Determinação de micotoxinas em alimentos

A amostragem é apontada como a principal fonte de variação dos resultados na detecção e quantificação de micotoxinas em alimentos, devido a heterogeneidade de distribuição do inóculo. Via de regra, a contaminação concentra-se em um pequeno número de partículas, o que geralmente não ocorre com produtos líquidos ou homogeneizados em função da dispersão.

A produção de micotoxinas em alimentos quando ocorre de forma direta, apresenta distribuição irregular e circunstancial em alimentos, com conseqüente heterogeneidade na amostra. E, se torna necessário emprego de um plano de amostragem estratificado, ou seja, a seleção de pontos distintos (estrato); uma amostra aleatória simples deverá ser retirada de cada estrato (sub-amostra), a fim de, compor a amostra completa (representativa). A amostra composta deve ser encaminhada ao laboratório para que se faça a homogeneização e retirada da amostra analítica.

O preparo da amostra irá depender da natureza do alimento, enquanto à homogeneização, dependerá do plano de amostragem efetuado. Nos alimentos sólidos, após redução do tamanho das partículas em moinhos ou trituradores, com ou sem utilização de solventes é que se retira a alíquota para o procedimento analítico.

A extração de alimentos sólidos se faz a partir da transferência da micotoxina do sólido para uma fase líquida. Para tanto, taxas de recuperação devem ser estabelecidas. Solventes orgânicos e/ou misturas de solventes orgânicos com água são os compostos de escolha para extração de alimentos sólidos. A homogeneização do solvente no soluto (alimento) é um fator primordial na eficiência do processo, que varia de alguns minutos até 2 horas. Procedimentos que envolvem misturadoras são mais rápidos, mas tem de se assegurar que a totalidade da amostra está continuamente em contato com o solvente e que não há zonas

mortas ou estagnadas. Se um número considerável de amostras é analisado, o processo de agitação é o de escolha (CAST, 2003).

A limpeza é feita após a extração, para remoção de impurezas do extrato. Ou seja, consiste no isolamento da micotoxina e, também é útil na concentração da toxina de interesse. Trata-se de uma etapa indispensável quando se busca boa seletividade e sensibilidade. A limpeza de extratos é efetuada basicamente com colunas de extração em fase sólida (SPE). O enchimento das colunas SPE é normalmente de sílica porosa, cuja superfície foi modificada para permitir uma adsorção selectiva do analito ou das impurezas. Se o alvo da retenção é o analito, as impurezas são lixiviadas. O analito é então removido seletivamente por alteração da solução de lavagem. Se a coluna retém as impurezas, o analito permanece no extrato líquido, não havendo a necessidade dessa última fase.

As colunas de imunoafinidade (IAC) são uma forma de colunas SPE. Neste caso, anticorpos específicos para o analito são fixados em material inerte. O analito é removido da coluna com auxílio de solvente capaz de desnaturar o anticorpo. Existem colunas de imunoafinidade disponíveis para aflatoxinas, OTA, fumonisinas, zearelanona e DON. Normalmente, as IACs são muito eficientes para remover impurezas. Interferências na coluna irão influenciar na capacidade de ligação dos anticorpos à toxina. Portanto, em relação às especificações do fabricante, algumas condições deverão ser observadas tais como: volume de extrato, força do solvente e velocidade de percolação.

A determinação consiste em dois tipos: métodos de rastreio e métodos confirmatórios. Os métodos de rastreio são de determinação rápida, mas pouco rigorosos na quantificação, tem-se como exemplo: os kits de ELISA (Enzima Imuno Ensaio) e a cromatografia de camada delgada (TLC).

Os métodos confirmatórios permitem maior exatidão na determinação das concentrações e confirmação da identidade da micotoxina (comparação com padrão e processos de derivatização). As técnicas cromatográficas e de espectrometria como HPLC, GC e LC- MS/MS é que são as ferramentas de preferência.

A escolha da metodologia analítica deverá ser baseada em alguns critérios, como a especificidade do alimento, validação do método e sempre que possível seguir protocolos oficiais (Associação Oficial dos Analistas químicos (AOAC), Comitê Europeu para Normatização (CEN) ou Organização Internacional para Normas (ISO). Para controle do laboratório, critérios de desempenho e aceitação devem ser observados: determinação da taxa de recuperação, repetibilidade (r),

desvio padrão da repetibilidade (sr), desvio padrão relativo da

repetibilidade (RSDr), reprodutibilidade (R), desvio padrão da

reprodutibilidade (sR), desvio padrão relativo da reprodutibilidade

(RSDR).

3.10 Ocratoxina A

As ocratoxinas constituem um grupo de metabólitos secundários produzidos por fungos do gêneros Penicillium e Aspergillus; pertecem a este grupo a ocratoxina A (OTA), ocratoxina B (OTB), ocratoxina C (OTC), 4-hidroxiocratoxina A (4-OH OTA) e ocratoxina α (OTα). Essas micotoxinas são compostas basicamente de 2 grupamentos: uma di-hidroxi isocumarina ligada através do seu grupo 7-carboxi a amida do grupamento L-β-fenilalanina (essa ligação é muito estável em relação à hidrólise e temperatura), com exceção da OTα em que o grupamento fenilanina está ausente. A Figura 3.8 apresenta a estrutura das ocratoxinas.

Figura 3.8 - Estrutura das ocratoxinas A, B, 4-hidroxiocratoxina A

e ocratoxina α. Fonte: Ringot et al. (2006)

A OTA é a representante mais tóxica do grupo. Isso tem sido atribuído a presença do átomo de cloro na posição C5 adicionado a presença de um grupo OH fenólico (CHU et al. 1972). Oisolamento da OTA produzida pelo fungo Aspergillus ochraceus Wilh. foi descrito pela primeira vez por VAN DER MERWE et al. (1965).

A OTA apresenta alta solubilidade em solventes orgânicos polares e solubilidade moderada em solução aquosa de bicarbonato de sódio; exibe adsorção UV: λMeOH

max= 333nm (POHLAND et al. 1982).

absoluto e etanol (96%), respectivamente (KUIPPER-GOODMAN & SCOTT, 1989). Apresenta caráter de ácido fraco, com valores de pKa de 4,2-4,4 para o grupo carboxila da fenilalanina e 7,0 - 7,3 para o grupamento hidroxila da isocumarina (VALENTA, 1998).

De acordo com CHU (1974), a ocratoxina B é considerada dez vezes menos tóxica que a OTA. Acredita-se que isso se deva a remoção do radical cloro na dissociação do grupamento fenólico e a propriedade ferro-quelante da molécula. A Figura 3.9 representa a fórmula estrutural [7- (L-β-fenilalanilcarbonil) - carboxil-5-cloro-8-hydroxi-3,4-dihidro- 3R-metilisocumarina] da OTA, sendo que o grupamento fenilalanina se encontra destacado em vermelho.

Figura 3.9 - Fórmula estrutural da OTA.