ANTONIO MARCIO BARBOSA JUNIOR
CARACTERIZAÇÃO DAS AMOSTRAS CLÍNICAS DE
Cryptococcus neoformans ISOLADOS EM SERGIPE
NO PERÍODO DE 2001 A 2004
São Cristóvão
Núcleo de Pós Graduação em Medicina – UFS
2005
ANTONIO MARCIO BARBOSA JUNIOR
CARACTERIZAÇÃO DAS AMOSTRAS CLÍNICAS DE
Cryptococcus neoformans ISOLADOS EM SERGIPE
NO PERÍODO DE 2001 A 2004
Dissertação apresentada à Coordenação do Curso
de Mestrado em Ciências da Saúde da
Universidade Federal de Sergipe, como requisito
para obtenção do titulo de Mestre em Ciências da
Saúde.
Área de Concentração: Microbiologia.
Orientadora: Prof. Dra. Rita de Cássia Trindade
ABRIL
2005
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE
Barbosa Junior, Antonio Marcio.
B238c Caracterização das amostras clínicas de Cryptococcus neoformans isolados no estado de Sergipe no período de 2001 a 2004 / Antonio Marcio Barbosa Junior – São Cristóvão, 2005.
77 f. : il.
Dissertação (Mestrado em Ciências da Saúde) – Núcleo de Pós Graduação em Medicina, Pró-Reitoria de Pós-Graduação e Pesquisa, Universidade Federal de Sergipe.
Orientadora: Prof. Drª Rita de Cássia Trindade.
1. Microbiologia médica. 2. Cryptococcus neoformans – Teste de sensibilidade. 3. Epidemiologia - Meningite. 4. Saúde pública – Sergipe. 5. Cryptococcus gattii. I. Título.
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE – UFS
NÚCLEO EM PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA - NPGMED
MESTRADO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
CARACTERIZAÇÃO DAS AMOSTRAS CLÍNICAS DE
Cryptococcus neoformans ISOLADOS EM SERGIPE NO
PERÍODO DE 2001 A 2004
ANTONIO MARCIO BARBOSA JUNIOR
DISSERTAÇÃO DEFENDIDA EM ___ DE ___ DE 2005.
APROVADA PELA BANCA EXAMINADORA EM __/__/__/ NOTA _____
CONSTITUÍDA PELOS PROFESSORES:
______________________________________
Profa. Dra. Rita de Cássia Trindade
Departamento de Morfologia – Universidade Federal de Sergipe
_______________________________________________
Profa. Dra. Cláudia Maffei
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo
______________________________________
Prof Dr. Cristiano Barros de Melo
Departamento de Engenharia Agronômica – Universidade Federal de
Sergipe
Dedico este trabalho a Deus, a
minha família e todos aqueles que
me ajudaram e me deram força para
executa-lo.
AGRADECIMENTOS ESPECIAIS
Aos meus pais, Márcio e Cecília, por tudo aquilo que fizeram ao longo de todos esses anos através da compreensão, carinho e na ajuda me mostrando um futuro digno e sincero.
A Dângelly pela luta, carinho e no complemento para a construção da minha vida.
À Professora Rita pela orientação, confiança e amizade colocada não somente durante esse período, mas em toda a minha formação acadêmica e cientifica.
À Patrícia pelas sugestões, companheirismo e na aplicação nas minhas conquistas cientificas.
À Fátima Travália sem a sua ajuda e apoio nada disso teria se construído, muito obrigado.
À Márcia Lázera pelo auxilio e nas sugestões para a realização dessa obra alem de ter aberto as portas do seu laboratório para um curto, porem grandioso estágio.
A Eryca pelo apoio e auxilio ao longo desses anos.
Ao professor Cristiano pela participação nessa reta final e acima de tudo na visão científica apresentada e nas grandes sugestões fundamentais levantadas.
À atual equipe LMA, Diogo, Erick, Emerson, Euvaldo, Flávia, Reinalda, Camila pelas conversas e sugestões recebidas.
Aos velhos integrantes da equipe LMA, Michel, Celso, Éden, Mila, Meyline, Talita pelas dicas e ajuda recebida.
Ao grande ”brother” Rodrigo Neomed pelo auxilio e apoio além das grandes conversas realizadas nesse período.
Ao colega Francisco pelo apoio necessário na realização desse curso.
Aos meus colegas da pós-graduação Paula, Vaneska, Sergio, Alexsandro, Mônica Paixão pela convivência e apoio recebido.
Ao professor Ângelo Antoniolli e Jéferson Costa por terem participado da minha banca de exame de qualificação em que me indicaram varias sugestões que em muito me fez pensar e escrever cientificamente.
Ao Instituto Parreiras Horta por ter cedido, gentilmente, as amostras para elaboração dessa obra.
Ao Laboratório de Microbiologia Aplicada pela aplicação, execução e apoio irrestrito recebido ao longo desses anos.
Ao Laboratório de Micologia Ambiental do IPEC, em especial para Gláucia e Berna pela orientação e execução no estagio no Rio de Janeiro.
À professora Cida da UFMG pelas dicas recebidas na execução dessa dissertação.
Ao Núcleo de Medicina pela oportunidade recebida.
Á CAPES pela concessão da bolsa de pesquisa em mestrado.
SUMÁRIO
PREFÁCIO _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ xi
RESUMO GERAL _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ xiii
ABSTRACT_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ xiv
1. CAPÍTULO 1 -Introdução, revisão de literatura, objetivos e referencias bibliográficas_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 1
2. CAPÍTULO 2 – Determinação das variedades de Cryptococcus neoformans no Estado de Sergipe_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 27
3. CAPÍTULO 3 - Teste de sensibilidade de amostras clínicas de Cryptococcus
neoformans isolados do líquido cefalorraquidiano a antifúngicos _ _ _ _ 43
4. CAPÍTULO 4 - Identificação do mating type de isolados clínicos de
Cryptococcus neoformans, pela reação em cadeia da polimerase – PCR _ _ _ _
_ __ _ 62
5. CAPÍTULO 5 - Discussão inter-relacionada e perspectivas futuras _ _ 75
6. CAPÍTULO 6 - Conclusões gerais_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 77
LISTA DE FIGURAS
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 – Identificação das variedades, soropositividade para HIV das
amostras de Cryptococcus neoformans, isolados clínicos do Estado de Sergipe no período de 2001 a 2004. _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 34
TABELA 2 – Valores de Concentração Inibitória Mínima (CIM) dos antifúngicos
testados frente aos isolados clínicos de Cryptococcus neoformans no Estado de Sergipe _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 49
LISTA DE FIGURA
FIGURA 1 – Resultado da PCR para detecção do estágio sexual de
Cryptococcus neoformans isolados clínicos em Sergipe no período de 2001 a 2004, amostras de 1 a 9. _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 68
FIGURA 2 – Resultado da PCR para detecção do estágio sexual de
Cryptococcus neoformans isolados clínicos em Sergipe no período de 2001 a 2004, amostras 10 a 13 alem dos padrões. _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 69
LISTA DE SIGLAS
5-FC – 5-Fluorocitosina AM – Anfotericina B
ATCC – American Type Collection Culture
C – Carbono
CDTB – Creatinina Dextrose Timina de Azul de Bromotimol
CET – Cetoconazol
CGB – Canavanina Glicina de Azul de Bromotimol
CIM – Concentração Inibitória Mínima DMSO – Dimetilsulfóxido
DNA – Acido Desoxiribonucléico
EDTA – Ethylenediaminetetraacetic acid.
FLU – Fluconazol
HART – High HIV/Aids Response Team
HIV – Vírus da Imunodeficiência Humana
IGS – Seqüências dos Espaçadores Intergênicos
ITR – Itraconazol
LCR – Liquido Cefaloraquidiano MAT – Mating type
MIC – Minimum Inhibitory Concentration
MIZ – Miconazol
MOPS – Acido
Morfolinepropanesulfônico N – Nitrogênio
NCCLS – National Committee For Clinical Laboratory Standard
PCR – Reação em Cadeia da Polimerase
R – Resistência
RAPD – Random Amplification of Polymorphic DNA
RFLP – Restriction Fragment Length Polymorphism
RPMI – Roswell Park Memorial Institute. S – Sensibilidade SDD – Sensibilidade Dose Dependente SDS – Dodecilsulfato de sódio. SIDA – Síndrome da Imunodeficiência Adquirida
SNC – Sistema Nervoso Central TER – Terbinafrina
UFC – Unidades Formadoras de Colônias
PREFÁCIO
CAPÍTULO 1 -Introdução, revisão de literatura, objetivos e referências
bibliográficas.
Neste capitulo foi realizada uma introdução geral sobre o tema proposto finalizando com a justifica para a realização dessa dissertação. Logo em seguida, foi realizada uma revisão da literatura com alguns tópicos: taxonomia, aspecto clinico, variedades do microrganismo, características bioquímicas, fisiológicas e fatores de virulência, características epidemiológicas, ecológicas,
mating type e sensibilidade aos antifúngicos. E por fim, foram apresentados os
objetivos dessa dissertação de mestrado.
CAPÍTULO 2 - Determinação das variedades de Cryptococcus neoformans no
Estado de Sergipe.
Foi estudada a ocorrência das variedades de Cryptococcus neoformans isolados clínicos mais freqüentes em Sergipe no período estudado correlacionando com outros estados e paises.
Este capítulo, assim como os dois seguintes, foram elaborados em forma de artigo. Esse modelo foi composto por uma breve introdução, materiais e o método trabalhado, os resultados e discussão (quadros, tabelas e figuras foram inseridos no texto) e por fim as conclusões. Vale ressaltar que cada referencia bibliográfica correspondente foi colocada no final de cada capitulo.
CAPÍTULO 3 - Teste de sensibilidade de amostras clínicas de Cryptococcus
neoformans isolados do líquido cefalorraquidiano a antifúngicos.
Neste capitulo foram determinadas às concentrações inibitórias mínimas frente aos antifúngicos estudados baseados no documento M-27 da NCCLS. Onde foi discutido o comportamento dos microrganismos no perfil de
sensibilidade, como mérito de informação, esse experimento seguindo as recomendações padronizadas foi o primeiro realizado em Sergipe.
CAPÍTULO 4 - Identificação do mating type de isolados clínicos de
Cryptococcus neoformans, pela reação em cadeia da polimerase – PCR
Foi identificado e analisado o tipo sexual ou mating type sexual dos isolados clínicos de Cryptococcus neoformans em Sergipe. Usou-se a reação em cadeia da polimerase com primers específicos após utilização de técnicas para extração de DNA de leveduras modificada para a levedura em questão. Poucos trabalhos são citados para a analise do mating type sexual de
Cryptococcus neoformans o que torna esses resultados de fundamental
importância na literatura.
CAPÍTULO 5 - Discussão inter-relacionada e perspectivas futuras
Neste capitulo foi colocado uma síntese correlacionando os resultados obtidos nos capítulos 2, 3 e 4. Apresentando de forma integrada as informações obtidas.
CAPÍTULO 6 - Conclusões gerais
E por fim foram colocadas as conclusões gerais obtidas após as analises experimentais respondendo assim o que foi proposto nos objetivos.
CAPÍTULO 7 – Referências bibliográficas geral
Nesse capítulo são apresentadas as referências bibliográficas da dissertação de mestrado.
RESUMO GERAL
Cryptococcus neoformans é um fungo oportunista que desencadeia meningite
tanto em pacientes imunocompetentes como em pacientes hígidos Este trabalho teve como objetivo estudar as variedades (neoformans e gattii) de
Cryptococcus neoformans isolados no Estado de Sergipe a partir do LCR de
pacientes com meningite infecciosa. Também teve como objetivo determinar a sensibilidade de C. neoformans variedade neoformans e variedade gattii, isolados do líquor de pacientes com meningite infecciosa no Estado de Sergipe, através do método de microdiluição (NCCLS) e determinar o mating
type de isolados clínicos de Cryptococcus neoformans através da Reação em
Cadeia da DNA Polimerase em Sergipe. Foram utilizadas amostras do LCR que deram entrada no IPH/LACEN/SE no período de 2001 a 2004. Foi realizada microscopia direta através da coloração com Tinta Nanquim. Uma alíquota do líquor foi transferida para tubos contendo Agar Sabouraud com clorafenicol e incubado em temperatura ambiente 25ºC e a 37ºC.Foram realizadas provas para identificação presuntiva, fenotípica em meio Níger e das variedades em meio CGB. No período analisado, apenas uma amostra apresentou características fenotípicas em meio Níger diferenciada das outras. Do total de 15 amostras analisadas em meio CGB, 02 amostras (13,33%) se apresentaram positiva, ou seja, foram identificadas como variedade gattii, sendo uma delas isolada de paciente soronegativo para HIV (paciente não aidético). As outras 13 amostras (86,67%) apresentaram CGB negativo, ou seja, foram identificadas como variedade neoformans. A maioria das amostras de Cryptococcus neoformans isolados do líquor de pacientes com meningite infecciosa são da variedade neoformans em Sergipe. Para a realização do teste de sensibilidade foram utilizadas duas amostras de C. neoformans variedade gattii e 11 de C. neoformans variedade neoformans listadas acima. Para controle dos testes foi utilizada a cepa padrão ATCC 32608. Em seguida foi realizada a preparação do inóculo. Foram utilizados os seguintes antifúngicos: Anfotericina B, Fluconazol, Cetoconazol, Miconazol, Itraconazol, 5- Fluorocitosina e Terbinafrina. A suspensão fúngica foi ajustada numa concentração final de 0,5x10³ para 2,5x10³ UFC no meio RPMI. O experimento foi realizado em placas de microtitulação. Após a inoculação, as placas de microdiluição foram incubadas a 37ºC e lida em 24, 48 e 72 horas. O ponto final da CIM foi determinado nas leituras de 48 e 72 horas. Os isolados clínicos de C. neoformans apresentaram valores altos de CIM para os agentes antifúngicos testados, o que simboliza uma alta taxa de resistência principalmente a Anfotericina B e ao Fluconazol, dado que pode ser correlacionado com os dados clínicos. Para análise do mating type sexual foram utilizadas 13 amostras de C. neoformans a partir do líquor de pacientes com meningite infecciosa em Sergipe durante o período de 2001 e 2004. Os procedimentos laboratoriais relacionados à biologia molecular seguiram como referência Chatuverdi et al. (2000). Todas as amostras de C. neoformans tanto aquelas pertencentes à variedade neoformans como gattii são matting type a, considerado de maior virulência.
ABSTRACT
Cryptococcus neoformans is one yeast opportunist that it unchains meningitis in
imunocompetentes patients in such a way as in patients This work had as objective to study the varieties (neoformans and gattii) of isolated C.neoformans in the State of Sergipe from the liquor liquid of patients with infectious miningitis. Also had as objective to determine the sensitivity of C. neoformans variety
neoformans and variety gattii, isolated of the líquor of patients with infectious
meningite in the State of Sergipe, through the microdilution method (NCCLS) and to determine the sexual type - mating type of isolated physicians of Cryptococcus neoformans through the Reaction in Chain of DNA Polimerase (PCR) in Sergipe. Samples of the LCR had been used that had given entered in the IPH/LACEN/SE in the period of 2001 the 2004. Direct microscopy through the coloration with Nanquim Ink was carried through. An aliquot one of the líquor (0,1mL) was transferred to pipes contends Agar Sabouraud with clorafenicol and incubado in ambient temperature 25ºC and 37ºC. Tests for presumptive, fenotípica identification had been carried through in half Níger and of the varieties in half CGB. In the analyzed period, only one sample presented fenotípicas characteristics in half Níger differentiated of the others. Of the total of 15 samples analyzed in half CGB, 02 samples (13,33%) if had presented positive, or either, had been identified as variety gattii, being one of them isolated one of soronegativo patient for HIV (patient not aidético). The others 13 samples (86,67%) had presented negative CGB, or either, they had been identified as variety neoformans. The majority of the isolated samples of
Cryptococcus neoformans of the líquor of patients with infectious meningite is of
the variety neoformans in Sergipe. For the accomplishment of the sensitivity test variety had been used two samples of C. neoformans var. gattii and 11 of C. neoformans listed variety neoformans above. For control of the tests standard ATCC 32608 was used. After that suspension of fúngicas cells. The following antifungal had been used: Anphotericin B, Fluconazol, Cetoconazol, Miconazol, Itraconazol, 5- Fluorocitosina and Terbinafrina. The fungal suspension was adjusted in a final concentration of 0,5x10³ for 2,5x10³ UFC in the half RPMI. The experiment was carried through in microtitulação plates. After the inoculation, the microdilution plates had been incubadas 37ºC and deal in 24, 48 and 72 hours. The end point of the CIM was determined in the readings of 48 and 72 hours. The isolated physicians of C. neoformans had presented high values of CIM for the antifungal agents tested, what he mainly symbolizes one high tax of resistance Anfotericina B and to the Fluconazol, given that he can be correlated with the clinical data. For analysis of mating type sexual of C. neoformans from the líquor of patients with infectious meningite in Sergipe during the period of 2001 and 2004 had been used 13 samples. The related laboratoriais procedures to molecular biology (extration of DNA and accomplishment of the PCR) had followed as Chatuverdi reference et al. (2000). All the samples of C.neoformans tested, as much that pertaining to the variety neoformans as gattii are matting type, considered of bigger virulence.
1 INTRODUÇÃO
O Reino Fungi é extremamente diversificado e estima-se que existem mais de 100.000 espécies de fungos descritas. Destas, cerca de 150 espécies são reconhecidas como patógenos humanos e veterinários (KWON-CHUNG; BENNETT, 1992). Dados mais recentes mostraram que estes números são ainda mais expressivos, 200.000 espécies de fungos identificados e caracterizados estando aproximadamente 200 espécies associadas às infecções (SIDRIN; MOREIRA, 1999).
Os fungos são decompositores de organismos mortos e/ou seus produtos (sapróbios ou saprótropos), além disto parasitam seres vivos e apresentam como característica a ausência de clorofila (ARENAS, 1994). Podem ser encontrados em vários habitats, tendo uma distribuição ubiquitária na natureza, onde elaboram processos de síntese e decomposição (MIDGLEY
et al., 1996). As espécies sapróbias são bem adaptadas às diversas condições
ambientais, e, em alguns casos, podem ser encontrados em ambientes com pouca exigência nutricional.
Dentre as espécies de fungos que se relacionam com os seres vivos podem ser identificados alguns patógenos que apresentam invasidade e multiplicação em tecidos nos hospedeiros e podem ser integrantes da microbiota normal deste hospedeiro (SEVERO; LONDERO, 1996).
Os fungos patogênicos causam inúmeras doenças de localização: superficial, cutânea, subcutânea ou sistêmica, com caráter oportunista ou causando patogenia em hospedeiro hígido (KWON-CHUNG; BENNETT, 1992). A freqüência de patogenia por esses microrganismos pode ser favorecida na presença de fatores predisponentes (como por exemplo: Síndrome da imunodeficiência adquirida (SIDA), diabetes, uso de corticóides, leucemias, tumores, antibioticoterapia etc) que colaboram com alteração do mecanismo de defesa do hospedeiro. Porém, somente a existência destes fatores não
determina necessariamente um aumento na freqüência de infecção, pois esta depende da exposição ao agente infectante (MIDGLEY et al., 1996).
Durante o processo de invasão no hospedeiro humano, os fungos patógenos elaboram diversos produtos de expressão para escape dos mecanismos de defesa do hospedeiro como: produção de cápsulas polissacarídeas ou mucopolissacarídeas, elaboração de produtos na parede celular, síntese de melanina etc, contribuindo assim para sua multiplicação nos tecidos (MIDGLEY et al., 1996). Esses processos invasivos tornam-se mais eficazes quando relacionados a indivíduos imunocomprometidos, caracterizando uma infecção oportunista. Os fungos “oportunistas” têm tido destaque em estudos biomédicos devido a crescente freqüência nos últimos anos, tanto no Brasil como no mundo.
Nesse universo insere-se a criptococose, micose oportunista causada pelo Cryptococcus neoformans (Sanfelice) Vuillemin, 1901 e suas variedades
gattii e neoformans. As variedades da espécie C. neoformans apresentam
características muito distintas entre si (fisiológicas, bioquímicas, epidemiológicas, genéticas, ecológicas, espectro clinico e patogenicidade) e isso suscitou o interesse na realização do presente trabalho, que busca aprofundar o conhecimento acerca de C. neoformans em Sergipe pela caracterização de algumas amostras clínicas e assim disponibilizar dados para a Rede Nacional de Criptococcias, além de fornecer informações sobre a meningite criptocócicas, patogenia que ocorre de forma oportunista e/ou endêmica na Região Nordeste do Brasil.
Esta dissertação está estruturada seguindo o modelo de artigos (capítulos) sendo iniciada por uma introdução e revisão de literatura sobre o tema seguindo pelos objetivos (geral e específicos). Cada objetivo específico originou um artigo, o qual foi elaborado no seguinte modelo: título do artigo, resumo, introdução, objetivo, materiais e métodos, resultados e discussão,
artigos. Na seqüência foi elaborado o tópico: resultados e discussão geral, no qual foi possível relacionar os dados obtidos nos três artigos. E por fim uma conclusão geral e as referências bibliográficas referentes aos tópicos: introdução e revisão de literatura.
2 REVISÃO DE LITERATURA 2.1 Taxonomia
São descritas 19 espécies de Cryptococcus. É sabido que o
Cryptococcus neoformans é essencialmente um agente infectante, porém
infecções causadas por outras espécies, como Cryptococcus albidus e
Cryptococcus laurentii, ocorrem em casos raríssimos (HOROWITZ et al., 1993).
A espécie está inserida no Reino Funghi; Filo Basidiomycota;
Ordem Filobasidiales;
Familia Filobasidiacea; Gênero Filobasidiella.
Dividindo-se em duas fases distintas, baseadas em diferenças nas estruturas reprodutivas, em fase teleomorfica correpondente à Filobasidiella
neoformans relacionada a variedade neoformans e Filobasidiella neoformans
correspondente a variedade bacillispora. E na fase anamorfica, definido em
Cryptococcus neoformans variedade neoformans e Cryptococcus neoformans
variedade gattii, respectivamente (CASADEVALL; PERFECT, 1998).
Sua inserção na família Filobasidiacea se deve a semelhanças na composição de ácidos graxos e características fenotípicas entre os gêneros
Cryptococcus e Tremella (SMITH et al., 1988, WICLES et al., 1996). A
aproximação taxonômica entre os gêneros Filobasidiella e Tremellaceae foi confirmada através do seqüênciamento dos genes do RNA ribossômico 16 S – like, 26 S e 5 S por CASADEVALL; Perfect (1998 b). Na fase leveduriforme (fase anamórfica), apresentam morfologia esférica de 3 a 8µm de diâmetro com presença de cápsula mucopolissacarídea espessa (1a 30µm), essa estrutura está relacionada com a invasidade e patogenicidade do fungo (BATISTA; SILVA, 1996).
2.2 Aspecto clínico
O Cryptococcus neoformans é o agente etiológico da criptococose, doença crônica ou subaguda, ocasionando manifestações cutâneas e/ou principalmente meningoencefalites (ZAITS et al., 1998).
A infecção tem seu inicio com a inalação de propágulos que se depositam nos pulmões. Para se ter uma efetiva penetração, as partículas devem ter menos de 2µm de diâmetro, tamanho inferior ao das células leveduriformes do Cryptococcus neoformans. Uma vez que os basidiósporos de Filobasidella neoformans apresentam de 1,8 a 2µm de tamanho, estão presentes em hifas aéreas e aerolizadas, e são mais resistentes à dissecação do que as células leveduriformes, acredita-se que os basidiósporos (fase teleomorfa) são mais infectantes do que as células leveduriformes (fase anamorfa) (WICLES et al., 1996).
Provavelmente um grande número de pessoas inala os basidiósporos, mas apenas uma pequena parte da população que os inalam desenvolve a doença, isso se explica pela ocorrência de uma imunidade celular íntegra que promovem uma eficiente barreira imunológica contra a colonização de
Cryptococcus neoformans (CASADEVALLL, 1994; MITCHEL et al., 1995).
Quase todas as áreas do organismo do hospedeiro podem ser atingidas, porém, os principais sítios são: pulmão, sistema nervoso central (SNC), pele, próstata e olhos (MITCHELL; PERFECT, 1995). No pulmão se apresenta nas seguintes formas: primaria e/ou regressiva – assintomáticos ou subagudos; progressiva – assintomáticos ou invasivo (como uma infecção leve ou aguda) e disseminada – acometimento de qualquer órgão, lesão cutânea e lesão no SNC (LONDERO, GONÇALVEZ, 1988).
A pneumonia criptocócica reflete uma infecção primaria, podendo regredir ou apresentar forma sub-clínica com cura sem tratamento. Já a meningoencefalite é resultante de uma disseminação secundária, sendo considerada a manifestação clinica mais comum da criptococose. Na maioria dos casos apresenta sinais e sintomas como vomito, febre, distúrbio visuais, coma, perda de memória e alteração de comportamento (RIPPON, 1988; MITCHEL; PERFECT, 1995).
Sinais específicos de infecção meníngea como rigidez da nuca, sinais meníngeos, raramente estão presentes na criptococose, por isso, a punção liquórica torna-se obrigatória em doentes com criptococose (COLLIER et al., 1998).
A doença é sempre grave principalmente com tendência à disseminação para o sistema nervoso central (SNC), sítio pelo qual o agente etiológico apresenta tropismo. Assim, o acometimento do SNC é o quadro clinico mais comum da doença, representando de 70 a 90% dos casos de criptococose (KWON-CHUNG; BENNETT, 1992; MITCHELL et al., 1995). O neurotropismo é aspecto essencial na patogênese uma vez que a mortalidade decorrente da criptococose está relacionada com a presença de meningoencefalite (CASADEVALL, 1994).
Esse neurotropismo pode estar associado na presença de substancias que servem de substratos para a fenoloxidase como a epinefrina, noraepinefrina e dopamina essenciais para a atividade cerebral existente em todo o sistema nervoso central (JACOBSON; EMERY, 1991).
Lesões hematogênicas na pele ocorrem em aproximadamente 10% dos pacientes com criptococose, principalmente em imunodeprimidos (MITCHEL; PERFECT, 1995). Uma vez que estes apresentam uma infecção diferente e mais rápido que os pacientes imunocompetentes (COLLIER et al., 1998).
2.3 Variedades
Similaridades bioquímicas, morfológicas, epidemiológicas e genéticas levam Cryptococcus neoformans ao agrupamento em quatro sorotipos e dois sorogrupos – A e D (variedade neoformans) e B e C (variedade gattii) (KWON-CHUNG; BENNETT, 1992 e MITCHELL et al., 1995). A taxa de reassociação DNA – DNA observada entre as duas variedades sugere a sua divergência gênica, indicando a ocorrência de espécies distintas e diferenciadas (AULAKH
et al., 1981).
Segundo Kwon-Chung; Bennett (1992) Cryptococcus neoformans apresenta diferenças sorológicas, sendo identificados os sorotipos A, B, C, D e AD. Estes sorotipos identificados se diferenciam através da composição antigênica da cápsula do Cryptococcus neoformans visualizado através da técnica de aglutinação em lamina utilizando kits especiais – Cryptocchek (MITCHELL; PERFECT, 1995).
Kwon-Chung (1984) citou que as duas variedades da espécie apresentaram características metabólicas, fisiológicas e epidemiológicas diferenciadas. A variedade gattii foi proposta em 1970 com base na morfologia atípica de um isolado de Cryptococcus neoformans isolado a partir de liquido cefalorraquidiano de um menino africano com meningite (CASADEVALL; PERFECT, 1998).
Uma das formas de diferenciação das variedades é através de cultivo em meios sólidos específicos como o meio Agar canavanina – glicina – azul de bromotimol (CGB) e o meio creatinina – dextrose – azul de bromotimol – timina (CDTB) (IROKANULO et al., 1995; KWON-CHUNG et al., 1982).
A capacidade de degradação da glicina em meio CGB pode ser utilizada para diferenciar a variedade gatti, sendo verificada através da mudança da cor
do meio CGB de verde para azul, resultado da reação de alcalinização pela produção de amônio (KWON-CHUNG; BENNETT, 1984, 1992). Por outro lado, na variedade neoformans não ocorre esta alcalinização do meio CGB, pois esta variedade não assimila glicina e é sensível a canavanina indicando resultado negativo. Raros isolados desta variedade, classificados como sorotipo A, podem assimilar a glicina, porém, são sensíveis à canavanina o que impede o seu crescimento (KWON-CHUNG; BENNETT, 1984, 1992).
A D-prolina é utilizada pela variedade gattii como fonte de nitrogênio (N), mas não o é pela variedade neoformans, este teste é sugerido quando há existência de resultados duvidosos, mas mesmo assim o meio CGB continua sendo a primeira e principal opção para o estudo das variedades (DUFAIT, 1987; NISHIKAWA, 1996).
2.4 Características bioquímicas, fisiológicas e fatores de virulência.
As leveduras do gênero Cryptococcus neoformans são aeróbios, apresentam assimilação de galactose, glicose, maltose e sacarose, mas, não assimilam nitrato (fonte de N) nem lactose (fonte de carbono - C); outra característica é a habilidade de crescimento à 37ºC (termotolerância) e patogenicidade para camundongo. Sintetizam fenoloxidase (presença de uma lacase) além da enzima urease em meios especiais, são sensíveis a ciclohexamida, hidrolisam peptona, uréia e creatinina e não reduzem o nitrato (KWON-CHUNG; BENNETT, 1992; MITCHELL; PERFECT, 1995).
Cryptococcus neoformans é a única espécie do gênero Cryptococcus
que produz melanina quando cultivada em meios contendo compostos fenólicos. A fenoloxidase presente realiza a hidroxilação do fenol gerando polimerização e produção de pigmento marrom – característica da melanina. A
naturais produzidos pelos seres vivos como óxido nítrico, superóxido etc (JACOBSON; EMERY, 1991).
Essa atividade bioquímica é importante na identificação de Cryptococcus
neoformans principalmente quando se utiliza meio de cultura suplementado
com sementes de níger (Guizotia abyssinica) e com concentração de glicose inferior a 0,1% (KWON-CHUNG; BENNETT; 1992; KWON-CHUNG; RHODES, 1986).
Cryptococcus neoformans apresenta vários fatores de virulência, como
cápsulas mucopolissacarídea, sintentização de melanina, termotolerância a 37ºC, além de produzir efeitos tóxicos aos hospedeiros, como a produção de proteases e manitol (KOZEL, 1995).
Os genes responsáveis pela produção da cápsula forma identificados como CAP 59, CAP 64 e CAP 60. A deleção desses genes produz cepas acapsuladas e sem virulência expressa (CHANG; KWON-CHUNG, 1988).
A presença do mucopolissacarídeo capsular associada à produção da enzima fenoloxidase – responsável pela conversão de hidrobenzóicos em melanina, e a capacidade de crescimento em 37ºC são importantes fatores envolvidos na virulência de Cryptococcus neoformans (CASADEVALLL, 1994; MITCHEL et al., 1995).
2.5 Características epidemiológicas
A variedade gattii comporta-se como patógeno primário enquanto que a variedade neoformans, como patógeno oportunista (KWON-CHUNG; BENNETT, 1992).
Entre os isolados da variedade neoformans o sorotipo A tem prevalência mundial, já o sorotipo D tem maior ocorrência na Europa ocidental (KWON-CHUNG; BENNETT, 1992; DROMER et al., 1999).
Sorrel et al (1996) classificaram o sorotipo híbrido AD como variedade neoformans, isso se deve ao resultado cruzado que acontece na técnica de aglutinação em lâmina (CryptoCheck). Já Franzot et al. (1999) sugeriram que o sorotipo A seja classificado como uma nova variedade grubbii devido as suas diferenças clínicas, epidemiológicas, moleculares e biológicas.
Com relação à variedade gattii, o sorotipo B é mais prevalente que o sorotipo C, este é mais freqüente no sul da Califórnia, nos Estados Unidos (KWON-CHUNG; BENETT, 1992).
Boekhout et al (1999) sugeriram que os quatros sorotipos de
Cryptococcus neoformans representam linhagens genéticas distintas,
identificadas pelas seqüências dos espaçadores intergênicos (IGS) do DNA ribossômico.
A criptococose não é doença de notificação compulsória, portanto não é possível estabelecer a sua prevalência real tanto no mundo como no Brasil (CASADEVALL, 1994; MINISTERIO DA SAÚDE, 2000). O Cryptococcus
neoformans é capaz de causar doença em hospedeiro imunocompetente,
porém esta não é uma ocorrência comum sendo bem mais freqüente em pacientes imunosuprimidos e/ou imunodeprimidos (CASADEVALL, 1994; LEVITZ, 1991; MITCHEL et al., 1995).
Nos casos de pacientes soropositivo para HIV – pacientes com SIDA, a meningite criptocócica é, entre as infecções micóticas, aquela responsável pelas maiores taxas de mortalidade (MITCHELL et al., 1995).
Estima-se que de cinco a 13% dos pacientes com SIDA desenvolvem a criptococose (CASADEVALL, 1994). Já no Brasil, entre 1980 e 1999, 4,5% das infecções oportunistas associadas à SIDA foram causadas pelo Cryptococcus
neoformans (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 1999).
Dados do MINISTÉRIO DA SAÚDE (1999) mostraram que em pacientes maiores de 12 anos acometidos por doenças associadas à SIDA foi verificado um aumento expressivo nos casos notificados de criptococose. No período de 1980/84, 15 casos, de 1985/87, 297 e 1988/99, 6601, totalizando 6913 casos no período de 1980 a 1999.
Já em pacientes menores de 13 anos com SIDA foram notificados, pelo Ministério da Saúde, um (01) caso entre os anos de 1983 a 1984 e oito (08) no período de 1985/87. De 1983 a 1999 foram constatados 53 casos, totalizando no período de 1983 a 1999, 62 registros (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 1999).
A ocorrência da criptococose em pacientes com SIDA no oeste europeu representa 3 a 6% dos casos relatados (KWON-CHUNG; BENNETT, 1992). Já na África Sub-saariana esse número sobe para 15 a 20% dos casos notificados (COLLIER et al., 1998).
A freqüência de casos de meningite criptocócica causada pela variedade
neoformans associada a pacientes imunocompetentes é mais expressiva
mesmo em áreas geográficas endêmicas para a variedade gattii. Embora ocorram casos raros de pacientes com SIDA infectados pela variedade gattii (LEVITZ, 1991; KWON-CHUNG; BENNETT, 1992; ROSEMBAUM et al., 1992; 1994;OLIVARES, 1997; FILIU, 2000).
Não há diferenças significativas na ocorrência com relação a raça e ocupação. Têm sido relatados casos clínicos em todas as faixas de idade, sendo mais raro em crianças. O sexo masculino e a faixa adulta (20 a 59 anos) fornecem os números mais elevados da criptococose. Isto se deve
principalmente à exposição mais freqüente aos propágulos e ás diferenças hormonais (KWON-CHUNG; BENNETT, 1992; RIPPON, 1988).
Recentemente, o método de tipagem molecular tem sido aplicado para o estudo da epidemiologia das infecções fúngicas, principalmente aquelas causadas por espécies do gênero Candida e, em menor extensão, por
Cryptococcus neoformans e outros fungos patogênicos (PFALLER et al., 1995).
A importância no uso destas técnicas é que permitem estabelecer se os isolados compartilham ou não o mesmo perfil e/ou padrão de DNA (PFALLER
et al., 1995). Desse modo pode-se detectar a ocorrência de microepidemias,
casos de recidivas ou reinfecção, surgimentos de novas linhagens ou persistência de resistência (PFALLER et al., 1992).
Com relação ao Cryptococcus neoformans têm sido empregadas as seguintes técnicas: análise de fragmentos por enzimas de restrição (Restriction
Fragment Length Polymorphism – RFLP), análise eletroforética do cariótipo,
seqüenciamento de DNA e a PCR utilizando-se primers específicos ou aleatórios (Random amplification of polymorphic DNA – RAPD). Tais procedimentos têm evidenciado a grande heterogeneidade genética entre isolados clínicos e isolados ambientais (DROMER et al., 1999; VARMA et al., 1995; PERFECT et al., 1993; CASADEVALL, 1992; YAMAMOTO et al., 1995).
A variabilidade genética pode ser evidenciada por mudanças fenotípicas, tais como perda ou aquisição de virulência, ou na susceptibilidade aos agentes antifúngicos (TIMBAYREME, 1996). Estudos de variabilidade genética, somados a testes padronizados de sensibilidade aos antifúngicos representam uma nova abordagem da epidemiologia, da patogenia e no tratamento das infecções fúngicas (PFALLER, 1995).
A variedade neoformans apresenta distribuição mundial sendo constantemente associada ao habitat de aves, particularmente de pombo (Collumbia ssp.) (LAZÉRA, 1994; CASADEVALL, 1994; LEVITZ, 1991; MITCHEL et al., 1995). Já a variedade gattii tem distribuição geográfica mais restrita sendo limitada às áreas tropicais e subtropicais (SORREL et al., 1996).
As fezes de pombo contêm altas concentrações de resíduos nitrogenados que favorecem o crescimento do fungo. A alta temperatura corpórea – 42ºC, da ave impede que se tornem infectados pela levedura (MITCHELL et al., 1995).
Cryptococcus neoformans foi isolado em fezes secas de aves como
canários, papagaios, pardais e periquitos além de outros ambientes contaminados com as excretas como madeira, folha e solo (SORREL; ELLIS, 1997).
ELLIS; PFEIFFER (1990 a, b) isolaram cepas sorotipo B (Cryptococcus
neoformans var. gattii de restos vegetais sob a copa de Eucalyptus camaldulensis na Austrália e nos Estados Unidos. Porém, esta variedade
nunca foi encontrada em fontes ambientais relacionada aos pássaros (KWON-CHUNG; BENNETT, 1992).
A variedade gattii foi identificada em outras espécies de Eucaliptus como
Eucaliptus tereticornis (LICEA et al., 1999) assim como de outras fontes
ambientais como um ninho de vespas no Uruguai (GEZUELE et al., 1993) e amendoeiras na Colômbia (CALLEJAS et al., 1998).
A ocorrência de um paralelismo entre a distribuição geográfica de árvores como Eucaliptus spp. e a incidência de infecção causada pela variedade gattii (SORREL et al., 1996) tem sido contestada pelo isolamento de novos habitats – ocos de arvores – nativas no Brasil (FORTES et al., 2001).
EMMON (1955) relata a presença pioneira de Cryptococcus neoformans no solo demonstrando que isolados virulentos são abundantes em ninhos de pombo e nas suas fezes.
LAZÉRA (1989) conseguiu identificar Cryptococcus neoformans var
neoformans em oco de arvores (Syzygium jambolana), este trabalho é o
primeiro relato da presença sapróbia da levedura no ambiente.
Já Lazéra; Wanke (1993) no Rio de Janeiro encontraram Cryptococcus
neoformans var. neoformans em ocos de árvores de cássia rosa (Cassias grandis), cássia amarela (Senna multijuga) e fícus (Ficcus microcarpa).
Em Teresina/PI, foi identificada cepa de Cryptococcus neoformans var.
gattii sorotipo B em oco de arvore de fícus, cássia rosa e oiti (Moquilea tomentosa) (LAZÉRA, 1998).
Trabalhos recentes demonstram uma positividade significativa de
Cryptococcus neoformans variedade neoformans em poeira domiciliar tanto em
Bujumbura na África como no Rio de Janeiro indicando que a exposição cotidiana do homem ao fungo nesses ambientes torna-se preocupante (SWINNE et al., 1991; PASSONI et al., 1994).
A variedade neoformans foi isolada inicialmente em 1894 de suco de pêssego (CASADEVALL; PERFECT, 1998) sendo encontrados de forma mais comum nos outros diversos microambientes do que a variedade gattii (CHEN et
al., 2000).
Lazéra (1999) citou o achado das duas variedades no mesmo habitat (ocos de arvores) apresentando uma possível ligação entre ambas variedades no ciclo vital na natureza.
Estes resultados sugeriram que nos ambientes onde são isolados
Cryptococcus neoformans ocorre uma interação entre as duas variedades.
Dessa forma, em estudos nos quais foi encontrada apenas uma destas, devem-se aprofundar novos experimentos porque se supõem que a outra variedade ainda não tenha sido isolada devido a baixa concentração dos propágulos existentes. Essa afirmação é corroborada em trabalhos realizados por MACEDO et al (2001).
2.7 Mating type
O cruzamento dos sorotipos B e C levou à formação de basidiósporos bacilares com ou sem curvatura e com parede celular lisos, denominando
Filobasidiella bacillispora como sendo a forma teleomórfica de Cryptococcus neoformans var gattii (KWON-CHUNG; BENNETT, 1992).
Esses mesmos autores ao cruzarem cepas dos sorotipos A e D, de
Cryptococcus neoformans var. neoformans descrevem a formação de
basidiósporos globosos de forma circular, alongados, elípticos com parede celular fina rugosa. Devido a isso se considerou Filobasidiella neoformans como a forma teleomórfica de Cryptococcus neoformans var. neoformans.
A fase teleomórfica é representada por células haplóides heterotálicas, porém, algumas são homotálicas autofertéis produzindo basidiósporos sem troca de material genético, o que se observa na maioria dos Basidiomicetos (KWON-CHUNG; BENNETT, 1992).
Para que aconteça o ciclo sexuado torna-se necessária à presença de tipos sexuados opostos num estado de carência nutricional (MOORE; EDMAN; 1993).
O cruzamento sexual é controlado pelo sistema bipolar de incompatibilidade, onde as células de ambos os tipos conjugadas produzem
hifas dicarióticas com ligações em ansa a partir dos conjugantes representados por duas células haplóides do tipo α e tipo a (KWON-CHUNG; BENNETT, 1992).
As hifas produzidas são hialinas com 3µm em media de largura com ramificações regulares, doliporos sem parentossoma e ligações em ansa em cada septo (KWON-CHUNG; BENNETT, 1992).
Os basídios se desenvolvem na porção terminal ou em ramificações laterais de hifas. Os basídios apresentam forma delgada, não apresentam septos e se expandem formando no ápice formato de clava onde ocorre formação de basidiósporos. Devido à umidade, se rompem, liberando os esporos e em poucas horas produzem brotamentos e formação de cápsulas (KWON-CHUNG; BENNETT, 1992).
O genoma DNA que produz ferormônio – lócus mating type α é identificado somente nas células MAT α. Não ocorre lócus silencioso de alelos MAT α. Isto acontece porque não há troca de tipos sexuais (MOORE; EDMAN, 1993).
Os mating type MAT α ocorrem com 30 a 40 vezes mais freqüência do que os mating type MAT a, tanto em isolados clínicos como ambientais; não é comum ocorrer células diplóides auto-fertéis (WHITE, 1985).
A partir de um par de cepas congênitas de Cryptococcus neoformans nota-se que o mating type α é muito mais virulento que o mating type a. Isso se deve ao fato de que este mating type apresenta um gene STE 12 alpha que de acordo com Chang et al. (2000) ao ser rompido, deixa as cepas correspondentes menos virulentas (CHANG, 2000; KWON-CHUNG, 1991).
Os tipos sexuais α – apresentam maior produção da enzima fenoloxidase e, conseqüentemente, também de melanina que os tipos sexuais a (WICLES et al., 1996) o que é considerado um fator de virulência.
2.8 Sensibilidade aos antifúngicos
O inicio do tratamento especifico deve-se ser rápido assim logo se estabeleça o diagnostico definido do agente infeccioso (KWON-CHUNG; BENNETT, 1992).
A primeira terapia efetiva para o tratamento de criptococose foi o uso de anfotericina B (CASADEVALLL; PERFECT, 1998).
O uso do antibiótico poliênico – anfotericinia B, associada ou não a 5-flucitosina é o tratamento usual e principal para o combate a criptococose, porém, os efeitos tóxicos conseqüentes desse uso são extremamente graves e sérios (DISMUKES, 1993).
Essa associação mudou drasticamente a terapia, e diminuiu a mortalidade de 95% para 25% dos casos clínicos (CASADEVALLL; PERFECT, 1998).
Os derivados azólicos são utilizados como meio alternativo a essa terapia e teve sua utilização aumentada após a ocorrência de pacientes portadores de SIDA (DISMUKES, 1993). Após a implantação do uso de fluconazol (uso oral) na década de 80, completou-se o tratamento da criptococose (CASADEVALLL; PERFECT, 1998).
3. OBJETIVOS
3.1. GERAL
- Caracterizar as amostras clínicas de Cryptococcus neoformans isolados no Estado de Sergipe no período de 2001 a 2004.
3.2. ESPECÍFICOS
- Determinar as variedades de Cryptococcus neoformans isolados em Sergipe;
- Verificar a sensibilidade dos isolados de C. neoformans a antifúngicos através da técnica de determinação da concentração inibitória mínima segundo o teste padrão do National Committee For Clinical Laboratory
Standard (NCCLS);
- Identificar o mating type dos isolados clínicos de C. neoformans através da reação em cadeia da polimerase (PCR).
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ZAITZ, C.; CAMPBELL, I.; MARQUES, S.L.; RUIZ, L.R.B.; SOUZA, V.M.
CAPÍTULO 02
Medical Mycology
ISSN: 1369-3786
ARTIGO 1
DETERMINAÇÃO DAS VARIEDADES DE Cryptococcus neoformans
NO ESTADO DE SERGIPE RESUMO
Este trabalho teve como objetivo estudar as variedades (neoformans e gattii) de Cryptococcus neoformans isolados no Estado de Sergipe a partir do líquido cefalorraquidiano de pacientes com meningite infecciosa. Foram utilizadas amostras do Líquido cefalorraquidiano que deram entrada no IPH/LACEN/SE no período de 2001 a 2004. Foi realizada microscopia direta através da coloração com Tinta Nanquim. Uma alíquota do líquor (0,1mL) foi transferida para tubos contendo Agar Sabouraud com clorafenicol e incubado em temperatura ambiente 25ºC e a 37ºC. Foram realizadas provas para identificação presuntiva, fenotípica em meio Níger e das variedades em meio CGB. No período analisado, apenas uma amostra apresentou características fenotípicas em meio Níger diferenciada das outras. Do total de 15 amostras analisadas em meio CGB, 02 amostras (13,33%) se apresentaram positiva, ou seja, foram identificadas como variedade gattii, sendo uma delas isolada de paciente soronegativo para HIV (paciente não aidético). As outras 13 amostras (86,67%) apresentaram CGB negativo, ou seja, foram identificadas como variedade neoformans. A maioria das amostras de Cryptococcus neoformans isolados do líquor de pacientes com meningite infecciosa são da variedade
neoformans em Sergipe.
Palavras-chaves: Cryptococcus neoformans; variedades; meningite criptocócica; levedura patogênica; Agar Níger
4.1 INTRODUÇÃO
Cryptococcus neoformans é um basidiomiceto encapsulado que infectas
tanto pacientes imunodeprimidos como pacientes imunocompetentes (KWON-CHUNG; BENNETT, 1992). A meningite criptocócica ocorre em aproximadamente 8 a 30% dos pacientes com a síndrome de imunodeficiência adquirida (SIDA); apesar da terapia antifúngica a mortalidade permanece elevada de 6 a 29% dos casos (MITCHELL; PERFECT, 1995; POWDERLY, 1996).
Esta levedura apresenta duas variedades descritas, a variedade
neoformans (sorotipos A, D e AD) e a variedade gattii (sorotipos B e C) (ELLIS;
SORREL, 1997). A variedade neoformans tem sido isolada de fezes de aves, restos vegetais e solos contaminados por esses materiais (KWON-CHUNG; BENNETT, 1992; CASADEVALLL; PERFECT; 1998). Também foi encontrado em vegetais como Eucaliptos (ELLIS; PFEIFFER, 1990) e de plantas nativas do Brasil (LAZÉRA et al., 1996; FORTES et al., 2001).
A variedade gattii acomete pacientes principalmente de regiões tropicais (KWON-CHUNG; BENNETT, 1992). Foi isolado continuamente de ambientes e materiais de Eucaliptus spp. (ELLIS; PFEIFFER, 1990). Também foi isolado de plantas nativas da Amazônia como a Guetarda spp. (FORTES et al., 2001), esta variedade foi descrita no primeiro exemplo de criptococose causada por um golfinho macho Tursiops truncatus presente no Oceano Atlântico (MILLER
et al., 2002). SORREL et al. (2002) apresentam um surto epidêmico de Cryptococcus neoformans var. gattii na região de Vancouver – Canadá, região
temperada da América do Norte, causando criptococose em pacientes hígidos, imunodepridimidos, animais (cães e golfinhos) e isolados em espécies de plantas nas cercanias da região epidêmica.
O sorotipo A predomina tanto em amostras clínicas quanto ambientais, com exceção do Norte europeu e isso pode ser reflexo da diferenças climáticas e da virulência do sorotipo (DHROMER et al., 1996).
Já o sorotipo C foi recentemente encontrado em detritos vegetais na Colômbia, em áreas identificadas como endêmicas para a variedade gattii (CALLEJAS et al., 1998). Esta variedade também já foi encontrada em vespa, morcego, coalas e camelos (LAZÉRA et al., 1993; MONTAGNA et al., 1996; ELLIS; PFEIFFER; 1990). Neves et al (2004) isolaram ambas variedades em areia contaminada com fezes de galinha assim como madeira em decomposição de tábuas de casas e tronco de palmeira, e isolou pela primeira vez em ninho de cupim no Estado de Roraima. Macedo et al (2001) apresentam um relato de ocorrência de Cryptococcus neoformans em “habitat” de tatu no Nordeste do Brasil.
Uma das características fisiológicas de C. neoformans é a produção de fenoloxidase, enzima recentemente identificada como uma lacase (WILLIAMSON, 1994) que apresenta atividade relacionada à virulência do fungo. Esta enzima tem capacidade de mineralização da lignina e isto sugere uma adaptação natural de Cryptococcus neoformans as diversas espécies de plantas e não somente a Eucaliptus, o que favorece sua associação a estes nichos (LAZÉRA et al., 1993). As presenças de substâncias fenólicas em extratos de Níger favorecem a tal atividade bioquímica de Cryptococcus
neoformans, que se caracteriza pela produção regular de fenoloxidase e
confere a esse meio, Agar Staib, grande aplicabilidade na micologia médica. Nele, C. neoformans desenvolve colônias marrons (POLACHEK, 1991) e pode se diferenciar de outras espécies de Cryptococcus, bem como de Candida
albicans, outra levedura de grande interesse médico.
O objetivo deste trabalho foi determinar as variedades (neoformans e
gattii) de Cryptococcus neoformans isolados em Sergipe a partir do líquido
4.2 MATERIAL E MÉTODO
4.2.1 Processamento dos materiais biológicos
As amostras do Líquido cefalorraquidiano deram entrada no Instituto Parreiras Horta – Laboratório Central de Saúde Pública através do Laboratório de Micologia no período de 2001 a 2004. Foi realizada microscopia direta através da coloração com Tinta Nanquim. Uma alíquota do líquor (0,1mL) foi colocado em tubos de Agar Sabouraud com clorafenicol e incubado em temperatura ambiente 25ºC e a 37ºC.
4.2.2 Identificação presuntiva
Colônias brancas ou creme e mucóides foram confirmadas como
Cryptococcus neoformans a partir de nova preparação usando Tinta Nanquim.
Essas cepas foram enviadas para o Laboratório de Microbiologia Aplicada (LMA) da Universidade Federal de Sergipe para os testes presuntivos.
4.2.3. Identificação fenotípica
Foi utilizada a metodologia recomendada por STAIB et al. (1987) onde cada cepa foi re-isolada, utilizando meio Níger (sementes de Guizotia
abyssinica) e três colônias de cada amostra e/ou morfotipos com fenótipos
diferentes foram isoladas de cada amostra. Esse tipo de atividade é recomendado caso haja variabilidade (de variedade, sorotipo, sorogrupo ou tipo molecular) intracolonial de Cryptococcus neoformans.
No meio Níger, Cryptococcus neoformans apresenta uma coloração marrom e úmida, devido à produção de uma enzima classificada como lacase –
