Diagnóstico diferencial

A realização de um diagnóstico diferencial deve ter em conta outras doenças que causem hipoproteinemia e emagrecimento (Brugère-Picoux, 1987). Uma primeira hipótese é a possibilidade de o animal ter uma má nutrição, sem um aporte adequado de nutrientes. Depois, o parasitismo, tanto interno (estrongilose, coccidiose), como externo. Algumas doenças víricas como a pneumonia ovina progressiva (maedi-visna) e a artrite encefalite caprina, doenças bacterianas como a linfadenite caseosa (Corynebacterium

pseudoparatuberculosis), doenças neoplásicas como a adenomatose pulmonar ovina e outras

neoplasias intestinais e doenças crónicas como peritonite crónica, doença hepática crónica, amiloidose renal. Outras afeções intestinais, salmonelose e intoxicação por molibdénio também constam na lista (Roussel e Whitlock, 1986; Brugère-Picoux, 1987; Fecteau e Whitlock, 2011).

A linfadenite caseosa é uma doença bacteriana causada por Corynebacterium

pseudotuberculosis. É caracterizada pela formação de abcessos na pele, nos linfonodos e

nos órgãos internos (Williamson, 2001). Quando afeta os linfonodos mesentéricos pode alterar a função intestinal, uma vez que interfere com as ansas intestinais adjacentes, causando diarreia e emaciação. Para se distinguir devemos consultar a história do rebanho. Se a doença não estiver presente na exploração e as lesões externas da pele não forem observadas, é improvável que seja esta a causa (Moser, 1982). Outra forma de exclusão do diagnóstico, esta ligada com os níveis séricos de proteína que na linfadenite caseosa estão, normalmente, elevados, e na paratuberculose encontram-se abaixo do normal (Desiderio et al., 1979). O parasitismo intestinal e a salmonelose são considerados diferenciais para a origem da diarreia (Moser, 1982). O parasitismo encontra-se muito ligado ao mau maneio nas explorações, tanto a nível de higiene, como de alimentação, de fornecimento de água e de controlo parasitário. Pode causar várias doenças, tendo grande importância económica a nível mundial (Koinari et al., 2013). É facilmente descartado após terapia antiparasitária sem resultados ou de métodos de diagnóstico de parasitismo gastrointestinal tais como a flutuação fecal (Zajac, 2006). A salmonelose causa inúmeras preocupações não só porque se trata de uma zoonose mas também por que causa elevadas perdas, tanto económicas como a nível do bem-estar em rebanhos infetados (Van Schaik et al., 2007). Pode-se facilmente descartar

24 se não se conseguir isolar Salmonella sp. ou se não se evidenciarem sinais sistémicos da doença (Moser, 1982).

As disfunções hepáticas que provocam disfunções a nível da síntese proteica podem causar também emaciação. O nível de lesão hepática pode ser medido com base na concentração sérica de enzimas como a alanina (ALT) e a aspartato (AST) aminotransferase, muitas vezes apenas o aumento de uma enzima não é suficiente, isto é, por exemplo o aumento da AST pode ser também indicativo de lesão muscular, assim para avaliar a função hepática pode-se recorrer ainda à avaliação do nível de outras enzimas como a creatina fosfoquinase (CK) ou a sorbitol desidrogenase (SDH) (Moser, 1982).

A presença de linfossarcomas a nível da parede abomasal pode causar disfunção gastrointestinal e consequente perda de peso. No entanto, pode também estar associada a outros sinais clínicos como o vómito e a melena. Esta situação é no entanto mais comum em bovinos do que em pequenos ruminantes (Moser, 1982; Braun et al., 2011).

2.1.8. Controlo e prevenção

2.1.8.1. Medidas preventivas

Ao contrário de doenças como a brucelose ou a tuberculose, não existe um plano de controlo e/ou erradicação para a paratuberculose. No entanto, as medidas preventivas podem diminuir as perdas consideravelmente, sobretudo se essas medidas forem implementadas em conjunto. O primeiro passo deve ser elaborar um estudo dos fatores de risco a que exploração está sujeita, devendo este trabalho ser feito pelo médico veterinário em colaboração com o proprietário. É muito importante que o proprietário entenda a necessidade de fazer determinadas mudanças. Além disso, deve ser também realizada uma análise de custo- benefício que se torna essencial na tomada de decisões (Sockett, 1996; Robbe-Austerman, 2011). Em Portugal é atualmente uma Doença de Declaração Obrigatória.

As medidas tomadas que visam a via de transmissão feco-oral são consideradas mais eficazes que as que afetam a transmissão pelo colostro e pelo leite (Radia et al., 2013). Uma vez que é aceite que os animais são infetados com Map numa fase muito precoce da sua vida, os programas de controlo baseiam-se na prevenção da transmissão de Map direta ou indiretamente dos adultos para os jovens de reposição. A vacinação pode reduzir a incidência da doença clínica e a colonização dos tecidos intestinais mas não protege completamente da infeção e muitas vezes o animal continua a excretar Map nas suas fezes (Larsen et al., 1974; Sweeney, 1996; Kalis et al., 2001; Fecteau e Whitlock, 2011). Uma das

25 medidas a ser aplicadas aos animais jovens é limitar o contacto com pastagens contaminadas (McGregor et al., 2012).

A pastagem pode constituir uma importante fonte de contaminação, por essa razão é indicado usar métodos rotacionais das pastagens e explicar o risco que constitui a aplicação de estrume nas pastagens (Robbe-Austerman, 2011).

Uma vez que o parto constitui uma fase muito importante, é durante este período que antecede, durante e depois que devem ser tomadas várias medidas. A exclusão de fêmeas que apresentem uma condição corporal baixa reduz bastante o risco de uma infeção fetal (Lambeth et al., 2004) assim como, reduz a possibilidade de nascerem animais fracos e pequenos que podem ser mais suscetíveis à infeção (Robbe-Austerman, 2011). O parto quando no exterior diminui a transmissão de Map associado aos partos no interior, devido ao maior espaço no exterior, menor contacto com outros animais adultos e menor densidade de contaminação fecal (Radia et al., 2013). A limpeza do úbere e membros posteriores mesmo antes do parto é considerada pouco eficaz. Aliás, esta prática está mesmo relacionada com a infeção por Map, talvez porque seja uma prática bastante usada em explorações com condições de higiene mais deficientes. Existem evidências que sugerem que esta prática possa até aumentar a transmissão de Map, pois ao humedecer a matéria fecal seca nesta área, aumenta a contaminação dos tetos (Radia et al., 2013). Após o parto, deve-se impedir que os recém-nascidos ingiram o colostro diretamente da mãe, tapando os tetos ou separando-os das mães. É essencial que eles estejam estabulados num local limpo, separados dos adultos. É muito importante que o colostro seja fornecido, mas deve ser submetido a tratamento, a combinação de tempo e temperatura deve ser discutida uma vez que pode ser insuficiente. O tratamento do leite é também recomendado (Robbe-Austerman, 2011).

As fêmeas de substituição devem ser mantidas afastadas dos adultos, pelo menos até ao primeiro parto, evitando que elas pastem nos mesmos locais dos adultos (Robbe-Austerman, 2011).

O fornecimento de água e comida deve também ser cuidado. Deve-se manter os bebedouros limpos e reduzir as águas paradas, a forma de fornecer alimento deve ser avaliada, para evitar qua seja pisado ou até espalhado pelo chão (Robbe-Austerman, 2011). Além disso, é importante assegurar a qualidade do alimento (Geraghty et al., 2014).

O uso de testes diagnóstico é também uma forma de controlo importante, uma vez que pode indicar quais os animais que constituem grandes fontes de infeção, permitindo o seu refugo precoce (Robbe-Austerman, 2011).

26 A classificação dos rebanhos é benéfica uma vez que facilita as trocas e vendas de animais, a Austrália, a Holanda, a Dinamarca e o Reino Unido usam um sistema que permite classificar as explorações de acordo o nível de compromisso com as medidas de controlo ou a aparente prevalência da infeção (Geraghty et al., 2014).

A administração profilática de agentes antimicrobianos a animais jovens durante o período de alta suscetibilidade e risco de alta exposição pode representar uma abordagem adicional à prevenção de infeções por Map (Fecteau e Whitlock, 2011).

A monensina é um ionóforo muito usado para aumentar a eficiência alimentar e controlar a coccidiose (McDougald, 1978; Goodrich et al., 1984). O seu mecanismo de ação baseia-se na ligação à membrana celular das bactérias, especialmente às Gram positivas, mas também à Mycobacteria, causando a saída de potássio e a entrada de iões de hidrogénio. As células para manterem o gradiente, gastam energia, o que resulta na sua morte ou crescimento reduzido (Westley et al., 1983; Fecteau e Whitlock, 2011). Os estudos realizados permitiram observar alguns benefícios da sua administração, como a redução das lesões histológicas causadas por Map no fígado, íleo e mucosa do reto (Brumbaugh et al., 2000), a redução de testes ELISA positivos a Map em animais adultos (Hendrick et al., 2006a) e a redução de colónias fecais de Map e de unidades de formação de colónias (Hendrick et al., 2006b). Assim, pode-se concluir que a monensina tem efeito positivo tanto a nível dos animais jovens como dos adultos, pois diminui a excreção de Map na exploração. Em contrapartida, se não for usada na dose recomendada, a monensina pode ser tóxica, podendo causar anorexia, diarreia, fraqueza, ataxia, dispneia, prostração e até morte (Van Vleet et al., 1983; Duffield e Bagg, 2000).

O gálio é um semimetal que apresenta inúmeras semelhanças com o ferro e mimetiza algumas das suas funções. Em determinadas condições, o gálio é preferido em detrimento do ferro, o que implica que ocorra a interrupção de certas vias metabólicas que são importantes para o crescimento e metabolismo de Mycobacterium (Olakanmi et al., 2000). Este elemento está também descrito como tendo atividade antimicrobiana in vitro contra vários microrganismos incluindo Map. Em experiências posteriores descobriu-se que o tratamento com gálio estava associado a redução da carga tecidular de Map sendo que não foram relatados efeitos adversos (Fecteau et al., 2011). É necessário, no entanto, realizar mais estudos que permitam estabelecer uma dose ótima e avaliar os resíduos do fármaco, o custo e o impacto ambiental que possa causar (Fecteau e Whitlock, 2011).

27 2.1.8.2. Vacinação

À medida que a eliminação de animais doentes se torna cada vez menos aceitável, tanto a nível do bem-estar animal como a nível económico, a vacinação ganha lugar como a medida de eleição dos programas de controlo da paratuberculose (Juste, 2012). Isto porque, como foi já demonstrado, diminui significativamente a doença clínica, mas também os níveis de MAP, tanto nos tecidos como nas excreções fecais (Patton, 2011). Esta, constitui assim, uma ferramenta valiosa uma vez que diminui os riscos de contaminação e reduz ou atrasa as perdas produtivas (Bastida e Juste, 2011).

No entanto, o uso das vacinas também tem aspetos negativos, tais como a formação de granulomas, a interferência com o diagnóstico da paratuberculose e também da tuberculose, no caso de bovinos e os riscos para a saúde humana devido à inoculação acidental (Muskens et al., 2002; Patton, 2011).

A inoculação provoca um pequeno inchaço devido à reação inflamatória que gradualmente dá lugar a um nódulo fibrocaseoso cujas dimensões são variáveis e que pode persistir ao longo de vários anos (Office International des Epizooties, 1992; Aduriz et al., 2000). No entanto, estudos realizados em matadouro indicam que estas lesões não se traduzem em perdas económicas (Patton, 2011).

O uso de vacinas pode interferir com o resultado de testes de diagnóstico, uma vez que além da resposta imunitária mediada por células, também induzem uma resposta humoral, levando a que os animais testem positivo quando os testes de diagnóstico se baseiam na deteção de anticorpos (Office International des Epizooties, 1992; Muskens et al., 2002).

É recomendada que a administração seja feita numa fase precoce da vida, com o propósito de prevenir a infeção, no entanto, existem vantagens que devem ser tidas em conta, em vacinar animais mais velhos (Office International des Epizooties, 1992; Bastida e Juste, 2011). A inoculação é subcutânea e pode ser administrada na zona da axila ou a nível peitoral, sendo esta zona considerada mais segura, uma vez que na axila, devido à marcha do animal a zona possa ficar mais irritada e inflamada (Office International des Epizooties, 1992).

Já foram usadas vacinas vivas atenuadas e não atenuadas e vacinas inativadas contra a paratuberculose (Bastida e Juste, 2011). Hoje em dia a maioria são vacinas vivas atenuadas ou vacinas inativadas. Apesar de não se detetarem diferenças na resposta imunitária ou no grau de proteção, as vacinas inativadas são preferidas pela maior segurança que conferem (Office International des Epizooties, 1992; Aduriz et al., 2000). As vacinas de subunidades foram também já usadas, tendo já sido demonstrado em bovinos (Koets et al., 2006) e em

28 caprinos (Kathaperumal et al., 2009) resultados positivos, apesar de apresentarem um menor grau de proteção. Mais recentemente, começaram a ser estudadas as vacinas de ADN que apesar dos bons resultados apresentados, se considere que é necessário realizar mais pesquisas nesta área (Sechi et al., 2006; Bull et al., 2007; Roupie et al., 2008). É importante referir que a pesquisa de novas vacinas deve continuar, com o objetivo de diminuir os efeitos negativos e melhorar a sua eficácia (Rosseels e Huygen, 2008; Patton, 2011).

O objetivo das vacinas é originar um foco de inflamação onde os antigénios possam estimular permanentemente o sistema imunitário do hospedeiro, de forma a não ser necessário revacinar (Bastida e Juste, 2011).

Para a elaboração da vacina é necessário cumprir determinados parâmetros. As estirpes a serem usadas devem ser analisadas e consideradas inócuas quando administradas pela via recomendada. As culturas podem ser feitas em plantas de batata parcialmente imersas num meio adequado como o meio de Reid, o seu armazenamento pode ser feito liofilizado, mas quando ativas devem ser incubadas a 37ºC e para poderem ser usadas devem ser submetidas a testes de pureza. A vacina, por sua vez, pode ser armazenada durante 9 meses sem que haja perda da sua eficácia, à temperatura recomendada de 2-8ºC (Office International des Epizooties, 1992).

A vacinação deve ser usada como parte de um programa de controlo, no entanto, devemos sempre ter em conta que não confere proteção total contra a doença (Office International des Epizooties, 1992). E por essa razão, o seu uso deve ser sempre complementado com boas práticas de maneio (Patton, 2011).

2.1.9. Tratamento

Não existe cura definitiva para infeções com Map, mas existem vários agentes terapêuticos que podem ser usados para reduzir ou aliviar os sinais clínicos da paratuberculose e ajudar a prolongar a vida dos ruminantes (Fecteau e Whitlock, 2011).

O tratamento é raramente indicado (St-Jean e Jernigan, 1991). Mas quando realizado, deve ser mantido para toda a vida do animal. Os animais tratados continuam a disseminar organismos de Map, apesar de na maioria das vezes ser uma emissão mais reduzida (Fecteau e Whitlock, 2011).

As opções terapêuticas existentes são usadas em animais com elevado valor económico, genético ou sentimental, uma vez que os esforços feitos atendem apenas à necessidade de prolongar a vida dos animais, servindo apenas a propósitos de reprodução (Harris e Barletta,

29 2001). Uma vez que os autores recomendam que a carne e o leite de animais tratados nunca devam ser usados para consumo humano (Fecteau e Whitlock, 2011).

De uma forma geral, após vários testes, concluiu-se que a maioria dos agentes antibióticos e antimetabolitos inibem o crescimento in vitro de Map. Dentro dos antibióticos, os que se consideram ter maior ação são os aminoglicosídeos (tais como gentamicina, canamicina, neomicina, estreptomicina, tobramicina, entre outros), a capreomicina, a rifabutina, o rifampin e a viomicina. Por sua vez, os antimetabolitos, incluem fármacos usados contra a tuberculose como a cicloserina, etambutol, etionamida, isoniazida, ácido para-aminosalicilico, tiocarlide e tiosemicarbazonas e fármacos usadas contra a lepra como a dampsona e outras sulfonas (Cocito et al., 1994).

Isoniazida

A Isoniazida inibe a biossíntese do ácido micólico, um componente maioritário da parede celular das micobactérias. Nos primeiros dois dias de tratamento, quando o crescimento bacteriano é rápido tem ação bactericida, depois, durante o resto do tratamento, torna-se bacteriostático, uma vez que a taxa de replicação do agente patogénico abranda (Somoskovi et al., 2001). Os estudos já feitos indicam que o tratamento de casos clínicos de paratuberculose com isoniazida apenas ou em combinação com outros antimicrobianos pode induzir a remissão clínica mas não elimina a infeção por Map (Fecteau e Whitlock, 2011). Rifampin (rifampicina)

O Rifampin é um antibiótico semissintético derivado da rifamicina B, apresenta um amplo espectro de ação antimicrobiano e é tanto bactericida como bacteriostático, dependendo do organismo e da concentração. O Rifampin entra nos leucócitos, sendo portanto bastante eficaz contra microrganismos intracelulares (Hillidge, 1987; Mandell e Sande, 1985; Fecteau e Whitlock, 2011). É recomendado que a administração de rifampin seja sempre feita com outro agente antimicrobiano devido à sinergia entre fármacos e para diminuir o potencial desenvolvimento de resistência ao fármaco. Estudos referem combinações com levamisol e estreptomicina ou com estreptomicina e isoniazida (Slocombe, 1982; Mondal et al., 1994). Clofazimina

A clofazimina começou por ser usada no tratamento de casos de lepra que se tornaram resistente às sulfonas (Pettit e Rees, 1966; Fecteau e Whitlock, 2011). O seu modo de ação baseia-se na sua ligação e consequente inibição da replicação do ADN bacteriano (Morrison e Marley, 1976; Fecteau e Whitlock, 2011). A clofazimina acumula-se no tecido adiposo e nos

30 macrófagos do sistema reticuloendotelial tendo portanto boa eficácia contra agentes patogénicos tais como Map. (Gilmour, 1966; Fecteau e Whitlock, 2011)

Estudos indicam que a sua administração em animais com infeções estabelecidas reduz o número de organismos no trato intestinal e nos linfonodos mesentéricos, mas não elimina por completo a infeção (Gilmour, 1966; Fecteau e Whitlock, 2011). Outro estudo mostrou que os animais apresentaram uma resposta favorável ao tratamento, diminuindo os níveis de excreção e melhorando os sinais clínicos (ganho de peso, aumento da concentração da proteína plasmática, melhoria da consistência das fezes) no entanto, após a descontinuação do tratamento alguns tiveram recidivas. À necropsia os tecidos apresentavam culturas positivas de Map (Merkal e Larsen, 1973; Whitlock et al., 1983; Fecteau e Whitlock, 2011). Outras opções de tratamento

Alguns aminoglicosídeos tais como a estreptomicina, a canamicina, a gentamicina e a amicacina, são ativos contra várias espécies de micobactérias incluindo Map (Eidus e Konst, 1964; Mandell e Sande, 1985; Chiodini, 1990).

Mais recentemente, novos fármacos como a ciclosporina A, a rapamicina, o tacrolimus, ácido 5-aminosaliciclico, o metrotrexato, a azatioprina e o seu metabolito 6-mercaptopurina foram testadas in vitro (Greenstein et al., 2008; Krishnan et al., 2009).

A administração intramuscular de levamisol está também descrita como benéfica uma vez que diminui a presença de bacilos nas amostras fecais (Senturk et al., 2009).

Recentemente, os probióticos tem sido usados como potenciais agentes terapêuticos em inúmeras doenças, Dietzia subsp. C79793-74 está descrita como inibidora do crescimento de Map em certas condições in vitro. Estudos indicam que animais testados positivamente com administrações diárias de Dietzia subsp, tem o tempo de vida prolongado comparativamente aos animais controlo (Click e Van Kampen, 2009, 2010).

2.1.10. Potencial Zoonótico

Ao contrário do Mycobacterium avium complex (Mac) e do M. intracellulare que são conhecidos já há algum tempo como agentes patogénicos oportunistas do Homem, em casos de doenças respiratórias infeciosas e de indivíduos com o sistema imunitário comprometido, até há relativamente pouco tempo, o MAP raramente era reconhecido em doenças infeciosas no Homem (Inderlied et al., 1993). Aliás, só mais tarde Map foi isolado em pacientes com Doença de Crohn (Schwartz et al., 2000; Kirkwood et al., 2009) e foi descrita a infeção por Map em pacientes seropositivos (Richter et al., 2002), com diabetes tipo I (Naser et al., 2013; Masala et al., 2014) e com esclerose múltipla (Cossu et al., 2013).

31 A relação entre Map e a doença de Crohn, uma enterocolite humana, pode ser causal, ou seja, Map pode ser o seu agente etiológico ou então pode apenas tratar-se de um agente patogénico oportunista que afetam os pacientes com DC porque estes criam condições favoráveis para a sua colonização (Chacon et al., 2004).

Inúmeras descobertas apontam para a capacidade zoonótica de Map. No entanto, ainda não foram encontradas evidências que a causa das doenças inflamatórias intestinais, tais como a DC sejam causadas apenas por um agente, e que esse agente seja Map (Atreya et al., 2014). Mas pode-se afirmar, pelo menos que ele está envolvido na patogénese de alguns casos de DC (Naser et al., 2014).

A associação entre Map e a DC parece ser específica mas o seu papel na etiologia da DC ainda se encontra por definir. (Feller et al., 2007)

É, no entanto, de extrema importância desenvolver métodos mais sofisticados que permitam a deteção de Map, pois ter conhecimento da sua presença ou ausência é necessário para realizar um tratamento apropriado e eficaz (Naser et al., 2014).

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2. Objetivos

O objetivo principal deste trabalho foi desenvolver e consolidar conhecimentos sobre a paratuberculose através do acompanhamento de casos clínicos. Para isso foram estabelecidos objetivos mais específicos:

- Observar e avaliar explorações, bem como as técnicas de maneio adotadas por cada uma; - Detetar e avaliar os sinais clínicos da doença;

- Realizar a colheita de amostras; - Realizar a vacinação contra a doença;

- Compreender as vantagens e desvantagens da vacinação; - Avaliar os resultados da vacinação;

- Acompanhar explorações com a doença ao longo das várias etapas; -Tirar conclusões relativamente às melhores técnicas de maneio.

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3. Trabalho Prático

3.1. Introdução

O trabalho foi desenvolvido a partir de uma OPP (Organização de Produtores Pecuários), a ACRIGA (Associação De Criadores de Gado). Esta associação trabalha com todas as explorações pecuárias pertencentes aos concelhos de Macedo de Cavaleiros, Mirandela e Alfândega da Fé, bem como algumas situadas em Vila Flor e Bragança (Fig.3.1).

Portugal é um país que possui importantes recursos genéticos destas espécies. Dentro das raças autóctones reconhecidas oficialmente, existem quinze raças de ovinos e seis de caprinos1_{. De acordo com o boletim estatístico de 2009, existiam em Portugal Continental} 72.249 explorações de ovinos e caprinos, com 2.638.268 animais. Do total de explorações, 19.246 estavam localizadas no Norte do país (aproximadamente 27%)2_.

No distrito de Bragança existem maioritariamente explorações de ovinos, uma vez que os caprinos são mais rejeitados pelas populações pois considera-se que “fazem mais estragos” (Barbosa, 2000).

As raças ovinas autóctones reconhecidas oficialmente são a Bordaleira Entre Douro Minho, a Campaniça, a Churra Algarvia, a Churra Badana, a Churra do Campo, a Churra Galega

1 _{Disponível em: http://www.dgv.min-}

agricultura.pt/portal/page/portal/DGV/genericos?generico=1324571&cboui=1324571; Acedido em: 22-09- 2016

2 _{Disponìvel em:}

file:///C:/Users/%C3%81lia/Desktop/Tese/Documentos/Boletim%20Estatistico%20DGV%202009.pdf; Acedido