Determinação da Concentração Inibitória Mínima

Após a inoculação, as placas de microdiluição foram incubadas a 37ºC e a leitura foi realizada em 24, 48 e 72 horas respectivamente. O ponto final da concentração inibitória mínima foi determinado nas leituras de 48 e 72 horas. O crescimento em cada poço foi determinado numa escala de turvação: Escala 0 – ausência de crescimento nos poços.

Escala 1 – Leve turbidez quando comparado com o controle positivo.

Escala 2 – Proeminente decréscimo na turbidez quando comparado com o controle positivo (aproximadamente 50% de inibição).

Escala 3 – Leve redução na turbidez quando comparado com o controle positivo (aproximadamente 90% de inibição).

Escala 4 – Não há redução na turbidez quando comparado com o controle livre da droga.

Para os agentes azólicos e 5-Fluorocitosina a concentração inibitória mínima (CIM) é definida como a concentração mais baixa da droga com ligeira turbidez (escala 1). Já para Anfotericina B a CIM é considerada a mais baixa concentração que se apresente totalmente clara (escala 0).

5.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO

Este trabalho foi realizado em duas etapas. A primeira realizada com os seguintes antifúngicos: AMB – anfotericina B; TER – Terbinafrina, Flu – Fluconazol, ITRA – Itraconazol e 5-FC – 5-fluorocitosina. E a segunda com terbinafrina, 5-fluorocitosina e alguns antifúngicos da classe dos azólicos, como MICO – Miconazol e CETO – Cetoconazol.

Espécie testada MIC 50% (mg/mL ou µg/µL) MIC 90% (mg/mL ou µg/µL)

Drogas antifúngicas testadas 48h 72h 48h 72h

Cryptococcus neoformans 1 Anfotericina B 0,243 0,4875 0,4875 0.97 Terbinafrina <=0,24 0,243 <=0,24 0.24 5-Fluorocitosina <=0,24 0,243 1,95 3.91 Fluconazol 1,95 3,91 15,63 31.25 Itraconazol <= 0.24 <=0,24 <= 0.24 <= 0.24 2 Anfotericina B <= 0.24 <= 0.24 0,24 0.48 Terbinafrina 0,4875 0,975 1,95 3.91 5-Fluorocitosina 0,4875 0,975 1,95 3.91 Fluconazol 3,91 7,81 7,81 15.63 Itraconazol <=0,24 <=0,24 62,5 125 3 Anfotericina B 0,24 0,4875 0,4875 0.97 Terbinafrina 0,24 0,4875 0,4875 0.97 5-Fluorocitosina 0,24 0,4875 0,4875 0.97 Fluconazol 15,63 15,63 15,63 31.25 Itraconazol 0,4875 0,975 7,81 15.63 4 Anfotericina B 0,4875 0,975 1,95 3.91 Terbinafrina 0,24 0,4875 0,4875 0,975 5-Fluorocitosina 0,4875 0,975 31,25 62.5 Fluconazol 3,91 7,81 7,81 15.63

TABELA 2 – Concentração Inibitória Mínima (CIM) dos antifúngicos testados frente aos isolados clínicos de Cryptococcus neoformans em Sergipe.

5 Anfotericina B 0,4875 0,975 3,91 7.81 Terbinafrina <= 0.24 0,243 0,4875 0.97 5-Fluorocitosina <= 0.24 0,4875 1,95 3.91 Fluconazol 7,81 7,81 7,81 15.63 Itraconazol 1,95 3,91 62,5 125 6 Anfotericina B <= 0.24 0,4875 1,95 3.91 Terbinafrina 0,4875 0,975 1,95 3.91 5-Fluorocitosina 1,95 3,91 7,81 15.63 Fluconazol 1,95 3,91 3,91 7,81 Itraconazol 0,4875 0,975 62,5 125 7 Anfotericina B 0,4875 0,975 1,95 3.91 Terbinafrina 0,4875 0,975 1,95 3.91 5-Fluorocitosina 0,4875 0,975 1,95 3.91 Fluconazol 3,91 7,81 15,63 31.25 Itraconazol <=0,243 <=0,243 62,5 125 8 Anfotericina B 0,24 0,4875 3,91 7.81 Terbinafrina <=0,243 0,4875 1,95 3.91 5-Fluorocitosina 0,24 0,4875 1,95 3.91 Fluconazol 1,95 3,91 7,81 15.63 Itraconazol <=0,243 0,975 62,5 125 9 Anfotericina B 31,25 5,26 62,5 521 Terbinafrina 31,25 5,26 62,5 521 5-Fluorocitosina 0,4875 0,975 125 052

Fluconazol 62,5 62,5 125 125 Itraconazol 62,5 62,5 125 125 10 Anfotericina B 3,91 7,81 7,81 15,63 Fluconazol 0,243 0,4875 7,81 15,63 Itraconazol <=0,243 0,4875 1,95 3,91 Miconazol <=0,243 0,4875 15,63 31,25 Cetoconazol 0,243 0,4875 7,81 15,63 11 Anfotericina B 15,63 31,25 31,25 62,5 Fluconazol 62,5 125 125 250 Itraconazol 0,24 0,4875 0,4875 0,975 Miconazol 1,95 3,91 3,91 7,81 Cetoconazol 3,91 7,81 7,81 15,63 12 Anfotericina B 7,81 15,63 15,63 31,25 Fluconazol 0,975 1,95 1,95 3,91 Itraconazol 3,61 7,81 7,81 15,63 Miconazol 0,975 1,95 1,95 3,91 Cetoconazol 0,975 1,95 1,95 3,91 13 Anfotericina B 3,91 7,81 7,81 15,63 Fluconazol 0,975 1,95 1,95 3,91 Itraconazol 0,24 0,4875 0,4875 0,975 Miconazol 0,975 1,95 1,95 3,91 Cetoconazol 0,24 0,4875 0,4875 0,975 ATCC 32608 Anfotericina B 0,243 342,0 0,243 0,48 Terbinafrina 0,243 0,4875 1,95 3,91 5-Fluorocitosina 0,243 342,0 15,63 31,25

Fluconazol 15,63 31,25 31,25 62,5 Itraconazol 3,91 7,81 7,81 15,63

Na Tabela 02 é demonstrado que as amostras de Cryptococcus

neoformans apresentam alto valor de concentração inibitória mínima,

principalmente na CIM 90%, para anfotericina B. Esses resultados evidenciam a alta resistência destas cepas clinicas para justamente à droga de escolha no combate a criptococose.

Vale destacar que a amostra nove apresenta resistência a todos os antifúngicos não azólicos (MIC >250µg/µL).

Esses dados corroboram aqueles obtidos por Soares et al (2003) que registraram alta atividade da terbinafrina contra o fungo, embora em concentrações maiores em comparação àquelas requeridas pelos azólicos em geral.

Observa-se na Tabela 02 uma resistência dose dependente para os agentes azólicos, principalmente para o fluconazol. Este antifúngico é usado em conjunto com a anfotericina B para pacientes imunodeprimidos ou que sofrem com os efeitos da anfotericina B.

De acordo com o NCCLS (2002) os agentes antifúngicos podem ser considerados como agente fungicida ou fungistático. Para a anfotericina B, quando os valores de MIC detectados no teste enquadram o agente somente como sensível ou resistente, infere-se que a ação da anfotericina B é fungicida. Quando agindo como fungistático, podem ser encontrados valores que caracterizam a sensibilidade dose dependente. Para este antifúngico uma cepa é considerada sensível quando apresenta valores de CIM ≥ 1µg/mL. Enquanto que para ser considerada uma cepa resistente deve apresentar valores de CIM

Para o fluconazol, uma cepa considerada sensível (S) deve apresentar um CIM ≤ 8µg/mL; sensível dose dependente (SDD) entre 16 e 32µg/mL e resistentes (R) valores ≥ 64µg/mL. Para itraconazol, CIM ≤ 0,125µg/mL caracteriza as cepas sensíveis (S), entre 0,25 e 0,5µg/mL caracteriza a sensibilidade dose dependente (SDD) e valores ≥ 1µg/mL caracterizam as cepas resistentes (R). Para o cetoconazol o NCCLS não especifica valores de sensibilidade e resistência e apenas indica que as concentrações inibitórias mínimas variam entre 0,03 e 16µg/mL.

Para a 5-fluorocitosina as cepas são consideradas sensíveis (S) quando apresentam valores ≤ 4µg/mL; para esse grupo de fármacos não existem valores de sensibilidade dose dependente, mas sim valores intermediários (I) que está entre 8 e 16µg/mL. A cepa é considerada resistente (R) quando apresenta valores ≥ 32µg/mL.

De acordo com os resultados obtidos neste trabalho e comparando-se com o padrão de valores sugerido pelo documento NCCLS M27-A2 (2002), as amostras um, dois e três apresentaram sensibilidade para a anfotericina B. Já o restante das amostras (77%) apresentou valores que as caracterizam como cepas resistentes. Para a 5-fluorocitosina nenhuma amostra apresentou valores resistentes, apenas as amostras cinco e seis apresentaram valores intermediários.

Para os azólicos, as amostras nove e 11 apresentaram resistência ao fluconazol porem, 77% das amostras restantes, com exceção apenas da amostra seis (variedade gatti), apresentaram valores relacionados à sensibilidade dose dependente, o que configura um aspecto preocupante na utilização desta droga. Este resultado reforça o comportamento diferenciado e mais virulento relacionado à variedade gatii como afirmaram Speed et al (1995) e Peach et al (1998). Peetermans et al (1993) relataram a ocorrência de

Os valores obtidos para itraconazol causam preocupação, já que nenhuma das amostras analisadas apresentou valores relacionados aos padrões de sensibilidade. Apenas as amostras um, 11 e 13 apresentaram sensibilidade dose dependente. O restante das amostras (77%) apresentou valores que as classificam como resistentes. Com relação ao cetoconazol todas as amostras analisadas foram consideradas sensíveis, dose dependente.

Anfotericina B e outros poliênicos agem ligando-se ao ergosterol da membrana celular do fungo inibindo conseqüentemente a formação das enzimas da biossíntese do ergosterol, a citocromo P-450 dependente e a 14α esterol dimetilase (P450-DM). Quando cepas apresentam resistência a anfotericina B isso se deve a alterações na biossíntese dos lipídeos de membrana como também a interrupção dos fosfolipídios da membrana plasmática (DICK et al., 1980).

Já os azólicos atuam exclusivamente na inibição da P450-DM que resulta na inibição do ergosterol e aumento na concentração da 24 α metil esterol causando grande inibição na formação das células fúngicas. Como também nos poliênicos, um mecanismo comum de resistência é a mudança na composição do esterol nas membranas da célula fúngica (HITCHCOCK, 1993).

Kerridge et al (1990) afirmaram que a existência de cepas resistentes a anfotericina B está relacionada com o tratamento prévio com derivados azólicos que afeta a membrana celular (redução da síntese do ergosterol) podendo provocar a seleção de mutantes.

Joseph-Horne et al (1996) reportaram poucos casos de resistência a anfotericina B na era SIDA. Enquanto que Orni-Wasserlauf et al (1999) relataram que cepas fluconazol resistentes isoladas de pacientes imunodeprimidos ocorrem de forma mais comum, o que serve de alerta já que em pacientes com SIDA esta droga tem sido combinada com a anfotericina B.

Isolados do Rio Grande do Sul demonstraram pouca susceptibilidade aos antifúngicos com valores baixos de CIM (VAINSTEIM et al., 2001), enquanto resultados obtidos por Fraznot et al., (2001) com isolados de Minas Gerais sugeriram uma certa resistência aos azólicos em especial ao fluconazol.

Em outros isolados de Minas Gerais (MORAES et al., 2003), foi detectada grande ocorrência de amostras com resistência dose dependente além de variabilidade nas leituras de 24 e 48 horas. Esses dados foram também registrados neste trabalho e reforça a idéia de que os testes ainda estão em fase de padronização. O documento NCCLS M 27-A (2002) indicou uma leitura máxima em 72 horas.

Em um trabalho realizado por Diaz et al. (2003) com amostras de São Paulo, registrou perfil de sensibilidade diferenciado: ocorrência de resistência apresentada por um isolado ambiental frente a 5- Fluorocitosina, um isolado clínico frente ao Fluconazol, um isolado ambiental frente ao Voriconazol, dois isolados ambientais e um isolado clínico frente a Anfotericina B.

Armengou et al (1996) citaram altas taxas de CIM para os azólicos, em especial para o fluconazol, fato que tem sido associado à falta de resposta do fluconazol em pacientes imunodeprimidos. Devido a isso novos agentes triazólicos tem sido pesquisado como voriconazol e posaconazol além da utilização de anfotericina B combinada com outros produtos como substancias lipossolúvel (Viviane et al., 1998). Nesse sentido, Pfaller et al (1999) apresentaram as maiores taxas de resistência de Cryptococcus neoformans, 12 a 40%.

Yamazumi et al (2003) sugeriram a existência de clones heteroresistentes, fruto de uma seleção rápida de fenótipos resistentes sob exposição ao fluconazol. Isso reforça a necessidade do desenvolvimento de

determinação de clones heteroresistentes de Cryptococcus neoformans frente aos agentes antifúngicos.

Silveira et al (2004) ressaltaram a relação existente entre melanização e baixa susceptibilidade de Cryptococcus neoformans, principalmente frente a anfotericina B. Segundo esses autores ocorre uma taxa maior de sobrevivência de cepas produtora de colônias melanizadas. In vitro a melanização foi associado com a resistência microbiana, esse efeito acontece devido à oxidação do sistema imunológico do hospedeiro alterando a composição dos peptídeos microbicidas e principalmente ao agente antifúngico anfotericina B (CASADEVALL, 2000).

Dados apresentados por Revankara et al (2004) evidenciaram a relação entre o gene ERG11 e a resistência aos agentes azólicos mostrando que a regulação desse gene caracteriza um perfil resistente de Cryptococcus

neoformans frente aos agentes azólicos. Esses autores ainda não obtiveram

resultados que confirmem a mesma relação com os novos azólicos.

Estes resultados sugerem que se faz necessário ampliar as opções de técnicas disponíveis para a determinação da resistência antimicrobiana de

Cryptococcus neoformans pela associação da determinação da CIM, com

outros métodos como o E – TEST e através da identificação e seqüenciamento de genes de resistência. Com dados seguros acerca do perfil de sensibilidade e resistência, associados ao conhecimento dos genes envolvidos, será possível realizar um estudo epidemiológico de qualidade e assim, elucidar a dinâmica local da relação ambiente-fungo-paciente.

5.4 CONCLUSÃO

Os isolados clínicos de Cryptococcus neoformans isolados no Estado de Sergipe apresentaram valores altos de concentração inibitória mínima – CIM para os agentes antifúngicos testados, o que simboliza alta taxa de resistência principalmente a Anfotericina B e ao Fluconazol, dado que pode ser correlacionado com os dados clínicos.

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CAPÍTULO 04

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