Quanto a pesquisa de genes codificadores de ESBL, verificou-se que 28 isolados de EPEC (23,9%) apresentaram o gene blaTEM, enquando que 89 (76,1%) não apresentaram este gene. Para o gene blaCTX-M, 23 amostras (19,7%) foram positivas e 94 (80,3%) negativas, para blaSHV 9 (7,7%) foram positivas e 108 (92,3%) negativas (Tabela 9). Na figura 19, é apresentado a foto de um gel de agarose 1% com o produto de PCR amplificando para o gene
blaTEM, na figura 20 para o gene blaSHV (gel de agarose 1%) e na figura 21 para blaCTX-M (gel de agarose 1%).
Tabela 9 – Frequência de genes codificadores de ESBL do tipo blaTEM e blaSHV nos isolados de EPEC oriundos de crianças com gastroenterite em Porto Velho/RO.
EPEC
blaTEM blaCTX-M blaSHV
Positivo Negativo Positivo Negativo Positivo Negativo Típica (n=15) 4 (26,7%) 11 (73,3%) 5 (33,3%) 10 (66,7%) 2 (13,3%) 13 (86,7%) Atípica (n=102) 24 (23,5%) 78 (76,5%) 18 (17,6%) 84 (82,4%) 7 (6,9%) 95 (93,1%) Total (n=117) 28 (23,9%) 89 (76,1%) 23 (19,7%) 94 (80,3%) 9 (7,7%) 108 (92,3%)
Nas cepas de tEPEC, a frequência do gene blaTEM foi de 26,7% (4/15) e 73,3% (11/15) não apresentaram este gene. Para blaCTX-M a prevalência de amostras positivas foi de 33,3% (5/15) e 66,7% (10/15) foram negativas, enquanto que para blaSHV 13,3% (2/15) foram positivas e 86,7% (13/15) negativas. Nos isolados de aEPEC, para o gene blaTEM a frequência
1080pb de positividade foi de 23,5% (24/102) e 76,5% (78/102) apresentaram resultado negativo.
Para blaCTX-M, 17,6% (18/102) foram positivas e 82,4% (84/102) foram negativas, já para blaSHV, 7 isolados (6,9%) apresentaram este gene e 95 (93,1%) não amplificaram. Não houve diferença estatisticamente significante quanto a frequência dos genes codificadores de ESBL (blaTEM, blaCTX-M e blaSHV) entre as categorias de EPEC (típica e atípica), sendo que os valores de p foram: blaTEM ( p= 0,7537), blaCTX-M (p= 0,1703) e blaSHV (p= 0,3244).
Neste estudo foi detectado a presença de genes codificadores de ESBL do tipo blaTEM, blaCTX-M e blaSHV nos isolados de tEPEC e aEPEC, sendo que os genes blaTEM e blaCTX-M foram os que apresentaram maior frequência, respectivamente. A detecção destes genes demonstrada por este estudo é de extrema importância pois nos últimos anos houve um aumento no aparecimento de resistência aos antibióticos betalactâmicos devido a presença destes genes, principalmente em cepas de Escherichia coli e Klebsiella pneumoniae. No estudo realizado por MNIF et al., (2013) a presença destes três genes foi verificada entre os isolados de Escherichia coli produtores de ESBL em dois hospitais na Tunisia, sendo que dos 163 isolados produtores de ESBL, 118 apresentaram o gene blaCTX-M, 49 blaSHV e apenas 3 blaTEM, sendo o gene blaCTX-M o de maior frequência.
Figura 19 - Presença de genes codificadores de ESBL do tipo blaTEM em isolados de EPEC oriundos de crianças com gastroenterite em Porto Velho/RO.
Eletroforese em gel de agarose 1% dos produtos de PCR amplificados para detecção do gene blaTEM
(fragmento de 1080pb). O gel foi corado com GelRed 10.000x (diluição de 1:500), visualizado e fotodocumentado em transiluminador de luz ultravioleta. Linha 1- Peso molecular (PM) de 100bp DNA Ladder (Invitrogen); Linha 2 a 13 - amostras de EPEC, sendo apresentado duas amostras positivas (11 e 121); Linha 14 e 15- Controle positivo de Klebsiella pneumoniae CCBH 4955; Linha 16- Controle positivo diluído (1:100); Linha 17- Controle negativo bactéria DB11 (Serratia
231pb
544pb Figura 20 - Presença de genes codificadores de ESBL do tipo blaSHV em isolados de EPEC
oriundos de crianças com gastroenterite em Porto Velho/RO.
Eletroforese em gel de agarose 1% dos produtos de PCR amplificados para detecção do gene blaSHV
(fragmento de 231pb). O gel foi corado com GelRed 10.000x (diluição de 1:500), visualizado e fotodocumentado em transiluminador. Linha 1- Peso molecular (PM) de 100bp DNA Ladder (Invitrogen); Linha 2 a 13 - amostras de EPEC, sendo apresentado três amostras positivas (340, 367 e 400); Linha 14- Controle positivo de Klebsiella pneumoniae ATCC 700603; Linha 15- Controle positivo diluído (1:100); Linha 16- Controle negativo bactéria DB11 (Serratia marcescens).
Figura 21 - Presença de genes codificadores de ESBL do tipo blaCTX-M em isolados de EPEC oriundos de crianças com gastroenterite em Porto Velho/RO.
Eletroforese em gel de agarose 1% dos produtos de PCR amplificados para detecção do gene blaCTX-M
(fragmento de 544pb). O gel foi corado com GelRed 10.000x (diluição de 1:500), visualizado e fotodocumentado em transiluminador. Linha 1- Peso molecular (PM) de 1kb DNA Ladder (Biolabs); Linha 2 a 15 - amostras de EPEC, sendo apresentado nove amostras positivas (120,136, 145, 213, 253, 255, 256, 501 e 508); Linha 16- Controle positivo de Klebsiella pneumoniae CCBH 4955; Linha 17- Controle negativo bactéria DB11 (Serratia marcescens).
No trabalho realizado por MAINA et al., (2012) com 52 isolados de E. coli e
Klebsiella pnemoniae o gene blaCTX-M foi detectado em 88,5% (46) dos isolados, seguido de 34,6% (18) para blaTEM e 25% (13) para blaSHV. Em outro estudo realizado por LIM et al.,
(2009) com 47 isolados de E. coli oriundos de hospitais públicos da Malásia demonstraram que 35 isolados apresentaram o gene blaTEM, 3 blaSHV e 8blaCTX-M.
Análises estatísticas foram realizadas a fim de se relacionar a presença dos genes
blaTEM, blaCTX-M e blaSHV com a produção de ESBL nos isolados de EPEC. Os resultados demonstraram que a presença destes genes não está relacionada com a produção de ESBL nas amostras estudadas, com valores de p não estatisticamente significativos (p= 0,2345 para o gene blaTEM, p= 0,3534 para blaSHV ep=0.3223 para blaCTX-M). Este resultado pode ser devido a existência de outros genes de resistência codificadores de ESBL, devendo ser investigado a presença de outros genes codificadores de ESBL. Além disso, deve-se considerar que a presença de genes de resistência a antibióticos betalactâmicos não indica a produção fenotípica da enzima betalactamase, visto que o micro-organismo pode apresentar o gene e não expressar a enzima através da produção da mesma (JÚNIOR et al., 2004;DALMARCO et al., 2006; RIVA et al., 2008).
A presença dos três genes codificadores de ESBL também foram analisados quanto aos antibióticos que apresentaram maior frequência de resistência (AMP, SUT e TET) a fim de se verificar se havia alguma relação. Para o gene blaTEM e o antibiótico ampicilina o valor de p foi considerado estatisticamente significante (p=0,0003), sendo reforçado pelo valor do Odds-Ratio (OR= 8,148; IC 95%= 2,293 a 28,95), que indica que quem tem a presença deste gene de resistência, tem aproximadamente 8 vezes a chance de ser resistente a ampicilina. A associação estatística encontrada entre a presença de resistência a ampicilina e o gene blaTEM é esperada visto que a ampicilina é um antibiótico betalactâmico e a presença deste gene codifica para resistência a antibióticos betactâmicos tais como penicilinas, cefalosporinas e monobactâmicos (JÚNIOR et al., 2004).
A positividade para blaTEM também foi relacionada com a resistência a trimetoprim- sulfametoxazol, e o valor de p foi considerado estatisticamente significativo (p=0,0044; OR= 4,103 e o IC95%= 1,518 a 11,09), sugerindo que a presença deste gene esteja influenciando na resistência a este antibiótico. Para este mesmo gene e o antibiótico tetraciclina o valor de p foi considerado não significativo (p= 0,1926), indicando que não há relação entre este gene e a resistência ao antibiótico tetraciclina.
Para o gene blaSHV e o antibiótico ampicilina o valor de p foi considerado não significativo (p= 0,3109), o mesmo ocorreu com a tetraciclina em que o valor de p foi igual a 0,7368, indicando que este gene não está associado com o perfil de resistência a esses dois antibióticos. A presença do gene blaSHV foi considerado estatisticamente significante para trimetoprim-sulfametoxazol, cujo valor de p foi igual a 0,0391(OR=7,429; IC95%= 0,8976 a
61,48). Não houve relação estatística entre a presença do gene do tipo blaCTX-M e os antibióticos ampicilina (p=0,4789), trimetoprim+sulfametoxazol (p=0,2506) e tetraciclina (p=1).
Neste estudo verificou-se uma associação entre a presença de genes codificadores de ESBL (blaTEM e blaSHV) e a resistência a outros antibióticos não betalactâmicos (como é o caso do trimetoprim-sulfametoxazol). Essa associação pode ocorrer devido a presença de genes de resistência a antibióticos não betalactâmicos em plasmídeos que codificam para resistência a ESBL, visto que estes plasmídeos geralmente estão associados com a resistência a diversas classes de antibióticos não-betalactâmicos, incluindo resistência a aminoglicosídeos, trimetoprim, sulfonamidas, tetraciclinas e cloranfenicol (JÚNIOR et al., 2004; DALMARCO et al., 2006).
Quando considerada a resistência a pelo menos 1 dos 12 antibióticos testados no teste de sensibilidade aos antimicrobianos (TSA) e a presença dos genes codificadores de ESBL, o valor de p foi considerado extremamente significante para blaTEM (p= 0,0001; OD= 20,12; IC= 2,615 a 154,7) e blaSHV (p= 0,0001; OR= 4123; IC95%= 77,30 a 219904). Para o gene blaCTX-M não houve associação estatística entre o gene e a resistência a um dos 12 antibióticos (p= 0,3239). A associação estatística entre a presença de genes codificadores de ESBL (blaTEM e blaSHV) e a resistência a pelo menos 1 antibiótico também pode ser explicada devido a presença de genes que conferem resitência a antibióticos estarem localizados no mesmo plasmídeo de resistência a ESBL (JÚNIOR et al., 2004).