FUNDAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DE RONDÔNIA – UNIR PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA EXPERIMENTAL
RENATA SANTOS RODRIGUES
“CARACTERIZAÇÃO DAS CEPAS DE Escherichia coli ENTEROPATOGÊNICA (EPEC) TÍPICA E ATÍPICA ISOLADAS DE CRIANÇAS COM GASTROENTERITE AGUDA NA REGIÃO DE PORTO VELHO-RO”
PORTO VELHO-RO. 2013
RENATA SANTOS RODRIGUES
“CARACTERIZAÇÃO DAS CEPAS DE Escherichia coli ENTEROPATOGÊNICA (EPEC) TÍPICA E ATÍPICA ISOLADAS DE CRIANÇAS COM GASTROENTERITE AGUDA NA REGIÃO DE PORTO VELHO-RO”
Área de concentração: Microbiologia
Orientadora: Dra. Najla Benevides Matos
Coorientadora: Dra. Tânia Aparecida Tardelli Gomes do Amaral
Porto Velho – RO. 2013.
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Experimental (PGBIOEXP) da Universidade Federal de Rondônia – UNIR para defesa, a fim de obter o título de Mestre em Biologia Experimental.
FUNDAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DE RONDÔNIA - UNIR
PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA EXPERIMENTAL – PGBIOEXP
Candidata: Renata Santos Rodrigues
Título da Dissertação: “Caracterização das cepas de Escherichia coli enteropatogênica (EPEC) típica e atípica isoladas de crianças com gastroenterite aguda na região de Porto Velho-RO”
Orientadora: Dra. Najla Benevides Matos
Coorientadora: Dra. Tânia Aparecida Tardelli Gomes do Amaral
A comissão julgadora dos trabalhos de defesa da Dissertação de Mestrado, em sessão pública realizada em 30 de agosto de 2013, considera:
(X) Aprovado (a) ( ) Reprovado (a)
Examinador (a): Assinatura: _____________________________________ Nome: Dra. Viviane Krominski Graça de Souza
Instituição: Faculdade São Lucas - FSL
Examinador (a): Assinatura: _____________________________________ Nome: Dr. Roberto Nicolete
Instituição: Fundação Oswaldo Cruz Rondônia – FIOCRUZ/RO
Presidente e Orientador(a): Assinatura: _____________________________________ Nome: Dra. Najla Benevides Matos
DEDICATÓRIA:
Aos meus pais e familiares pelo apoio e incentivo prestado, a minha orientadora Dra. Najla Benevides Matos pela oportunidade concedida e pela ajuda prestada, ao Dr. Mauro Shugiro Tada pela autorização de realização de mais uma etapa em minha vida, e a Ângela Martins e Marlene Albuquerque pelo incentivo, dedico-lhes essa conquista com gratidão.
AGRADECIMENTOS
Gostaria de agradecer primeiramente a DEUS, que está sempre comigo me auxiliando nos momentos mais difíceis, nos momentos em que pensei em desistir, foi ele quem me deu força para continuar nesta caminhada! Aos meus pais (Renato e Isaura) pela compreesão, apoio e incentivo prestado! A minha prima Stephany Feitosa e ao meu irmão Dérique pela ajuda!
Um agradecimento especial para Marlene Albuquerque e Ângela Martins, que me incentivaram a fazer o mestrado, e me deram todo o apoio que eu precisei para concluir mais essa etapa em minha vida (muito obrigada!!). Ao Ronelson, pelo apoio, ajuda e compreensão. Ao Dr. Mauro Tada (Diretor Geral do CEPEM) que autorizou que eu fizesse o mestrado.
A minha orientadora Najla Benevides Matos, agradeço pela oportunidade e confiança a mim concedida, pela ajuda prestada na realização da PCR, pela compreensão que sempre teve comigo, quando pensei em desistir e/ou trancar o mestrado e quando tudo o que eu estava fazendo estava dando errado! Najla, te agradeço por tudo!! A Rosimeire Dalla, pelo apoio e incentivo e por ter conseguido alguns dos artigos. Ao Elton Bill pelas fotos das células!!
A Dra. Tânia Aparecida Tardelli Gomes do Amaral, pela colaboração prestada e pela coorientação. As meninas do Laboratório de Microbiologia (Érica, Grecy,Taíse, Sandra, Jaqueline, Alessandra, Fátima, Íris e Karina) quero agradecê-las pelo auxílio. Quero agradecer imensamente a Núcia Cristiane, por todas as vezes que me auxiliou nos experimentos, mesmo estando ocupada!! A Aldilene que me ajudou a realizar os testes de detecção de Betalactamases. Ao Altemárcio que ajudou nas extrações e nos Antibiogramas. Ao Esquerdo pela imensa ajuda no cultivo de células, nos testes de citoaderência e na leitura das lâminas.
Ao pessoal da sala de lavagem (Dona Nair, Marilúcia e Odair) agradeço pela paciência, pelo preparo dos meios de cultura e dos materiais (Muito obrigado! Sem a ajuda de vocês esse trabalho não seria possível!).
Ao Roger Lafontaine Mesquita Taborda, pelo auxílio nas análises estatísticas (muitíssimo obrigada Roger!!). Ao Luan Felipo Botelho Souza, pela ajuda nas PCRs e pelas sugestões em relação a dissertação! Ao Allison Carlos Assunção Silva, pela ajuda prestada e pelas sugestões na dissertação (Obrigada Allison mais uma vez! Você sempre me salvando nas horas que mais preciso!!).
E... a todos do CEPEM que me sempre me ajudaram e que continuam me apoiando desde que comecei a trabalhar nessa instituição!
“Amo ao SENHOR, porque ele ouviu a minha voz e a minha súplica. Porque inclinou a mim os seus ouvidos, o invocarei enquanto viver...”
RESUMO
Escherichia coli enteropatogênica (EPEC) é considerada um importante agente causador de
diarreia, principalmente nos países em desenvolvimento. Este patótipo de E. coli diarreiogênica é dividido em duas categorias tomando-se como base a presença de uma ilha de patogenicidade denominada Locus of Enterocyte Effacement (LEE) e do EPEC Adherence
Factor (plasmídeo EAF) nas cepas de EPEC típica e ausência deste plasmídeo nas cepas de
EPEC atípica. O objetivo deste estudo foi realizar a caracterização fenotípica e molecular das amostras de E. coli enteropatogênicas típicas e atípicas isoladas de crianças com gastroenterite aguda na região de Porto Velho – Rondônia. Utilizamos neste estudo 15 amostras de EPEC típica e 102 de EPEC atípica isoladas de crianças de 0 a 6 anos de idade, admitidas no Hospital Infantil Cosme e Damião (HICD) com quadro clínico de gastroenterite aguda, no período de fevereiro de 2010 a fevereiro de 2012. Para a caracterização dos isolados realizamos testes de sensibilidade aos antimicrobianos (TSA), testes fenotípicos e moleculares para a pesquisa dos genes blaTEM, blaSHV e blaCTX-M codificadores de betalactamases de espectro estendido (ESBL). Pesquisamos nos isolados tanto as propriedades de hemolisar hemácias, citoaderência, quanto a capacidade de formar biofilme. Neste estudo verificou-se uma elevada frequência de resistência aos antibióticos ampicilina (59,8%), trimetoprim-sulfametoxazol (57,7%) e tetraciclina (39,3%). Dezessete isolados (14,5%) foram considerados suspeitos para a produção da enzima betalactamase pelo teste fenotípico.Vinte e oito (23,9%) apresentaram o gene codificador de ESBL do tipo blaTEM, 9 (7,7%) blaSHV e 23 (19,7%) blaCTX-M. Não houve relação estatística entre a presença destes genes com os isolados considerados suspeitos para produção de ESBL. Quanto aos testes de citoaderência, 14 isolados (12%) apresentaram uma adesão agregativa, 31 (26,5%) adesão localizada e 72 (61,5%) adesão localizada like. Nos ensaios de formação de biofilme, 16 isolados (13,68%) foram considerados fortemente aderentes e 15 (12,82%) fracamente aderentes. Quanto a atividade hemolítica verificou-se a presença de hemólise em 21 isolados (17,9%), sendo que 18 (15,5%) foram α-hemolíticos e 3 (2,6%) β-hemolíticos. Diante desses resultados, conclui-se que os isolados de EPEC analisados neste estudo apresentam diferentes padrões de citoaderência, ocorrendo a presença de cepas resistentes aos antibióticos, com capacidade de formação de biofilme e que apresentam atividade hemolítica. Este fato é preocupante visto que estes são considerados fatores de virulência adicionais que podem favorecer a persistência bacteriana e causar sérios danos ao hospedeiro.
ABSTRACT
Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) is considered an important causative agent of diarrhea, especially in developing countries. This pathotype diarrheagenic E. coli is divided into two categories taking as basis the presence of a pathogenicity island called Locus of
Enterocyte Effacement (LEE) and EPEC Adherence Factor (EAF plasmid) in typical EPEC
strains and the absence of this plasmid in strains of atypical EPEC. The aim of this study was the phenotypic and molecular characterization of enteropathogenic E. coli isolated from typical and atypical children with acute gastroenteritis in the region of Porto Velho - Rondônia. Used in this study 15 samples of typical EPEC and 102 atypical EPEC isolated from children 0 to 6 years of age, admitted to the Hospital Infantil Cosme e Damião (HICD) with clinical symptoms of acute gastroenteritis in the period from February 2010 to February in 2012. For the characterization of the isolates we realize antimicrobial susceptibility tests (TSA), phenotypic and molecular tests for the detection of genes blaTEM, blaSHV and blaCTX-M encoding extended-spectrum beta-lactamases (ESBL). We researched in the isolates both the properties to hemolyze erythrocytes, cytoadherence, the ability to form biofilm. In this study there was a high frequency of resistance to ampicillin (59.8%), trimethoprim-sulfamethoxazole (57.7%) and tetracycline (39.3%). Seventeen isolates (14.5%) were suspected to produce the enzyme beta-lactamase in the phenotypic test. Twenty eight (23.9%) presented the gene encoding ESBL of type blaTEM, 9 (7.7%) blaSHV and 23 (19.7%) blaCTX-M. There was no statistical relationship between the presence of these genes with isolates considered suspicious for ESBL production. As for cytoadherence tests, 14 isolates (12%) showed a aggregative adhesion, 31 (26.5%) localized adherence and 72 (61.5%) localized- like adherence. In biofilm formation assays, 16 isolates (13.68%) were strongly adherent and 15 (12.82%) weakly adherent. As for hemolytic activity we verified the presence of hemolysis in 21 isolates (17.9%), and 18 (15.5%) were α-haemolytic and 3 (2.6%) β-hemolytic. Given these results, we concluded that EPEC isolates analyzed in this study have different patterns of cytoadherence, occurring the presence of antibiotic resistant strains, capable to form biofilm and presenting hemolytic activity. This is alarming since these are considered additional virulence factors that may contribute to bacterial persistence and cause serious harm to the host.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 – Sítios de colonização de E. coli patogênica em humanos...17 Figura 2 – Contribuição dos elementos genéticos móveis para evolução de E. coli patogênica...18 Figura 3 – Representação esquemática do mecanismo de patogenicidade das seis categorias de
Escherichia coli diarreiogênicas...19
Figura 4 – Representação esquemática do Locus of Enterocyte Effacement (LEE) e do Plasmídeo EAF (EPEC Adherence Factor EAF)...21 Figura 5 – Representação esquemática do Sistema de Secreção do Tipo III ...23 Figura 6- Representação esquemática dos três estágios de patogênese de EPEC proposto por Donnemberg e Kaper (1992)...24 Figura 7- Estágio inicial da infecção por EPEC, conhecido como aderência localizada (AL)...25 Figura 8- Segundo estágio da infeção por EPEC e a interação entre intimina/Tir...26 Figura 9- Microscopia eletrônica de transmissão demonstrando a Lesão A/E...27 Figura 10 – Microscopia óptica de campo claro (1000X) das amostras de EPEC típica e atípica (A a F), dos controles positivos de EPEC típica (G e H), atípica (I e J) e EAEC O42 (K e L), e dos controles negativos (M a P), apresentando diferentes fenótipos de adesão em células HEp-2, após 3 horas e 6 horas de incubação...45 Figura 11 - Capacidade de formação de biofilme dos isolados de EPEC oriundos de crianças de 0 a 6 anos, com gastroenterite aguda em Porto Velho/RO...47 Figura 12 – Valores observados da densidade óptica dos isolados de EPEC (distribuídos em intervalo de classe), oriundos de crianças com gastroenterite aguda em Porto Velho/RO, a um comprimento de onda de 640nm...47 Figura 13 – Resultado do teste de formação de biofilme por espectrofotometria nos isolados de EPEC oriundos de crianças com gastroenterite em Porto Velho/RO...48 Figura 14- Perfil de susceptibilidade aos antibióticos dos 117 isolados de EPEC oriundos de crianças de 0 a 6 anos com gastroenterite aguda em Porto Velho/RO...50 Figura 15 – Teste fenotípico para detecção de sensibilidade aos antimicrobianos (TSA) nos isolados de EPEC oriundos de crianças com gastroenterite em Porto Velho/RO...52 Figura 16 – Frequência de resistência dos isolados de EPEC típica e atípica oriundos de crianças com gastroenterite em Porto Velho/RO...53
Figura 17 – Teste confirmatório para a produção da enzima β-lactamase...55 Figura 18- Perfil de resistência dos isolados de EPEC suspeitos para a produção de ESBL oriundos de crianças com gastroenterite em Porto Velho/RO...56 Figura 19- Presença de genes codificadores de ESBL do tipo blaTEM em isolados de EPEC oriundos de crianças com gastroenterite em Porto Velho/RO...58 Figura 20- Presença de genes codificadores de ESBL do tipo blaSHV em isolados de EPEC oriundos de crianças com gastroenterite em Porto Velho/RO...59 Figura 21- Presença de genes codificadores de ESBL do tipo blaCTX-M em isolados de EPEC oriundos de crianças com gastroenterite em Porto Velho/RO...59 Figura 22- Teste de atividade hemolítica em ágar sangue de carneiro 5% em isolados de EPEC oriundos de crianças com gastroenterite em Porto Velho/RO...62
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Diâmetro do halo de inibição para cada classe de antibiótico testado, de acordo com as recomendações do CLSI (2012)...37 Tabela 2 – Diâmetro dos halos de inibição aos antibióticos β-lactâmicos para detecção de ESBL...39 Tabela 3 – Sequência de primers utilizados para amplificação de genes codificadores de β-lactamases do tipo blaTEM , blaSHV e blaCTX-M...40 Tabela 4- Perfil de adesão em células HEp-2 apresentado por cepas de Escherichia coli enteropatogênica típica e atípica, isoladas de crianças com gastroenterite aguda em Porto Velho/RO...44 Tabela 5 – Capacidade de formação de biofilme em isolados de Escherichia coli enteropatogênica oriundos de crianças com gastroenterite em Porto Velho/RO...46 Tabela 6- Perfil de susceptibilidade aos antibióticos dos 117 isolados de EPEC oriundos de crianças com gastroenterite aguda em Porto Velho/RO...51 Tabela 7 - Perfil de susceptibilidade aos antibióticos dos isolados de EPEC típica e atípica, oriundos de crianças com gastroenterite em Porto Velho/RO...54 Tabela 8- Resultado do teste fenotípico para a detecção de betalactase de espectro estendido (ESBL) em cepas de EPEC oriundas de crianças com gastroenterite em Porto Velho/RO...55 Tabela 9 – Frequência de genes codificadores de ESBL do tipo blaTEM e blaSHV nos isolados de EPEC oriundos de crianças com gastroenterite em Porto Velho/RO. ...57 Tabela 10- Resultado do teste de hemólise dos isolados de EPEC oriundos de criança com gastroenterite em Porto Velho/RO...62
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AA – Aderência agregativa AD – Aderência difusa
aEPEC – E. coli enteropatogênica atípica AL – Aderência localizada
ALL – Aderência localizada like
AMC - Amoxicilina + Ácido Clavulânico AMI - Amicacina
AMP – Ampicilina ATM - Aztreonama BFP- Bundle forming pili ClyA - Citolisina A CAZ - Ceftazidima CIP - Ciprofloxacina CLO – Cloranfenicol CPD - Cefpodoxime CRO - Ceftriaxona CRX - Cefuroxima CTX - Cefotaxima
DAEC - E. coli que adere difusamente DEC - E. coli diarreiogênicas
DMEM - Meio Mínimo Essencial de Eagle modificado por Dulbeco EAEC - E. coli enteroagregativa
EAF - EPEC Adherence Factor EIEC - E. coli enteroinvasiva EHEC - E. coli enterohemorrágica EhxA - Enterohemolisina
EPEC - Escherichia coli enteropatogênica ESBL – Betalactamase de espectro estendido Esps - EPEC secreted proteins
ETEC - E. coli enterotoxigênica ExPEC - E. coli extraintestinal
FCA – Fracamente aderente FMA – Fortemente aderente GEN - Gentamicina
HICD – Hospital Infantil Cosme e Damião HlyA- Alfa hemolisina
HlyE- Hemolisina E
HUS - Síndrome hemolítica urêmica I – Intermediário
IPM - Imipenen
LEE - Locus of Enterocyte Effacement NA – Não aderente
NMEC - E. coli causadora de meningite neonatal N-WASP - Neural Wiskott-Aldrich Syndrome Protein OMS – Organização Mundial de Saúde
PAIs - ilhas de patogenicidade PPT - Piperaciclina+Tazobactam R - Resisstente
RDEC - E. coli diarreiogênica em coelhos S- Sensível
SFB - Soro Fetal Bovino SRO - Sais de reidratação oral
SUT - Trimetoprim - Sulfametoxazol tEPEC – E. coli enteropatogênica típica TET – Tetraciclina
TSA – Teste de sensibilidade aos antimicrobianos TTSS - Sistema de Secreção do tipo III
UFCs – Unidades formadoras de colônias UPEC - E. coli uropatogênica
UTI - Infecções do trato urinário UV – ultravioleta
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO...14
1.1 A GASTROENTERITE AGUDA...14
1.2 Escherichia coli DIARREIOGÊNICA (DEC)...16
1.3 Escherichia coli ENTEROPATOGÊNICA (EPEC)...20
2.0 OBJETIVOS...30 2.1 OBJETIVO GERAL...30 2.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS...30 3.0 MATERIAIS E MÉTODOS...31 3.1 POPULAÇÃO E AMOSTRA...31 3.2 LOCAL DO ESTUDO...31 3.3 ASPECTOS ÉTICOS ...32 3.4 CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA...32
3.5 ENSAIO DE ADESÃO EM CÉLULA (CITOADERÊNCIA)...33
3.6 DETECÇÃO DE BIOFILME POR ESPECTROFOTOMETRIA...35
3.7 TESTE DE SENSIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS (TSA)...36
3.8 TESTE DE SENSIBILIDADE PARA DETECÇÃO DE BETALACTAMASE DE ESPECTRO ESTENDIDO (ESBL)...38
3.9 EXTRAÇÃO DE DNA GENÔMICO...39
3.10 REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)...40
3.11 ELETROFORESE...41
3.12 TESTE DE HEMÓLISE ...41
3.13 ANÁLISE ESTATÍSTICA...42
4.0 RESULTADOS E DISCUSSÃO...43
4.1 FREQUÊNCIA DOS ISOLADOS DE EPEC TÍPICA E ATÍPICA...43
4.2 PERFIL DE ADESÃO EM CÉLULAS HEp-2...43
4.3 CAPACIDADE DE FORMAÇÃO DE BIOFILME POR ESPECTROFOTOMETRIA...46
4.4 PERFIL DE SUSCEPTIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS ...49
4.5 DETECÇÃO FENOTÍPICA DE BETALACTAMASE DE ESPECTRO ESTENDIDO (ESBL) ...54
4.6 DETECÇÃO MOLECULAR DE GENES CODIFICADORES DE ESBL...57
4.7 TESTE DE ATIVIDADE HEMOLÍTICA NOS ISOLADOS DE EPEC...61
CONCLUSÃO...64
REFERÊNCIAS ...65
ANEXO I – TCLE ...70
INTRODUÇÃO
A diarreia é considerada uma das principais causas de morbidade e mortalidade infantil, principalmente nos países em desenvolvimento, representando um grave problema de saúde pública. Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS), a diarreia é a segunda principal causa de morte entre crianças abaixo dos cinco anos de idade, sendo responsável pela morte de aproximadamente 760.000 crianças a cada ano, ocorrendo cerca de 1.7 bilhões de casos por ano. As manifestações clínicas dessa doença são variáveis em características e severidade, estando relacionada com o estado imunológico do indivíduo e com a natureza do agente etiológico (THEA & KEUSCH, 1993; WHO, 2013).
Existem três tipos clínicos de diarreia:1) Diarreia aguda aquosa, que dura vários horas ou dias, sendo caracterizada pela perda de grande quantidade de água durante a evacuação, promovendo uma alteração na consistência das fezes e podendo estabelecer rapidamente um quadro de desidratação; 2) Diarreia aguda sanguinolenta, também chamada de disenteria é caracterizada pela presença de sangue nas fezes, podendo haver presença de muco e pus, sugerindo inflamação ou infecção do intestino; 3) Diarreia persistente, dura 14 dias ou mais (BRASIL, 2009; GRANADO-VILLAR et al., 2012).
De maneira geral, a diarreia é considerada um sintoma de infecção do trato gastrointestinal, podendo ser causada por uma variedade de micro-organismos tais como vírus, bactérias, protozoários, helmintos, ou ainda por agentes de origem não patogênica como nos casos de intolerância a lactose e glúten, ingestão demasiada de alguns alimentos, sais mal absorvidos, dentre outros. Porém, os casos de diarreia de origem infecciosa são os de maior importância para saúde pública devido a sua maior frequência (BRASIL, 2009; AHS et al., 2010; GRANADO-VILLAR et al., 2012).
1.1 A GASTROENTERITE AGUDA
A gastroenterite aguda é resultado da infecção do trato gastrointestinal por vários agentes patogênicos que alteram a função intestinal, sendo definida como uma inflamação da mucosa do trato gastrointestinal e caracterizada por manifestações clínicas que podem incluir diarreia, vômito, febre, anorexia e cólicas abdominais. É uma doença muito comum entre crianças e uma das principais causas de hospitalização com significante mortalidade nos países em desenvolvimento (CHOW et al., 2010; LIMA & DIAS, 2010; GRANADO-VILLAR et al., 2012).
A transmissão desses agentes patogênicos pode ocorrer por via oral ou fecal-oral, em que os agentes patogênicos são excretados a partir do trato gastrointestinal de uma pessoa ou animal portador da doença e são ingeridos por outro, podendo a transmissão ocorrer de forma indireta, através da ingestão de alimentos, água contaminada, ou por contato com objetos contaminados (como: utensílios de cozinha, acessórios de banheiro ou equipamentos hospitalares), de forma direta, de pessoa para pessoa (como resultado da falta de higiene) e de animais para pessoas (BRASIL, 2009; AHS et al., 2010; LIMA & DIAS, 2010).
O diagnóstico pode ser realizado clinicamente através de uma anamnese, onde devem ser coletadas informações sobre a idade do paciente, peso anterior, número de dias de diarreia, número de dejeções nas últimas 24 horas, consistência e características das fezes (aquosas ou sanguinolentas), associação da diarreia a vômitos, dor abdominal, febre, quantidade de líquido ingerido, aleitamento materno, medicação efetuada, viagem nas últimas duas semanas, contato com outros casos e patologias pré-existentes, a fim de se obter a história clínica do paciente para uma orientação diagnóstica e terapêutica (BRASIL, 2009; LIMA & DIAS, 2010).
Quanto ao tratamento da gastroenterite aguda, é realizado principalmente para a prevenção ou tratamento da desidratação, incluindo reidratação oral com uma solução pré-formulada (Sais de reidratação oral – SRO) ou com fluidos que podem ser preparados e administrados em casa, o uso de suplemento de Zinco também é recomendado. Tratamentos farmacológicos tais como o uso de antieméticos e medicamentos antidiarreicos, geralmente, não são indicados pois podem causar complicações (devido aos efeitos colaterais). O uso de antibióticos normalmente não é indicado, sendo necessário apenas para os casos de gastroenterite bacteriana complicada (ELLIOTT, 2007; LIMA & DIAS, 2010).
De maneira geral, os mesmos agentes patogênicos são os responsáveis por causar gastroenterite em todo mundo, sendo que a frequência de cada patógeno pode variar dependendo da localização geográfica ou da população estudada. Além disso, as infecções entéricas também podem diferir de acordo com a idade ou a dieta da população, entre um ambiente rural ou urbano, ambiente hospitar e a comunidade, e também quanto ao período ou estação em que o estudo está sendo realizado. Embora ocorram essas diferenças, determinados micro-organismos como o Rotavírus, Salmonella spp., Shigella spp.,
Escherichia coli enteropatogênica (EPEC), E. coli enteroagregativa (EAEC) e Vibrio cholerae são os patógenos que contribuem significativamente com a morbidade e mortalidade
Os vírus (rotavírus, norovírus, astrovírus, adenovírus e calicivírus) são os responsáveis por aproximadamente 70% dos episódios de gastroenterite aguda em crianças, sendo o rotavírus o principal agente etiológico causador dessa doença em todo mundo. As infecções bacterianas correspondem por 10 a 20% dos casos, sendo que as infecções por Escherichia
coli (E. coli) são as que apresentam as maior frequência nos países em desenvolvimento. Os
protozoários (Cryptosporidium, Giardia lamblia e Entamoeba histolytica) e os helmintos (Strongyloides stercoralis) apresentam uma prevalência menor que 10% (AHS et al., 2010; ELLIOTT, 2007; CHOW et al., 2010; GRANADO-VILLAR et al., 2012).
Nos países em desenvolvimento os enteropatógenos bacterianos desempenham um importante papel nos casos de gastroenterite, e as cepas de Escherichia coli diarreiogênica (E. coli enteropatogênica, enterotoxigênica, enteroagregativa, enteroinvasiva e enterohemorrágica) são os principais patógenos (REVELAS, 2012).
1.2 Escherichia coli DIARREIOGÊNICA (DEC)
A bactéria Escherichia coli é um bacilo gram negativo, anaeróbio facultativo, que apresenta cepas móveis ou imóveis. É um membro da família Enterobacteriaceae, gênero
Escherichia, tendo sido descrita pela primeira vez por Theodore Escherich em 1885, que a
denominou de Bacterium coli commune, indicando a ocorrência universal desta bactéria no intestino de indivíduos saudáveis (NATARO & KAPER, 1998; RODRIGUEZ-ANGELEZ, 2002; VIDAL et al., 2007).
E. coli faz parte da microbiota de muitos animais e humanos, e tipicamente coloniza o
trato gastrointestinal de humanos poucas horas após o nascimento. Estas cepas comensais raramente causam doença, e geralmente coexistem bem em indivíduos saudáveis, exceto em hospedeiros debilitados ou imunocomprometidos, ou quando as barreiras gastrointestinais são violadas (NATARO & KAPER, 1998; KAPER et al., 2004).
Embora seja considerada um habitante natural da flora intestinal, algumas cepas de E.
coli tem adquirido fatores de virulência específicos que lhes conferem a capacidade de se
adaptar a novos nichos e se tornar um patógeno altamente adaptado capaz de causar um amplo espectro de doenças, desde gastroenterite, infecções extra-intestinais do trato urinário, corrente sanguínea e sistema nervoso central (Figura 1) (KAPER et al., 2004; CROXEN & FINLAY, 2010; TORRES, 2010).
Figura 1 – Sítios de colonização de E. coli patogênica em humanos.
E. coli patogênica coloniza vários locais no corpo humano. 1) E. coli enteropatogênica (EPEC), E. coli
enterotoxigênica (ETEC) e E. coli que adere difusamente (DAEC) colonizam o intestino delgado e causam diarreia. 2) E. coli enterohemorrágica (EHEC) e E. coli enteroinvasora (EIEC) causam doença no intestino grosso; E. coli enteroagregativa (EAEC) pode colonizar o intestino delgado e intestino grosso; 3) e 4) E. coli uropatogênica (UPEC) entra no trato urinário e viaja para bexiga para causar cistite, e se não tratada, pode ascender para os rins e causar pielonefrite. 5) Septicemia pode ocorrer com UPEC e E. coli causadora de meningite neonatal (NMEC). 6) NMEC pode atravessar a barreira sangue-cérebro e entrar no sistema nervoso, causando meningite. Fonte: (Adaptada de CROXEN & FINLAY, 2010, v.8, p.27, tradução nossa).
Tem sido postulado que cepas comensais de E. coli podem ser o reservatório natural de tipos patogênicos, porque esse tipo comensal normalmente inofensivo necessita somente adquirir uma combinação de elementos genéticos móveis para se tornar um patógeno capaz de causar doenças. A perda e ganho de elementos genéticos móveis tem um papel essencial na formação do genoma de bactérias patogênicas pois os fatores de virulência de E. coli são codificados por vários elementos genéticos móveis, incluindo transposons, plasmídeos e bacteriófagos, além disso as cepas comensais também podem sofrer deleções, mutações de ponto ou outros rearranjos de DNA que podem contribuir para virulência. Essas adições, deleções ou outras mudanças genéticas podem dar origem as formas patogênicas de E. coli capazes de causar diarreia, disenteria, síndrome hemolítica urêmica (HUS), infecções do trato urinário (UTI) e meningite (Figura 2) (KAPER et al., 2004; CROXEN & FINLAY, 2010; TORRES, 2010).
Figura 2 – Contribuição dos elementos genéticos móveis para evolução de E. coli patogênica.
Os fatores de virulência podem ser codificados por vários elementos genéticos móveis, incluindo transposons (por exemplo, a enterotoxina termo-estável (ST) de ETEC), plasmídeos (por exemplo, a enterotoxina termo-lábil (LT) de ETEC e os fatores de invasão de EIEC), bacteriófago (por exemplo, a shiga-toxina de EHEC) e ilhas de patogenicidade (PAI) (por exemplo, o Locus of enterocyte
efacement (LEE) de EPEC/EHEC e PAIs I e II de UPEC). E. coli comensal pode sofrer deleções,
mutações de ponto, ou outros rearranjos no DNA que podem contribuir para virulência. Estas adições, deleções e outras mudanças genéticas pode dar origem a formas de E. coli patogênicas capazes de causar diarreia (EPEC, EHEC, EAEC e DAEC), desinteria (EIEC), Síndrome Hemolítica Urêmica (EHEC) e meningite (NMEC). Fonte: (Adaptada de KAPER et al., 2004, v.2, p.134, tradução nossa).
Atualmente oito categorias patotípicas distintas de E. coli patogênicas tem sido descritas, as quais são classificadas em E. coli diarreiogênicas (DEC) ou E. coli extraintestinal (ExPEC). Dois patótipos são extraintestinais, a E. coli uropatogênica (UPEC) e a E. coli
causadora de meningite neonatal (NMEC), enquanto que as espécies de E. coli diarreiogênicas (DEC) são divididas em seis categorias, baseadas em seu mecanismo de patogenicidade e quadro clínico: E. coli enteropatogênica (EPEC), Enterohemorrágica (EHEC), Enterotoxigênica (ETEC), Enteroinvasiva (EIEC), Enteroagregativa (EAEC) e E.
coli que adere difusamente (DAEC) (Figura 3) (KAPER et. al., 2004; VIDAL et al., 2007;
CROXEN & FINLAY, 2010).
Figura 3 – Representação esquemática do mecanismo de patogenicidade das seis categorias de Escherichia coli diarreiogênicas.
São reconhecidas seis categorias de E. coli diarreogênicas, cada uma tendo características únicas na interação com as células eucarióticas. a) EPEC se adere a enterócitos do intestino delgado, destrói a arquitetura normal da microvilosidade, induzindo a lesão característica “Attaching and Effacement” (Lesão A/E), além da formação de microcolônias compactas devido ao BFP (Bundle-forming pilus – Fímbria do tipo IV); 1. Adesão inicial; 2. Translocação de proteínas pelo Sistema de secreção do tipo III; 3. Formação de pedestal; b) EHEC também induz uma Lesão A/E, mas não no cólon, sendo a característica distinguível de EHEC a produção de Shiga toxina (Stx); c) ETEC se adere ao enterócito do intestino delgado e induz diarreia aquosa pela secreção de enterotoxinas termo-estável (ST) e termo-lábil (LT); d) EAEC se adere ao intestino grosso e delgado em um biofilme espesso e produz enterotoxinas secretoras e citotoxinas; e) EIEC invade células epiteliais do cólon, lisa o fagossomo e se move através da célula pela nucleação de microfilamentos de actina. f) DAEC induz um efeito de transdução de sinal característico nos enterócitos do intestino delgado, que se manifesta como um crescimento de projecções celulares semelhante a dedos longos, que se envolvem em torno das bactérias. Fonte: (Adaptado de KAPER et al., 2004, v.2, p.124, tradução nossa).
Dentre as categorias de E. coli diarreiogênicas, EPEC é considerada uma das principais causas de diarreia em crianças menores de dois anos em países em desenvolvimento, tendo como característica principal uma lesão histopatológica conhecida como lesão A/E (“Attaching and Effacing”), que envolve um mecanismo de patogenicidade complexo cujo resultado é a diarreia (MÜLLER et al., 2007; VIDAL et al., 2007; CROXEN & FINLAY, 2010).
Uma das principais características da infecção causada por EPEC é a diarreia do tipo aquoso (de diversos graus de intensidade), vômitos, febre e má absorção, sendo esta doença causada quando a bactéria alcança a mucosa intestinal e desencadeia um mecanismo de patogênese complexo que leva a destruição da microvilosidade do enterócito e a saída maciça de íons na luz intestinal (RODRIGUEZ-ANGELEZ, 2002; VIDAL et al., 2007; CLEMENTS et. al., 2012).
1.3 Escherichia coli ENTEROPATOGÊNICA (EPEC)
E. coli enteropatogênica (EPEC) foi o primeiro grupo de E. coli diarreiogênica que se
identificou por testes sorológicos e que se associou com os casos de diarreia infantil, recebendo este nome a fim de se diferenciar este tipo virulento de E. coli das cepas comensais presentes na microbiota humana (TRABULSI et. al., 2002; VIDAL et al., 2007; WONG et al., 2011 ARENAS-HERNÁNDEZ et. al, 2012).
EPEC é considerada a segunda causa mais comum de diarreia após rotavírus, tendo sido estimado a prevalência de EPEC em 8,8% na comunidade, 9,1% em ambientes hospitalares e 15,6% em ambientes ambulatoriais (ARENAS-HERNÁNDEZ et al., 2012). Nos países desenvolvidos houve um declínio na incidência de diarreia por EPEC e a ocorrência de surtos por essa bactéria são raros, entretanto, nos países em desenvolvimento, EPEC continua sendo uma importante agente causador de diarreia infantil com sua prevalência variando de 6 a 54% (CLEMENTS et al., 2012).
Este patótipo pertence a uma família de patógenos que produzem uma lesão histopatológica na superfície apical dos enterócitos, conhecida como lesão A/E, que consiste na destruição da microvilosidade e aderência íntima entre a bactéria e a membrana da célula epitelial intestinal. Outros membros desta família incluem E. coli enterohemorrágica (EHEC),
E. coli diarreiogênica em coelhos (RDEC), Citrobacter rodentium e a recentemente
identificada Escherichia albertii (formalmente conhecida como Hafnia alvei) (CROXEN & FINLAY, 2010; WONG, et. al.; 2011).
As cepas de EPEC são capazes de produzir esta lesão A/E devido a determinantes específicos de virulência codificados por um plasmídeo denominado “EPEC Adherence
Factor” (EAF) e por uma ilha de patogenicidade cromossomal chamada de “Locus of Enterocyte Effacement” (LEE) (Figura 4) (NATARO & KAPER, 1998; DEAN et al., 2005; CROXEN & FINLAY, 2010; ARENAS-HERNÁNDEZ et. al., 2012).
Figura 4 – Representação esquemática do Locus of Enterocyte Effacement (LEE) e do Plasmídeo EAF (EPEC Adherence Factor)
a) Representação da região LEE, que compreende 5 operons (LEE 1 a LEE 5) e 41 genes, cuja função de quase todos é conhecida, sendo estes genes agrupados de acordo com a sua função. b) Representação do Plasmídeo EAF, que compreende dois clusters de genes, um contendo 14 genes que coficam para a biogênese do BFP e outro contendo 3 genes (PerA, PerB e PerC) que estão envolvidos na regulação transcricional. c) Agrupamento funcional dos produtos de LEE, demonstrando uma elevada proporção de genes envolvidos na formação do Sistema de Secreção do tipo III (TTSS). Fonte: (Adaptado de DEAN et al., 2005, v.8, p.29, nossa tradução).
A presença do plasmídeo EAF, confere a EPEC a capacidade de produzir um modelo de aderência característico em cultura de células, denominado de Aderência Localizada (AL). Neste modelo de aderência, a bactéria se liga em áreas localizadas da superfície da célula, ocorrendo a formação de microcolônias compactas (“Clusters” de bactérias) após 3 horas de
incubação. Este fenótipo ocorre devido a presença de genes que codificam para uma fímbria do tipo IV chamada de “Bundle-forming pilus” (BFP), que promove a aderência entre as bactérias que formam as microcolônias e possivelmente a aderência entre as células epiteliais (TRABULSI et al., 2002; KAPER et. al., 2004; ARENAS-HERNÁNDEZ et. al., 2012).
O plasmídeo EAF pode apresentar um tamanho de 50 a 70MDa, e contém um cluster de 14 genes responsáveis pela biogênese do BFP e também o locus Per (Plasmid enconded
regulator) que contém 3 genes (PerA, PerB e PerC) que atuam como um ativador
transcricional. O cluster de Per codifica proteínas que formam um complexo regulador, que atua ativando a transcrição de vários genes tanto no plasmídeo EAF quanto no cromossomo, atuando inclusive nos genes necessários para a patogênese de EPEC (Figura 4) (NATARO & KAPER, 1998; CLARKE et al., 2003; KAPER et al., 2004).
A presença desse plasmídeo não é essencial para a formação da lesões A/E, embora a sua presença possa aumentar a eficiência na formação da desta lesão, provavelmente, através da influência do cluster de genes reguladores Per, que aumentam a expressão dos genes cromossomais contidos na região LEE (TRABULSI et al, 2002).
A região LEE é uma ilha de patogenicidade que codifica várias proteínas que são agrupadas em 6 categorias principais, compreendendo reguladores transcricionais, proteínas do Sistema de Secreção do tipo III (TTSS), translocadores, chaperonas, proteínas secretadas e a intimina (adesina) (DEAN et al., 2005). Este conceito de ilhas de patogenicidade (PAIs) foi introduzido pela primeira vez por Hacker e colaboradores em 1990, ao verificar que essas regiões cromossômicas apresentavam características próprias e propriedades diferentes do restante do genoma bacteriano, sendo as PAIs definidas como seguimentos de DNA inseridos no cromossomo bacteriano, que atribuem uma variedade de características de virulência aos micro-organismos que as possuem (VIEIRA, 2009 apud HACKER et. al., 1990).
A presença de LEE no cromossomo de EPEC é o principal fator responsável pela capacidade de induzir a lesão A/E. Do ponto de vista funcional, LEE pode ser dividido em cinco regiões (operons policistrônicos) designados LEE1 a LEE5, e estão separados em três domínios funcionais: uma região codificando o TTSS (LEE1, LEE2 e LEE3), uma região (LEE4) codificando as Esps (EPEC secreted proteins) e uma região codificando as proteínas envolvidas com a aderência íntima (LEE5), contendo os genes que codificam para a intimina (eae), Tir (tir) e sua chaperonina (cesT) (Figura 4) (NATARO & KAPER, 1998; KAPER et. al., 2004; NOUGAYRÈDE et. al., 2003; CROXEN & FINLAY, 2010; WONG et al., 2011).
O TTSS é um complexo de proteínas montado por muitos patógenos bacterianos gram negativos (incluindo EPEC) que é projetado para translocar proteínas através da parede
celular bacteriana dentro da célula eucariótica hospedeira. Quanto à sua estrutura, uma proteína translocadora secretada designada como EspA, forma uma extensão longa filamentosa, enquanto que outras duas proteínas translocadoras, EspB e EspD, formam um poro na membrana da célula hospedeira permitindo a translocação de proteínas efetoras no citoplasma da célula hospedeira (Figura 5) (DANIELL et al., 2003; PIZARRO-CERDÁ & COSSART, 2006).
Figura 5 – Representação esquemática do Sistema de Secreção do Tipo III
O sistema de secreção do tipo III é um complexo de proteínas (ou complexo agulha) montado e utilizado por Escherichia coli enteropatogênica para translocar proteínas efetoras no citoplasma da célula hospedeira. Fonte: ( Adaptado de PIZARRO-CERDÁ & COSSART, 2006).
Muitos estágios estão envolvidos na produção da lesão histopatológica A/E produzida por cepas de EPEC. Em 1992, Donnenberg e Kaper propuseram três estágios modelos para a patogênese de EPEC consistindo: 1- Aderência Localizada; 2- Transdução de sinal (ou adesão frouxa) e 3- Aderência íntima (Figura 6) (NATARO E KAPER, 1998; LU AND WALKER, 2001).
Figura 6 - Representação esquemática dos três estágios de patogênese de EPEC proposto por Donnemberg e Kaper (1992).
1) Aderência Localizada (mediada pelo BFP); 2) Transdução de sinal (montagem do TTSS e injeção de proteínas efetoras); 3) Aderência íntima (mediada pela interação entre a intimina e seu receptor tir), que promovem alterações no citoesqueleto e o estabelecimento da lesão A/E. Fonte: Adaptado de LU AND WALKER, 2001.
No primeiro estágio de patogênese de EPEC, que envolve a aderência inicial entre a bactéria e o epitélio intestinal da célula hospedeira, conhecido como aderência localizada (localized adhesion), os sinais do ambiente intestinal tais como a temperatura de 37ºC, pH neutro, cálcio, e outros, estimulam a expressão do BFP (Bundle forming pili), que é uma fímbria do tipo IV de cerca de 4 a 7 nm de diâmetro, na superfície da bactéria. Após receber estes estímulos e começar a expressar o BFP, EPEC se adere ao enterócito via BFP e estabelece o contato inicial ou adesão localizada. Nesta etapa, EPEC forma microcolônias compactas na superfície das células devido ao BFP, que permite a ligação bactéria-bactéria (Figura 7) (NATARO & KAPER, 1998; CROXEN & FINLAY, 2010).
No segundo estágio da infecção, conhecida como transdução de sinal, após a aderência inicial de EPEC ao enterócito, ocorre a montagem do TTSS, que forma um poro na membrana da célula hospedeira para que ocorra a injeção de várias proteínas secretadas (Esps) e a uma proteína bacteriana translocada denominada Tir, no citoplasma da célula hospedeira (Figura 5) (NATARO & KAPER, 1998; VALLANCE & FINLAY, 2000; PIZARRO-CERDÁ & COSSART, 2006).
Figura 7 - Estágio inicial da infecção por EPEC, conhecido como aderência localizada (AL)
Quando EPEC chega na luz intestinal (fase 1) por influência de condições locais, como a temperatura de 37°C e os íons Ca++, por exemplo, BFP é estimulado e expresso (fase 2), em seguida se adere aos enterócitos e a outras cepas de EPEC presentes no intestino (fase 3). Fonte: Adaptado de SILVA & SILVA, 2005.
Quando Tir se integra na membrana plasmática da célula hospedeira, dimeriza e funciona como um receptor para a proteína de membrana externa intimina. A interação intimina/Tir promove a fosforilação de Tir no resíduo de tirosina 474 por duas quinases do hospedeiro (Fyn e Abl), induzindo o recrutamento da proteína adaptadora Nck, que por sua vez recruta o N-WASP (Neural Wiskott-Aldrich Syndrome Protein) e o complexo Arp2/3 (actin-related protein 2/3), levando a polimerização de actina e a formação de uma estrutura conhecida como pedestal (Figura 8). A actina se liga a proteínas como α-actinin, talina e vinculina para estabilizar a estrutura do pedestal. EPEC também induz outras cascatas de sinalização com a célula hospedeira, incluindo o fluxo de inositol trifosfato (IP3), ativação de proteína quinase C, fosfolipase-Cγ e NF-kB (PIZARRO-CERDÁ & COSSART, 2006; CROXEN & FINLAY, 2010; CLEMENTS et al., 2012)
O terceiro e último estágio da patogênese de EPEC é caracterizado pela Lesão A/E, que tem como característica a aderência íntima da bactéria na superfície do enterócito, devido a destruição das microvilosidades intestinais e formação de uma estrutura semelhante a pedestal (Figura 9) (NATARO & KAPER, 1998; PIZARRO-CERDÁ & COSSART, 2006; CROXEN & FINLAY, 2010; CLEMENTS et al., 2012).
Figura 8 - Segundo estágio da infecção por EPEC e a interação entre intimina/Tir.
EPEC via TTSS injeta várias proteínas efetoras e o receptor Tir no citoplasma da célula hospedeira. Tir é inserido na membrana plasmática do hospedeiro, dimeriza, e atua como um receptor para a proteína de membrana externa intimina. A interação intimina/Tir promove a fosforilação de Tir por Fyn e Abl, induzindo o recrutamento da proteína adaptadora Nck, que por sua vez recruta o N-WASP e o complexo Arp2/3 (actin-related protein 2/3), levando a polimerização de actina e a formação de uma estrutura conhecida como pedestal. Fonte: (Adaptado de PIZARRO-CERDÁ & COSSART, 2006, tradução nossa).
Todo este mecanismo complexo de patogenicidade apresentado por EPEC acarreta o desenvolvimento da doença diarréica pela dramática perda da atividade de absorção pela microvilosidade, fato ocasionado devido a lesão A/E causada pela bactéria, levando o estabelecimento da diarreia devido a má absorção dos nutrientes. Entretanto, vale ressaltar que o mecanismo de patogênese apresentado acima, refere-se a cepas de E. coli enteropatogênica típicas, que possuem o Plasmídeo EAF e a região LEE, fato que não se aplica as cepas de EPEC atípicas que não possuem o plasmídeo EAF, e consequentemente o BFP, apresentando somente a região LEE (NATARO & KAPER, 1998; AFSET et. al., 2003).
Figura 9 - Microscopia eletrônica de transmissão demonstrando a Lesão A/E (Attaching and Effacement)
Lesão A/E caracterizada pela adesão íntima da bactéria a célula hospedeira, formando uma estrutura chamada de pedestal. Fonte: NOUGAYRÈDE et. al., 2003.
Em 1995 Escherichia coli enteropatogênica foi dividida em dois grupos EPEC típica (tEPEC) e EPEC atípica (aEPEC) em um Simpósio Internacional em São Paulo, tendo sido definido que: “EPEC são Escherichia coli diarreiogênicas que produzem uma lesão
histopatológica característica conhecida como attaching and effacing (A/E) nas células intestinais e que não produzem Shiga, Shiga-like, ou verotoxinas. EPEC típica de origem humana possui um plasmídeo de virulência conhecido como EAF (EPEC adherence factor) que codifica aderência localizada em cultura de células epiteliais mediada pelo Bundle Forming Pilus (BFP), enquanto que EPEC atípica não possui esse plasmídeo. A maioria dos tipos de EPEC pertencem a certos sorotipos O:H bem reconhecidos como: O26;55, 86, 111, 114, 119, 125, 126, 127, 128, 142 e 158”.
Baseado nessa definição, as cepas de EPEC são consideradas típicas quando possuem a região LEE, que codifica para o TTSS, para intimina e as proteínas secretadas, e possuem o plasmídeo EAF, que codifica para o BFP, responsável pelo fenótipo de aderência localizada (AL), enquanto que as cepas atípicas se caracterizam apenas pela presença da região LEE (ilha de patogenicidade), não possuindo o plasmídeo EAF, e consequentemente a fímbria do tipo IV denominada de BFP (RODRIGUEZ-ANGELES, 2002; AFSET et. al., 2003).
Tanto EPEC típica quanto atípica, possuem a capacidade de causar a diarreia, entretanto as cepas típicas produzem a adesão localizada (AL), com formação de microcolônias compactas em células HeLa/HEp-2 após 3 horas de incubação, e o crescimento destas microcolônias compactas é mediada pelo BFP, enquanto que as cepas atípicas são
incapazes de produzir LA e formam apenas microcolônias bacterianas soltas, que são detectados apenas depois de ensaios de adesão prolongados, ou seja, após 6 horas de incubação, formando o padrão de aderência localizada-like (ALL). Além destes padrões de aderência alguns tipos EPEC também podem apresentar o modelo de aderência difusa (DA) e de aderência agregativa (AA) (TRABULSI et al., 2002; HERNANDES et al., 2009; SCHMIDT, 2010).
EPEC é um patógeno bacteriano muito versátil, podendo apresentar diversos fatores de virulência. Considerando seu repertório de genes de virulência, EPEC é um grupo muito heterogêneo, albergando genes que são encontrados em outros patótipos de E. coli diarreiogênica tais como os genes que codificam para hemolisinas e para a formação de biofilme (MAGALHÃES et al., 2011).
As hemolisinas são toxinas que atuam sobre a membrana dos eritrócitos e de diversos tipos celulares. Este grupo de toxinas, ao contrário de outras, não são internalizadas pelas células alvo, mas agem ativamente sobre as membranas celulares, causando distúrbios em sua estrutura e função, manifestadas sob a forma de lise e morte celular. As hemolisinas não atuam somente sobre os eritrócitos, mas causam também dano a fibroblastos, plaquetas, monócitos, granulócitos e células endoteliais e do miocárdio. Tal grupo de toxinas é reconhecido como um dos principais fatores de virulência envolvido na patogênese bacteriana (MAGALHÃES et al., 2011).
Várias hemolisinas tem sido identificadas entre diferentes patógenos, em E. coli três tipos tem sido identificadas, alfa hemolisina (HlyA), enterohemolisina (EhxA) e hemolisina E ou citolisina A (HlyE ou ClyA), dentre elas a alfa hemolisina é mais estudada e é produzida principalmente por ExPEC, ETEC, E. coli produtora de Shiga toxina e EPEC (MURASE et al., 2012).
A capacidade de formação de biofilme é um outro fator de virulência e um mecanismo de resistência natural da bactéria, tendo sido demonstrada em vários patógenos, principalmente os associados a infecções crônicas. O termo biofilme refere-se a capacidade da bactéria se aderir tanto a superfície abiótica quanto biótica, sendo definido como uma comunidade microbiana associada a superfície, e rodeada por uma matriz de substância polimérica extracelular. Esta matriz exopolissacarídica formada no biofilme torna os micro-organismos mais resistentes a ação de agentes químicos e físicos, impedindo a penetração de agentes antimicrobianos, dificultando a destruição das bactérias no biofilme e favorecendo a persistência bacteriana em casos de infecção (MACEDO, 2000; NORMARK & NORMARK, 2002; HALL-STOODLEY & STOODLELY, 2009; KASNOWSKI, et. al, 2010).
Em EPEC a capacidade de formação de biofilme já tem sido demonstrada, e acredita-se que a formação de microcolônias é o estágio inicial para o deacredita-senvolvimento do biofilme, estando envolvida no processo várias adesinas incluindo o BFP e o EspA (MOREIRA et al., 2006).
Além dos mecanismos diretamente relacionados à virulência, a resistência aos antimicrobianos tem sido considerada um fator extremamente importante a ser analisado, pois nas populações de E. coli verifica-se a ocorrência de resistência a múltiplos antibióticos. Dentre os mecanismos de resistência, as betalactamases de espectro estendido (ESBL) estão entre os determinantes de resistência mais importante em Enterobacteriaceae (REGUA- MANGIA, et al., 2009; MNIF et al., 2013).
As betalactamases são enzimas capazes de hidrolisar o anel betalactâmico de penicilinas, cefalosporinas e monobactâmicos, tornando-os inativos, sendo este mecanismo de resistência mediado por plasmídeos. Estes plasmídeos também são portadores de genes de resistência a outros antibióticos, incluindo: aminoglicosídeos, cloranfenicol, sulfonamidas, trimetoprim e tetraciclina, sendo assim, as bactérias que possuem esse plasmídeo são multirresistentes (GUPTA et al., 2003; JÚNIOR et al., 2004; DALMARCO et al., 2006; RIVA et al., 2008).
As cepas de Klebsiella spp e Escherichia coli são as bactérias mais comuns produtoras de ESBLs, porém a presença desta enzima já foi detectada em outras espécies de enterobactérias. As ESBLs normalmente são codificadas pelos genes do tipo blaTEM (Temoniera) e blaSHV (Sulfidril Variável), entretanto nos últimos anos houve o aparecimento de outras ESBLs, como por exemplo as pertencentes a família blaCTX-M, blaPER, blaVEB, blaGES, blaTLA e blaBES ( JÚNIOR et al., 2004; DALMARCO et al., 2006).
Em estudos anteriores realizados no laboratório de microbiologia do CEPEM, tais como o realizado por ORLANDI et al., (2006) e o realizado entre fevereiro de 2010 a 2012 (Dados não publicados), sobre a etiologia das infecções diarreicas, observou-se que E. coli diarreiogênica foi o segundo grupo de patógeno mais frequentemente isolado, sendo EPEC o patótipo mais prevalente.
Em virtude disso e dada a importância de Escherichia coli enteropatogênica (EPEC) como agente causador da diarreia, decidiu-se fazer este estudo a fim de caracterizar estes isolados visto que EPEC pode apresentar outros fatores virulência como a capacidade de formação de biofilme, atividade hemolítica e a produção de betalactamase de espectro extendido (ESBL).
2.0 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Realizar a caracterização fenotípica e molecular das amostras de Escherichia coli enteropatogênicas típicas e atípicas isoladas de crianças com gastroenterite aguda na região de Porto Velho – Rondônia.
2.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Determinar o perfil molecular e celular das amostras de Escherichia coli enteropatogênicas isoladas.
Determinar os diferentes padrões de citoaderência (AL, AD, AA e ALL) dos isolados de EPEC.
Detectar a capacidade de formação de biofilme nas cepas de Escherichia coli enteropatogênica.
Caracterizar e determinar o padrão de resistência aos antibióticos de EPEC por meio de testes fenotípicos e moleculares;
3.0 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 POPULAÇÃO E AMOSTRA
O presente estudo foi realizado utilizando-se um total de 117 isolados de Escherichia
coli enteropatogênica (EPEC) típica e atípica que estavam armazenados no Laboratório de
Microbiologia do CEPEM. Tais amostras são provenientes da coleta de material fecal para realização do projeto intitulado: “Caracterização etiológica e molecular dos vírus associados à gastroenterite em crianças de 0 a 6 anos de idade na região de Porto Velho-RO”.
Todas as amostras de EPEC são provenientes da coleta realizada para o estudo supracitado, onde foram coletados 593 amostras fecais de crianças de 0 a 6 anos de idade, admitidas no Hospital Infantil Cosme e Damião (HICD) com quadro clínico de gastroenterite aguda, no período de fevereiro de 2010 a fevereiro de 2012. Destas amostras fecais, um total de 1.625 isolados foram identificados por testes bioquímicos como pertencentes a Eschechia
coli, e submetidos a técnica de PCR multiplex para detecção de genes virulência que os
caracterizavam como pertencente a alguma categoria de E. coli diarreiogênica, tendo sido identificado 233 isolados (14,3%) de E. coli diarreiogênica, destes 117 eram pertencentes a EPEC (50,2%), 109 (46%) EAEC, 5 (2,1%) ETEC e 2 (0,85%) EHEC (Dados não publicados).
3.2 LOCAL DO ESTUDO
O estudo foi realizado no Hospital Infantil Cosme e Damião (HICD), principal centro de atendimento médico infantil do Estado de Rondônia, sendo uma das Unidades de Saúde pertencente à Secretaria de Estado da Saúde (SESAU/RO), e foi realizado mediante coleta de material fecal de crianças que aceitaram participar da pesquisa mediante autorização de seu responsável legal no Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE), constante no ANEXO I, conforme estabelecido na Resolução CNS 196/96.
O Hospital Cosme e Damião atualmente encontra-se localizado na Rua Benedito de Souza, nº 4045, Bairro Industrial, porém no período do estudo encontrava-se localizado na Rua Rafael Vaz e Silva, nº 3041, Bairro Liberdade.
3.3 ASPECTOS ÉTICOS
O presente estudo utilizou amostras biológicas armazenadas, que foram coletadas para realização do projeto citado anteriormente e que foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisas envolvendo seres humanos do Centro de Pesquisa em Medicina Tropical (CEP/CEPEM), sob o número de protocolo 0113/2010, parecer nº 19/2010.
Por se tratar de pesquisa que utilizou material biológico de origem humana armazenado, e com a finalidade de cumprir o estabelecido pela Resolução CNS 196/96 e suas complementares, em especial a Resolução CNS 441/2011, que dispõe sobre o armazenamento de material biológico humano ou uso de material armazenado em pesquisas anteriores, este estudo foi submetido ao Comitê de Ética em Pesquisas envolvendo Seres Humanos do Centro de Pesquisa em Medicina Tropical (CEP/CEPEM) como uma nova pesquisa, sendo solicitado ao CEP a insenção da aplicação de um novo Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE).
Vale salientar que conforme a Resolução CNS 441/2011, os projetos de pesquisas que pretendem utilizar amostras armazenadas em biobanco ou biorrepositório podem solicitar a isenção de aplicação de um TCLE específico para a nova pesquisa, quando fundamentada a impossibilidade de obtenção do consentimento, cabendo ao CEP autorizar ou não a utilização do material biológico humano armazenado.
Sendo assim, este estudo foi submetido e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisas envolvendo Seres Humanos do Centro de Pesquisa em Medicina Tropical (CEP/CEPEM), sob nº do CAAE: 04573812.8.0000.0011 e Parecer consubstanciado nº 77565 (ANEXO II).
3.4 CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA
Todas as 117 amostras identificadas como EPEC típica ou atípica que estavam armazenadas no laboratório de microbiologia do CEPEM foram semeadas em placa contendo Ágar MacConkey (MC) para isolamento das colônias de Escherichia coli, e em seguida foram incubadas em estufa bacteriológica a 37ºC por um período de 16 a 24 horas. Tal procedimento foi realizado para se verificar as características morfológicas das colônias, tais como o aspecto da colônia, a coloração (rosa ou incolor) e o odor, e também para se verificar se as amostras estavam puras (sem a presença de algum agente contaminante ou outra espécie de bactéria).
Nos casos de dúvida em relação a morfologia das colônias, foram realizados testes bioquímicos de fermentação da lactose e glicose, produção de gás e ácido sulfídrico (Kingler
Hajna), uréia, indol, lisina, arginina, ornitina, manitol (mobilidade) e citrato, para identificação do agente bacteriano.
3.5 ENSAIO DE ADESÃO EM CÉLULA (CITOADERÊNCIA)
Após essa etapa de caracterização fenotípica inicial, os isolados de EPEC típica e atípica foram submetidos a testes de adesão em células HEp-2, originárias de carcinoma de laringe humana, de acordo com a técnica descrita por Cravioto et al., (1979) com adaptações, a fim de se obter o perfil de aderência de cada isolado (AL, ALL, AD e AA).
Para realização dos ensaios de citoaderência, células HEp-2 foram previamente cultivadas em garrafas de plástico para cultura celular de 25 cm2, contendo 3 ml de Meio Mínimo Essencial de Eagle modificado por Dulbeco (DMEM), acrescido de 10% Soro Fetal Bovino (SFB) e Gentamicina (1:1000). Em seguida, os frascos de cultura celular foram incubados em estufa de CO2 (SANYO CO2 INCUBATOR), a uma temperatura de 37ºC e atmosfera de 5% de CO2, por cerca de três a quatro dias. Após esse período, as células foram cultivadas em placas de cultura de células de fundo chato de 24 poços contendo lamínulas circulares de vidro (espessura 0,13 - 0,16mm – VIDROBRAS) que foram previamente adicionados aos poços.
Para realização do cultivo celular nas placas de 24 poços, os frascos de plásticos contendo as células HEp-2 foram retirados da estufa de CO2 e o meio de cultivo foi removido. Logo após, a monocamada celular foi lavada com 1ml de meio incompleto (DMEM) e em seguida removido. Posteriormente, foram adicionados 500µl de tripsina EDTA para o desprendimento celular e logo após foi realizada a incubação em estufa de CO2 por um período de 5 a 10 minutos.
Após incubação, as células foram retiradas da garrafa e colocadas em um tubo falcon (15 ml) juntamente com 5 ml de meio incompleto, para posterior centrifugação a uma rotação de 1.000 a 2.000 rpm por um período de 5 minutos. Em seguida, o sobrenadante foi desprezado e 5 ml de meio completo (DMEM + SFB 10%) foram adicionados ao pellet e homogeneizado com o auxílio de um vortex. Após essa etapa, cerca de 10µl desta suspensão foram retirados e colocados em câmera de Neubauer para contagem das células em microscópio óptico de campo claro, tal procedimento foi necessário para se obter uma suspensão contendo 105 (100.000) células por ml em uma quantidade apropriada de meio completo.
Em seguida, alíquotas de 1ml dessa ressuspensão celular foram distribuídas nos poços contendo as lamínulas, e as placas foram incubados em estufa de CO2 a 37º C, sob atmosfera de 5% de CO2, por 48 horas.
Após um período 24 horas de incubação das células, as amostras de EPEC e os controles foram semeados em 4 ml de Caldo LB e incubados a 37ºC em estufa bacteriológica por um período de 18 a 24 horas, para sua posterior utilização no teste de adesão em célula. Como controle positivo do teste de adesão, foram utilizados uma cepa padrão de EPEC típica (E2348/69), uma de EPEC atípica (2103) e uma de EAEC O42, e para controle negativo foi utilizado uma bactéria não aderente DH10B (Escherichia coli K-12), além de ter sido reservado uma lamínula contendo células HEp-2 sem bactérias.
Para realização do teste de citoaderência, as placas de 24 poços contendo as células HEp-2 que estavam incubadas em estufa de CO2,foram inicialmente retiradas da estufa, e em seguida o meio de cultivo foi retirado de cada orifício da placa, e três lavagens com PBS foram realizadas.
Posteriormente, 1ml de DMEM acrescido de 2% de SFB e 2% de D-manose foram adicionados em cada poço. Após essa etapa, 40µl de caldo LB, contendo as bactérias de interesse no estudo, foram acrescentados nos orifícios e logo em seguida as placas foram incubadas em estufa de CO2 durante um período de 3 horas e 6 horas (OBS: Sempre que o teste de citoaderência foi realizado, duas placas de 24 poços foram incubadas simultaneamente, sendo uma para o ensaio de 3 horas e outra para o ensaio de 6 horas, visto que as cepas de EPEC típica apresentam um perfil de aderência localizada em 3 horas de incubação e as cepas de EPEC atípica apresentam um padrão de aderência localizada like em 6 horas).
Após o período de incubação de 3 e 6 horas, o meio de cultivo foi removido e a monocamada celular foi lavada por cinco vezes com PBS, a fim de se retirar as bactérias que não se aderiram às células em cultivo. Em seguida, as células foram fixadas com uma solução fixadora contendo àcido pícrico 1,22%, formaldeído 40% e ácido acético glacial por um período de 10 minutos.
Posteriormente, as células foram coradas com soluções INSTANT PROV II e III do Kit de coloração Panótico Rápido (INSTANT PROV NEWPROV) por um minuto. Decorrido esse tempo, os poços submetidos a coloração foram lavados com água de torneira (de três a cinco vezes, para retirada do excesso de corante) e as lamínulas foram retiradas dos orifícios das placas e deixadas a temperatura ambiente para secagem. Após isso, as lamínulas foram
coladas em lâminas de ponta fosca com um esmalte incolor e visualizadas ao microscópio óptico de campo claro, com os aumentos de 400 e 1000 vezes.
Para interpretação dos resultados observados nas lâminas, foram considerados os seguintes padrões de adesão: AL, caracterizada pela formação de microcolônias de bactérias aderidas a sítios localizados da célula; AD, com bactérias aderidas ao acaso, por toda a superfície celular; AA, quando as bactérias se aderem sobre a célula e nos espaços intercelulares, lembrando a disposição de tijolos empilhados (“stacked bricks”); ALL, quando as bactérias formam apenas microcolônias bacterianas soltas, que são detectados apenas depois de ensaios de adesão prolongados, ou seja, após 6 horas de incubação.
3.6 DETECÇÃO DE BIOFILME POR ESPECTROFOTOMETRIA
Além da realização de testes de adesão em células HEp-2, as cepas de EPEC também foram testadas quanto a capacidade de formação de biofilme. Para isso, as amostras e o controle positivo (EAEC O42) foram previamente cultivados em 4 ml de caldo LB e incubados em estufa bacteriológica a 35ºC durante o período de 18 a 24 horas.
Após esse período de incubação, as amostras foram retiradas da estufa e uma alíquota contendo cerca de 75µl do caldo LB com a bactéria foi retirada e diluída em solução salina (soro fisiológico) para obtenção de uma escala de turbidez equivalente a 0,5 Mac Farland (LABORCLIN), a qual corresponde a aproximadamente 1,5x108 unidades formadoras de colônias (UFCs). Posteriormente, 1µl desta solução na escala de 0,5 Mac Farland, foi retirado e colocado em 1,5 ml de caldo LB estéril, com a finalidade de obter uma concentração aproximada de 100.000 UFC/ml.
Em seguida, 200 µl desta solução foi distribuída nos poços de uma microplaca de 96 poços (fundo reto), em triplicata para cada amostra, inclusive para o controle positivo (EAEC O42) e para o controle negativo (ao qual foi utilizado o caldo LB sem a bactéria). Também foi feito o espelho da microplaca, a fim de se obter a informação correta quanto a localização das amostras. Posteriormente, a microplaca foi incubada em estufa bacteriológica a 35ºC por um período de 18 a 24 horas.
Após o período de incubação, a microplaca foi retirada da estufa e o conteúdo de cada poço foi retirado e lavado 4 vezes com 200 µl de PBS (OBS: após cada lavagem, a microplaca foi levada ao agitador Kline por um período de 1 a 2 minutos). Posteriormente, a microplaca foi incubada em estufa bacteriológica a 60ºC por 1 hora para secagem. Logo após esse
