na identificação ou por desconhecimento dos microbiologistas. Esta análise se justifica para melhor conhecimento das vantagens e limitações destes métodos, pelas repercussões clínicas e epidemiológicas e para considerações sobre a necessidade de métodos alternativos mais eficientes.
19
2. OBJETIVOS Geral:
Identificar microrganismos não fermentadores pouco frequentes, isolados em amostras clínicas de pacientes com FC e pacientes internados no HC-Unicamp, por técnicas fenotípicas, de espectrometria de massas e biologia molecular.
Específicos:
Testar a técnica de PCR para identificação de Ochrobactrum anthropi,
Ralstonia pickettii, Ralstonia mannitolilytica, Ralstonia insidiosa e comparar
com a identificação por provas bioquímicas manuais, automatizada pelo Vitek®2, Phoenix™ e por dois equipamentos de MALDI-TOF: VITEK MS da
BioMérieux® (MALDI MS) e MALDI-TOF BioTyper™ da Becton & Dickson.
Testar e comparar a identificação de Chryseobacterium indologenes,
Elizabethkingia meningoseptica, e Cupriavidus pauculus, Ochrobactrum anthropi, Ralstonia pickettii, Ralstonia mannitolilytica, Ralstonia insidiosa
por provas bioquímicas manuais, por automação Vitek®2 e Phoenix™, por
espectrometria de massas: VITEK MS da BioMérieux® (MALDI MS) e
21
3. MÉTODO
3.1. ASPECTOS ÉTICOS DA PESQUISA
Este trabalho foi submetido à Comissão de Ética em Pesquisa da Faculdade de Ciências Médicas da Unicamp e aprovado CAAE/Plataforma Brasil 30814914.3.0000.5404. Foram respeitadas as condições éticas pertinentes ao protocolo e seguidos rigorosamente os princípios enunciados na Declaração de Helsink II de 20/08/1947 e da Resolução 196/96 da CONEP.
Este projeto é de natureza laboratorial e foi realizado com material clínico encaminhado pelos médicos dos ambulatórios, enfermarias e UTIs do HC da UNICAMP ao Laboratório de Microbiologia do HC UNICAMP para rotina diagnóstica. Não houve participação de grupos vulneráveis ou voluntários.
Como neste trabalho não existe contato direto com os pacientes, ou grupos vulneráveis e os exames laboratoriais serão solicitados por iniciativa do médico que os atende, solicitamos dispensa do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE), por ele não ser aplicável a este tipo de estudo. Foram processadas apenas amostras isoladas de material clínico dos pacientes e a identificação do material no banco de dados foram apenas pelas iniciais e pelo número do registro no Hospital de Clínicas da Unicamp (HC). No processamento dos dados e futura publicação o paciente deverá ser identificado apenas como um número interno do trabalho, garantindo a preservação de sua identidade. Além disso, o pesquisador garante que apenas ele e o orientador do trabalho
22 terão conhecimento da identidade dos pacientes, e que de forma alguma o paciente poderá ser identificado em material a ser publicado.
3.2. DESENHO DO ESTUDO
O desenho deste estudo se classifica como retrospectivo, transversal, comparativo, qualitativo e quantitativo.
3.3. CRITÉRIOS PARA SELEÇÃO DOS GENEROS ESTUDADOS
O propósito foi analisar bactérias não fermentadoras pouco frequentes, isoladas em infecções oportunistas, cuja identificação apresenta dificuldades técnicas na rotina laboratorial. Para conhecermos a incidência de bactérias não fermentadoras no Laboratório de Microbiologia do HC da Unicamp (LM), foi realizado um levantamento nos bancos de dados de hemoculturas entre 2007 e 2012. As bactérias mais comumente isoladas foram Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Stenotrophomonas
maltophilia, complexo B. cepacia, Achromobacter sp.. Pseudomonas sp..(20). Foram
escolhidos 5 gêneros cujo isolamento foi igual ou inferior a 0,5%: Chryseobacterium sp.,
Elizabethkingia sp., Ochrobactrum sp., Ralstonia sp. e Cupriavidus sp. Com base na
identificação de rotina do LM estas bactérias foram classificadas em 7 diferentes espécies: Chryseobacterium indologenes, Elizabethkingia meningoseptica, Ochrobactrum anthropi, Ralstonia pickettii, Ralstonia mannitolilytica, Ralstonia insidiosa, Cupriavidus pauculus.
23
3.4. ISOLADOS ESTUDADOS
As bactérias em estudo foram obtidas do banco de Bactérias do Laboratório de Microbiologia do Hospital de Clínicas da UNICAMP, provenientes de hemoculturas de pacientes internados, de amostras respiratórias de portadores de fibrose cística e amostras denominadas de “pesquisa” provenientes do ambiente, no período de Janeiro de 2008 a junho de 2013.
Foram detectados 80 isolados, previamente identificados por métodos fenotípicos (provas bioquímicas manuais e/ou automação pelo VITEK II) como
Chryseobacterium indologenes, Elizabethkingia meningoseptica, Ochrobactrum anthropi, Ralstonia pickettii, Ralstonia mannitolilytica, Ralstonia insidiosa, Cupriavidus pauculus
que foram semeados em Agar Sangue (AS) para verificar viabilidade da amostra. Nesta etapa, quatro isolados foram descartados por falta de crescimento.
Após verificar crescimento, foi realizado isolamento e cinco amostras que apresentavam contaminação, foram excluídas, resultando em 71 isolados que foram armazenadas em 3 cópias para garantir a sequência do estudo.
3.5. ARMAZENAMENTO DOS ISOLADOS
Os isolados foram armazenados em meio BHI-glicerol 15% e estocados no freezer a -80ºC. A identificação foi realizada com um número interno da pesquisa (1 a 71), origem do material (hemocultura ou oriunda de trato respiratório de pacientes com FC), número de registro no HC e data do isolamento microbiológico no material clinico.
24
3.6. IDENTIFICAÇÃO BACTERIANA
Os isolados guardados no freezer -80ºC, foram descongelados e semeados com uma alça calibrada descartável e estéril de 10µL em caldo BHI e incubados por um período de 24 horas em estufa bacteriológica à temperatura de 35ºC ±1ºC.
A seguir, os isolados foram semeados por método de esgotamento em AS no interior de uma capela de fluxo laminar com auxílio de alça calibrada descartável e estéril de 10µL e incubados em estufa bacteriológica à temperatura de 35ºC ±1ºC por período de 24-48 horas.
As bactérias Chryseobacterium indologenes, Elizabethkingia meningoseptica,
Ochrobactrum anthropi, Ralstonia pickettii, Ralstonia mannitolilytica, Ralstonia insidiosa, Cupriavidus pauculus foram submetidas aos métodos de identificação:
1. Fenotípicos:
1.1. por provas bioquímicas manuais padronizadas pelo Laboratório de Microbiologia do HC Unicamp.
1.2. pelo sistema automatizado, Vitek®2 Compact (bioMeriéux® Vitek Inc.,
St. Louis, MO), para bactérias não fermentadoras.
1.3. Sistema automatizado Phoenix™ BD. 2. Por espectrometria de massas:
2.1. Identificação por MALDI TOF: VITEK MS da BioMérieux® (MALDI
MS) que utiliza um equipamento SHIMADZU e
2.2. MALDI-TOF BioTyper™ (Bruker Daltonics) da BD®[Becton,
Dickinson and Company] (MALDI BD). 3. Biologia Molecular
25 3.1. PCR.
IDENTIFICAÇÃO MANUAL FENOTÍPICA
1. Caracterização morfológica macroscópica da colônia na placa de ágar sangue (AS) após seu crescimento de 24-48hs.
2. Esfregaço para Coloração de Gram, no qual foram visualizadas e discriminadas características morfológicas e tintoriais.
3. Realização das provas bioquímicas (Quadro 1) para todas as amostras identificadas como Bacilos gram-negativos não fermentadores (BGN-NF).
O primeiro conjunto de provas foi: OF Glicose, Oxidase e Motilidade. A maioria das bactérias estudadas são produtoras de citocromo-oxidase, logo o teste resulta, em sua grande maioria, em oxidase positivo, sendo uma excelente prova de triagem. (Figura 1).
Figura 1: Prova da oxidase utilizando-se a solução
N-N-N-Tetrametylparaphenilenediamine dihydrochloride em papel de filtro. (A) Prova positiva, (B) Prova negativa.
A prova da OF Glicose tem o intuito de selecionar microrganismos que não fermentam glicose, e sim a oxidam. Dessa maneira, a bactéria produz substâncias que
26 deixam o meio mais ácido, que tornam a superfície do meio amarelada. Algumas amostras são inertes (meio permanece com a cor original verde) e outras utilizam outros substratos que a glicose e tornam o meio alcalino (azulado) (Figura 2).
Figura 2: Interpretação da prova de oxidação-fermentação de Hugh e Leifson. (A) Fermentador, (B) Não
fermentador oxidativo, (C) Não fermentador alcalino, (D) Não fermentador inerte.
Realizou-se a avaliação da motilidade por teste direto, com uma gota de salina e sobre a mesma dissolvida uma colônia da bactéria em estudo, coberta com uma lamínula e levou-se ao microscópio. Quando esta prova foi negativa, utilizou-se caldo BHI para cultura por 30 minutos, com a finalidade de garantir bactérias viáveis e recentes para o teste. Foram consideradas amostras positivas a presença de bactérias cruzando o campo em diferentes posições ou girando em torno de si. Considerou-se com motilidade negativa, quando houve a presença de movimentos vibratórios fracos, ou movimento browniano (movimento em uma única direção, devido ao movimento do líquido entre a lâmina e lamínula).
Em seguida, realizou-se as demais provas de acordo com as provas recomendadas no Manual da ANVISA(9), como descrito no Quadro 1, complementado
27 com interpretação das provas baseado no Quadro 2, visto que grande parte destas bactérias analisadas não possui um fluxograma consenso para identificação.
Quadro 1. Provas bioquímicas realizadas utilizadas na identificação fenotípica de bacilos gram negativos não-fermentadores de glicose (88). Testes Bioquímicos I. Metabolismo dos Carboidratos: OF Glicose, OF Maltose, OF Sacarose, OF Lactose, OF Xilose.
Os procedimentos de leitura, incubação e leitura de todos os carboidratos foram semelhantes ao descrito na OF Glicose. Controle Positivo: OF Maltose (ATCC 13883 Klebsiella
pneumoniae), OF Sacarose (ATCC 13048 Enterobacter aerogenes), OF Lactose (ATCC 13047 Enterobacter cloacae), OF Xilose (ATCC 13048 Enterobacter aerogenes)
II. Metabolismo dos
aminoácidos (Meio Moeller para descarboxilação de: Lisina, Ornitina, Arginina, Controle Base Moeller
Com o auxílio de uma alça bacteriológica, foram semeadas nos meios cerca de 8 – 10 colônias de bactérias, com a finalidade de se obter um inoculo denso.
As culturas foram incubadas em estufa bacteriológica, à temperatura de 36 ± 1ºC, por até 7 dias, com avaliação de crescimento a cada 24 horas.
Os tubos de aminoácidos foram comparados com o tubo de controle (Base de Möeller). As provas foram consideradas positivas quando os meios se apresentaram com coloração púrpura.
Controles positivos: Lisina (LMG 958 Stenotrophomonas
maltophilia), Arginina (ATCC 27853 Pseudomonas aeruginosa),
Ornitina (ATCC 13047 Enterobacter cloacae) III. Ágar Citrato Simmons
Com o auxílio de uma alça bacteriológica, foram semeadas na superfície do meio de 2 – 3 colônias de bactérias.
As culturas foram incubadas em estufa bacteriológica, à temperatura de 36 ± 1ºC, em atmosfera de CO2, por até 7 dias, com avaliação de crescimento a cada 24 horas.
As provas foram consideradas positivas quando a coloração do meio foi modificada para azul no pico, se estendendo para todo o meio.
Controle positivo: (ATCC 13048 Enterobacter aerogenes). Controle negativo (ATCC 25922 Escherichia coli)
28 IV. Hidrólise da Esculina Com o auxílio de uma alça bacteriológica, foram semeadas na
superfície do meio de 2 – 3 colônias de bactérias.
As culturas foram incubadas em estufa bacteriológica, à temperatura de 36 ± 1ºC, em atmosfera de CO2, por até 7 dias, com avaliação de crescimento a cada 24 horas.
As provas foram consideradas positivas quando ocorreu a formação de um precipitado negro no tubo, a partir de 6 horas de incubação. A prova negativa foi evidenciada pela coloração castanho escuro do meio.
Controle positivo: (ATCC 7965 Aeromonas hydrophila). Controle negativo: ATCC 27853 Pseudomonas aeruginosa)
V. Teste do Indol Com o auxílio de uma alça bacteriológica, foram semeadas cerca de 2 – 3 colônias de bactérias em caldo TSB ou BHI. E acrescidos de 5 gotas de xilol. O tubo foi agitado em vórtex e, em seguida, foram adicionadas 5 gotas de reativo de Erlich.
As provas foram consideradas positivas quando houve a fomação de um anel violeta na superfície do tubo.
Controle positivo: LMG 8337 C. indologenes. VI. Tubo com caldo NaCl
6,5%
Com o auxílio de uma alça bacteriológica, foram cerca de 2 – 3 colônias de bactérias no caldo de NaCl 6,5%.
As culturas foram incubadas em estufa bacteriológica, à temperatura de 36 ± 1ºC por até 7 dias, com avaliação de crescimento a cada 24 horas.
As provas foram consideradas positivas quando foi observada a turbidez ou mudança de coloração do meio para violeta.
Controle positivo: (ATCC 29200 Enterococcus faecalis)
VII. Meio de Manitol Com auxílio de uma alça bacteriológica, foram semeados cerca de 2-3 colônias de bactérias no meio Manitol.
As culturas foram incubadas em estufa bacteriológica, à temperatura de 36 ± 1ºC por até 7 dias, com avaliação de crescimento a cada 24 horas.
As provas foram consideradas positivas quando apresentavam crescimento com pigmentação amarela.
Controle positivo: Burkolderia cepacia
VIII. Tubo com gelatina Com o auxílio de uma alça bacteriológica, foram semeadas cerca de 2 – 3 colônias de bactérias na solução salina 0,85% e foi adicionado um pedaço de filme de gelatina.
As culturas foram incubadas em estufa bacteriológica, à temperatura de 36 ± 1ºC, por até 7 dias, com avaliação de crescimento a cada 24 horas.
As provas foram consideradas positivas pela formação de um precipitado cinza no fundo do tubo.
