Casos clínicos de paratuberculose em pequenos ruminantes no Distrito de Bragança

Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro

Casos Clínicos de Paratuberculose em Pequenos

Ruminantes no distrito de Bragança

Dissertação de Mestrado em Medicina Veterinária

Candidato

Ália Joana Albino dos Santos

Orientador

Professora Doutora Ana Cláudia Correia Coelho

III

Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro

Casos Clínicos de Paratuberculose em Pequenos

Ruminantes no distrito de Bragança

Dissertação de Mestrado em Medicina Veterinária

Candidato

Ália Joana Albino dos Santos

Orientador

Professora Doutora Ana Cláudia Correia Coelho

Composição do Júri

Presidente:

Prof. Doutor Filipe da Costa Silva, Departamento de Ciências Veterinárias

Vogais:

Prof. Doutor Nuno Francisco Fonte Santa Alegria, Departamento de Ciências

Veterinárias

Profª. Doutora Ana Cláudia Correia Coelho, Departamento de Ciências Veterinárias

V

Declaração

Nome: Ália Joana Albino dos Santos CC: 14212013

Contacto: 917788992

Correio Eletrónico: alia_dos_santos@hotmail.com

Designação do mestrado: Mestrado Integrado em Medicina Veterinária

Título da Dissertação de Mestrado em Medicina Veterinária: Casos Clínicos de

Paratuberculose em Pequenos Ruminantes no distrito de Bragança

Orientador: Professora Doutora Ana Cláudia Correia Coelho Ano de Conclusão: 2016

Declaro que esta dissertação de Mestrado é resultado da minha pesquisa e trabalho pessoal. O seu conteúdo é original e as fontes consultadas estão devidamente mencionadas no texto e na bibliografia final. Declaro ainda que este trabalho não foi apresentado em nenhuma outra instituição para obtenção de qualquer grau académico.

Vila Real, 14 de Outubro de 2016 Ália Joana Albino dos Santos

VII

Agradecimentos

Em primeiro lugar quero agradecer à Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro (UTAD), a instituição que escolhi para estudar e que me proporcionou condições para a minha formação académica.

À Professora Doutora Ana Cláudia Correia Coelho, orientadora da dissertação, por ter aceitado acompanhar o meu trabalho nesta fase final de curso. Pela forma como orientou o meu trabalho, por toda a ajuda, partilha de conhecimentos e total disponibilidade que sempre demonstrou.

Agradeço a todos os docentes do curso de Mestrado Integrado em Medicina Veterinária da e clínicos do Hospital Veterinário da UTAD Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro, por todos os conhecimentos partilhados durante este meu percurso académico

Agradeço, igualmente, à Associação de Criadores de Gado de Macedo de Cavaleiros, pelo apoio, colaboração prestada e condições de trabalho que me proporcionaram, sem as quais não seria possível a concretização deste projecto. Agradeço ao Dr. João Reis, à Dra. Maria João Garcia, sem nunca esquecer a D. Lúcia, o Sr. Neves e o Sr. Leonardo que sempre nos acompanharam nas saídas de campo. Obrigada pelo carinho, boa disposição e ajuda preciosa.

A Vila Real, pois só ela sabe como nos acolher, receber e guiar durante a melhor fase das nossas vidas, os tempos de Estudante.

A toda a enorme família de Medicina Veterinária, à qual eu tenho um orgulho enorme de pertencer.

À AAUTAD que foi uma segunda família em Vila Real, graças à qual pude viver o expoente máximo do espírito Académico. Obrigada, Pedro Romeu pela oportunidade.

À Ana Luísa e Sara, as melhores amigas e colegas de casa que eu poderia ter tido, obrigada pelos jantares, pelos cafés, pelos passeios, pelas noites intermináveis de estudo (e muitas vezes de conversa!). À Inês pelas horas de estudo, pelos apontamentos, pela companhia na cozinha (na comida!) e nos passeios. Ao Bruno por ser o meu “mano”, obrigada por todo o carinho. À Megui e Anita pelas conversas sem fim. Ao Rui pela amizade. À Laura pelas loucuras, pelos passeios noturnos e pelas quintas-feiras. À Dora, Teresa, Selma pelas noites infindáveis. Ao Flores e ao Torrão pela iniciação no Geocaching. Ao André, Artur, Pontinha e Zé pela boa disposição nas noites de estudo sem fim, mas também nas noites de diversão.

VIII

A todos e a cada um que ao longo destes anos contribuiu para que fossem os melhores da minha vida.

Á Carolina, Lídia, Lisa, Patricia, Tânia, pela amizade de uma vida, às quais peço desculpas pelas várias ausências e prometo futuramente compensar.

A ti Luís! Agradeço-te por toda a paciência, toda a compreensão, toda a ajuda, mas sobretudo por seres quem és! Não poderia ter tido mais sorte!

Ao meu irmão, Márcio por toda ajuda, encorajamento, apoio incondicional e por teres sido sempre uma referência ao longo do meu crescimento.

E claro um agradecimento muito sincero e profundo aos responsáveis por ter chegado aqui, a minha mãe, Amparo e ao meu pai, Duarte. Obrigado por serem as pessoas que são, por tudo o que me deram, por terem sempre lutado, por me ensinarem a lutar e por terem sempre acreditado em mim. Obrigado por todos os esforços que fizeram para que os vossos filhos tivessem um futuro melhor. Sem vocês não teria sido possível!

IX

Resumo

A paratuberculose, também denominada Doença de Johne, é uma doença de natureza infeciosa causada por Mycobacterium avium subespécie paratuberculosis (Map). Os ruminantes são as espécies maioritariamente afetadas, nos quais origina uma enterite crónica granulomatosa. O quadro clínico carateriza-se por um emagrecimento progressivo que pode ser fatal, acompanhado frequentemente de diarreia. O tratamento médico é raramente realizado, pois é dispendioso e pouco eficaz. Por essa razão, a vacinação é considerada o método de controlo mais eficaz.

O objetivo deste trabalho consistiu em desenvolver e consolidar os conhecimentos sobre a paratuberculose através do acompanhamento de casos clínicos.

Foram utilizados seis casos clínicos, dos quais dois já tinham um diagnóstico laboratorial positivo, nos quais apenas se realizou a vacinação, dois foram casos novos, em que se realizou a recolha de amostras e cujo diagnóstico de paratuberculose foi positivo, finalmente, os outros dois, foram casos em que havia a suspeita, no entanto a paratuberculose foi descartada após as análises laboratoriais.

O médico veterinário desempenha um papel muito importante nas explorações. O seu auxílio na suspeita, diagnóstico e tratamento é essencial. É importante que haja uma observação atenta dos animais para detetar os sinais clínicos e em seguida tentar diagnosticar ou descartar a infeção por Map. Nem sempre, apesar do quadro clínico ser compatível, é diagnosticada a paratuberculose. Caso esta seja detetada, a vacinação é o meio de controlo maioritariamente usado. O efeito da vacinação apesar de difícil de avaliar é maioritariamente benéfico.

Palavras-chave: Paratuberculose, ovinos, caprinos, Mycobacterium avium subespécie

XI

Abstract

Paratuberculosis, also known as Johne's disease, is an infectious disorder caused by

Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (Map). Ruminants are most affected by

this disease and as a result they develop a chronic granulomatous enteritis. The clinical presentation is characterized by a progressive weight loss, which can be fatal, often accompanied by diarrhea. Medical treatment is rarely used, because it is expensive and inneficient. For this reason, vaccination is considered the most efficient method of controlling this illness.

The aim of this work was to develop and consolidate the knowledge about paratuberculosis, which was achieved by monitoring and describing clinical cases of this disease.

Six cases were included in this dissertation, of which two had a previous positive diagnosis of paratuberculosis and only received vaccination, other two were new cases that were submitted to sampling and received a positive diagnosis, and finally, the last two cases were suspected to have this disorder, however the differential diagnosis of paratuberculosis was excluded after laboratory testing.

Veterinary practioners play a very important role on farms. Their assistance in suspicion, diagnosis and treatment is essential. It is important to have a close observation of the animals to detect the clinical signs and then try to diagnose or rule out Map infection. The positive diagnosis for paratuberculosis isn’t always obtained, even in cases with a similar clinical presentation. If this disease is detected, vaccination is the main control method used. The effect of vaccination, despite being difficult to evaluate, is mostly beneficial.

Keywords: Paratuberculosis, sheep, goats, Mycobacterium avium subspecies

XIII

Índice

1. Introdução ... 1 2. Revisão Bibliográfica... 3 2.1. Paratuberculose ... 3 2.1.1. História ... 3 2.1.2. Etiologia ... 3 2.1.2.1. Classificação Taxonómica ... 3 2.1.2.2. O género Mycobacterium ... 3

2.1.2.2.1. M. avium subespécie hominissuis (MAH)... 4

2.1.2.2.2. M. avium subespécie avium (MAA)... 4

2.1.2.2.3. M. avium subespécie silvaticum (MAS) ... 5

2.1.2.2.4. M. avium subespécie paratuberculosis (MAP) ... 5

2.1.2.3. Aplicação dos Postulados de Koch à Doença de Johne ... 5

2.1.3. Epidemiologia ... 6 2.1.3.1. Espécies suscetíveis ... 6 2.1.3.2. Fatores de risco ... 6 2.1.3.2.1. Maneio ... 6 2.1.3.2.2. Alimentação ... 7 2.1.3.2.3. Ambiente ... 8

2.1.3.2.4. Caraterísticas inerentes ao animal ... 9

2.1.3.3. Transmissão ... 10

2.1.3.4. Distribuição geográfica e prevalência ... 11

2.1.3.5. Importância económica ... 12

2.1.4. Patogenia ... 13

2.1.5. Imunologia ... 14

2.1.6. Quadro clínico e lesional ... 15

XIV 2.1.6.2. Lesões macroscópicas ... 16 2.1.6.3. Lesões microscópicas ... 16 2.1.7. Diagnóstico ... 16 2.1.7.1. Métodos de diagnóstico ... 16 2.1.7.1.1. Diagnóstico clínico-epidemiológico ... 16 2.1.7.1.2. Diagnóstico Anatomopatológico ... 16

2.1.7.1.3. Diagnóstico direto: Deteção do agente... 17

2.1.7.1.4. Técnicas moleculares ... 19

2.1.7.1.5. Diagnóstico indireto: Resposta imunitária do hospedeiro ... 20

2.1.7.2. Diagnóstico diferencial ... 23 2.1.8. Controlo e prevenção ... 24 2.1.8.1. Medidas preventivas ... 24 2.1.8.2. Vacinação ... 27 2.1.9. Tratamento ... 28 2.1.10. Potencial Zoonótico ... 30 2. Objetivos ... 33 3. Trabalho Prático ... 35 3.1. Introdução ... 35 3.2. Material e métodos ... 37 3.2.1. Animais e amostras ... 37

3.2.2. Observação de Sinais Clínicos... 37

3.2.3. Recolha de amostras e seu armazenamento ... 39

3.2.4. Realização do diagnóstico ... 40 3.2.5. Vacinação ... 41 3.3. Casos Clínicos ... 42 3.3.2. Caso Clínico 1 ... 43 3.3.3. Caso Clínico 2 ... 45 3.3.4. Caso Clínico 3 ... 48 3.3.5. Caso Clínico 4 ... 51 3.3.6. Caso Clínico 5 ... 55 3.3.7. Caso Clínico 6 ... 58 4. Discussão ... 61 5. Conclusão ... 65 Bibliografia... 66

XV

Índice de Figuras

Figura 3.1 – Mapa do distrito de Bragança ... 35

Figura 3.2 – Exemplar de ovino da raça Churra da Terra Quente ... 36

Figura 3.3 – Exemplar de caprino da raça serrana ... 36

Figura 3.4 – Posição correta da mão para avaliação do nível de condição corporal ... 38

Figura 3.5 – Níveis de condição corporal em ovelhas e cabras. ... 37

Figura 3.6 – Exemplo de animais classificados com Índice de Condição Corporal ... 38

Figura 3.7 – Zona peri-anal limpa. ... 39

Figura 3.8 – Zona peri-anal contaminada. ... 39

Figura 3.9 – Técnicas de recolha de sangue. ... 40

Figura 3.10 – Frasco de GUDAIR®, utilizado numa exploração ... 41

Figura 3.11 – Localização geográfica de Vilar Chão no Concelho de Alfandega da Fé. ... 43

Figura 3.12 – Localização geográfica de Soeima no Concelho de Alfandega da Fé. ... 45

Figura 3.13 – Animal cujo resultado inicial foi suspeito ... 46

Figura 3.14 – Outros animais considerados suspeitos ... 46

Figura 3.15 – Localização geográfica de Sambade no Concelho de Alfandega da Fé. ... 48

Figura 3.16 – Animal apresentando baixa condição corporal ... 49

Figura 3.17 – Realização da recolha de amostras ... 49

Figura 3.18 – Localização geográfica de Lagoa no Concelho de Macedo de Cavaleiros. ... 51

Figura 3.19 – Vacinação de um animal ... 52

Figura 3.20 – Alguns dos animais mais velhos, que apresentavam baixa condição corporal ... 53

Figura 3.21 – Localização geográfica de Talhas no Concelho de Macedo de Cavaleiros. ... 55

Figura 3.22 – Animal que se apresenta magro na exploração ... 56

Figura 3.23 – Animal que se apresentava fraco na exploração ... 56

Figura 3.24 – Recolha de amostras de sangue. ... 57

XVII

Índice de Quadros

Quadro 3.1. Quadro de intervenções do Caso Clínico 1 ... 44

Quadro 3.2. Quadro de intervenções do Caso Clínico 2 ... 47

Quadro 3.3. Quadro de intervenções do Caso Clínico 3 ... 50

Quadro 3.4. Quadro de intervenções do Caso Clínico 4 ... 53

Quadro 3.5. Quadro de intervenções do Caso Clínico 5 ... 57

XIX

Lista de Abreviaturas e Siglas

ACRIGA – Associação de Criadores de Gado Macedo de Cavaleiros ADN – Ácido Desixirribonucleico

ADS – Agrupamento de Defesa Sanitária AGID – Imunodifusão em Gel de Ágar ALT – Alanina aminotransferase

ANCRAS – Associação Nacional de Caprinicultores de Raça Serrana

AntiMapAc – Anticorpo específico para Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis ARN – Ácido Ribonucleico

AST – Aspartato aminotransferase ATP – Adenosina Trifosfato CK – Creatina Fosfoquinase DC – Doença de Crohn

FC – Fixação do Complemento

GALT – Sistema Linfóide associado ao intestino HIS – Hibridização in situ

IDR – Intradermorreação IFN-γ – Interferão Gama

Maa – Mycobacterium avium subsp. avium Mac – Mycobacterium avium. complex

Map – Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis Mas – Mycobacterium avium subsp. silvaticum OPP – Organização dos Produtores Pecuários PCR – Reação em cadeia da polimerase PPD – Derivado proteico purificado rARN – Ácido Ribonucleico Ribossoma SDH – Sorbitol desidrogenase

1

1. Introdução

Esta dissertação de mestrado foi realizada no âmbito do tema Doenças Infeciosas em animais de produção, dentro do qual foi direcionada para a Paratuberculose em pequenos ruminantes.

A paratuberculose, também denominada Doença de Johne, é uma doença de natureza infeciosa causada por Mycobacterium avium subespécie paratuberculosis (Map). Apesar de poder infetar outras espécies, são maioritariamente afetados os ruminantes, nos quais origina uma enterite crónica granulomatosa. O quadro clínico carateriza-se por um emagrecimento progressivo que pode ser fatal, acompanhado frequentemente de diarreia (Chiodini et al., 1984). O tratamento é raramente realizado, pois é dispendioso e pouco eficaz. (Harris e Barletta, 2001).

A importância da paratuberculose nos ruminantes domésticos tem sido demonstrada em diversos estudos, devido maioritariamente às perdas económicas que provoca. Os efeitos adversos da infecção incluem redução da produção do leite e da fertilidade, má condição corporal, mastites e mortalidade (Lombard, 2011; Radia et al., 2013).

A paratuberculose surgiu inicialmente na Europa e América do Norte mas está a tornar-se cada vez mais um problema global (Hermon-Taylor, 2009; Todd, 2014). Em Portugal, foi diagnosticada em 1961. Na região de Trás-os-Montes e Alto Douro, a paratuberculose ovina e caprina foi descrita pela primeira vez no ano de 1987. No entanto, os estudos de prevalência e distribuição de Map foram muito poucos desde então. Esta informação é útil para delinear medidas de controlo da infeção (Afonso, 1995; Coelho, 2006).

Existem vários testes disponíveis para estimar a prevalência. Os métodos serológicos, entre os quais o ELISA (Ensaio Imunoenzimático), têm a vantagem de ser fáceis e rápidos, mas só detetam a infecção nas fases tardias (Gilardoni et al., 2012). No entanto, constituem uma alternativa viável, com eficácia aceitável quando comparado com a cultura bacteriológica, uma vez que as estirpes ovinas e caprinas são particularmente difíceis de isolar por cultura (Pugh e Baird, 2012). Apesar disso, esta técnica continua a ser considerada como a de referência para o diagnóstico (Salgado et al., 2005). A deteção da sequência IS900 e a sua caracterização como específica de Map, têm constituído uma excelente forma de identificação desta espécie, mediante uma simples reacção de polimerização em cadeia (PCR), esta é uma das técnicas mais utilizadas visto detetar pequenas quantidades de ADN e ser muito mais rápida que a cultura (Collins et al., 1989; Li et al., 2005).

2 O potencial zoonótico do agente da paratuberculose tem vindo a ser estudado desde que foi feito o seu isolamento em alguns casos de doença de Crohn, uma enterocolite granulomatosa do homem cuja etiologia é ainda desconhecida. Apesar das várias hipóteses colocadas, até ao momento não existem dados suficientes que possam implicar esta micobactéria na doença (Chacon et al., 2004; Atreya et al., 2014; Naser et al., 2014). O objetivo deste trabalho é de desenvolver e consolidar conhecimentos sobre a paratuberculose através do acompanhamento de casos clínicos.

3

2. Revisão Bibliográfica

2.1. Paratuberculose 2.1.1. História

Os primeiros sinais de paratuberculose foram detetados no início do século XIX. Inicialmente foi reportada a presença de enterite em bovinos que apresentavam diarreia crónica, mas mais tarde, ao analisarem o intestino de animais que morreram desta enterite, observaram um espessamento e enrugamento incomum da mucosa intestinal. A doença foi posteriormente descrita, em 1895, na cidade Alemã de Dresden, por Johne e Frotingham que também detetaram a presença de bacilos álcool-ácido resistentes, sem no entanto os conseguirem distinguir dos bacilos da tuberculose, e por essa razão se achava que era uma forma intestinal da tuberculose. Em 1906, Bang reavaliou a doença recusando a hipótese de se tratar de tuberculose, nomeou-a de enterite pseudo-tuberculosa ou Doença de Johne. Entretanto, entre os anos de 1902 e 1908, a doença foi reportada em vários países europeus como Dinamarca, Alemanha, França, Noruega, Holanda, Bélgica e Suíça, assim como nos Estados Unidos. Finalmente em 1910, Twort isolou o agente dando-lhe o nome de Mycobacterium enteriditis

chronicae pseudotuberculosae bovis johne, que mais tarde viria a ser alterado para o nome

atual (Chiodini et al., 1984; Lombard, 2011).

Em Portugal, foi descrita pela primeira vez em 1961 por Nunes Petisca e seus colaboradores, numa exploração na zona de Lisboa. Em 1983, Cristina Vilela e Feliciano Reis diagnosticaram paratuberculose na zona do Alentejo, em caprinos. Mas só em 1987 é que a doença foi descrita em Trás-os-Montes por Ferreira Afonso. Neste mesmo ano, Manuel Lage, descreveu um caso de paratuberculose em ovinos, também na zona de Lisboa (Afonso, 1995).

2.1.2. Etiologia

2.1.2.1. Classificação Taxonómica

Mycobacterium avium subespécie paratuberculosis pertence ao super-reino Bacteria, e dentro

deste à divisão Firmicutes, divisão que inclui as bactérias Gram positivas. A classe é a Actinobacteria que contém as bactérias do grupo anterior e que apresentam um conteúdo em Guanina e Citosina acima dos 50% no seu ADN, que se subdivide na subclasse Actinobacteridae, a ordem é a Actinomyctales, localizando-se na subordem Corynebacterinae. A família Mycobacteriaceae é que o integra, tendo esta apenas o género

Mycobacterium (Juste et al., 2000).

4 O género Mycobacterium engloba as espécies M. tuberculosis, responsável pela tuberculose humana, M. leprae, causador da lepra, M. bovis, causador da tuberculose em bovinos e M.

avium, mais conhecido por causar doenças em aves e suínos, mas com uma subespécie, M. avium subespécie paratuberculosis causador da paratuberculose em outras espécies (Rastogi

et al., 2001).

Para a inclusão de bactérias neste género é essencial que apresente determinadas características, a álcool-ácido resistência, a presença de ácidos micólicos e o conteúdo de guanina e citosina entre 61 e 71% (Shinnick e Good, 1994; Juste et al., 2000).

Mycobacterium avium é uma das espécies do complexo Mycobacterium avium e inclui 4

subespécies, M. avium subespécie hominissuis, M. avium subespécie avium, M. avium subespécie silvaticum e M. avium subespécie paratuberculosis. Cada uma destas subespécies, apesar de próximas, representam organismos diferentes dotados de patogenicidade específica e uma gama de hospedeiros característicos. (Rindi e Garzelli, 2014)

2.1.2.2.1. M. avium subespécie hominissuis (MAH)

É um agente patogénico ambiental oportunista que afeta o Homem e os suínos, podendo ser ocasionalmente isolado noutros animais. O seu reservatório natural é o solo e a água, podendo também sobreviver no interior da Amoeba. A fonte de infeção varia de acordo com o hospedeiro, no Homem ocorre sobretudo devido à ingestão de água ou contacto com aerossóis (Falkinham, 2013). No porco, por sua vez, pensa-se que a infeção se deve à ingestão de água, comida, ao material das camas, solo, águas residuais, invertebrados ou outros materiais contaminados (Matlova et al., 2005). M. avium subespécie hominissuis é considerado o membro do complexo Mycobacterium avium mais importante para o Homem. Em indivíduos imunodeprimidos pode causar infeções graves, no caso de indivíduos imunocompetentes, pode causar infeções pulmonares, linfadenite cervical e infeções dos tecidos moles. Em suínos, causa normalmente lesões localizadas a nível dos linfonodos (Vaerewijck et al., 2005; Pate et al., 2008).

2.1.2.2.2. M. avium subespécie avium (MAA)

Esta subespécie tem como reservatório principal as aves, causando-lhes uma doença semelhante à tuberculose. É uma doença crónica, mas que muitas vezes não apresenta sinais de infeção. Pode também infetar uma grande variedade de mamíferos incluindo o Homem onde é raramente isolado (Thegerström et al., 2005). A transmissão é feita por ingestão após contaminação fecal do ambiente (Schrenzel et al., 2008).

5 2.1.2.2.3. M. avium subespécie silvaticum (MAS)

Taxonomicamente próximo de M. avium subespécie avium, é um agente patogénico de aves, que praticamente só afeta o pombo-torcaz, no qual causa uma doença semelhante à tuberculose (Thorel et al., 1990). Está também descrito em estudos experimentais que pode causar enterite crónica em mamíferos (Matthews e McDiarmid, 1979; Rindi e Garzelli, 2014). Em cavalos, foram já descritas lesões caseosas, granulomatosas e necróticas (Chiers et al., 2012).

2.1.2.2.4. M. avium subespécie paratuberculosis (MAP)

Mycobacterium avium subespécie paratuberculosis (MAP) é uma micobactéria Gram positiva

e álcool-ácido resistente. Esta micobactéria apresenta pequenas dimensões, aproximadamente 0,5 µm por 1 a 2 µm (Todd, 2014).

O MAP compensa a sua incapacidade em assimilar ferro e se replicar no ambiente através da produção de uma parede celular extra, mais espessa e cerosa que prolonga a sobrevivência até que ocorra a ingestão por um hospedeiro suscetível. Apresenta não só resistência ao ambiente mas também à temperatura. Por ser mais tolerante à temperatura, MAP consegue resistir à pasteurização. Como as outras micobactérias, consegue replicar-se no interior dos macrófagos do hospedeiro, conseguindo sobreviver aos seus efeitos anti bacterianos e ainda causar doença (Todd, 2014) .

Na maioria dos isolamentos, necessita da micobactina, que é um sideróforo, como fator de crescimento, pois como já foi referido não é capaz de assimilar ferro. O seu crescimento é lento. Para o aparecimento de colónias visíveis requer de 8 a 12 semanas de incubação a 37ºC o que por vezes o torna difícil de identificar (Hirsh, 1994; Todd, 2014).

É causador da paratuberculose, também conhecida como Doença de Johne. Os organismos de M. avium subespécie paratuberculosis encontram-se classificados em 2 grupos que refletem sobretudo a especificidade para o hospedeiro, o tipo I ou S (sheep) por se encontrar maioritariamente em ovinos e o tipo II ou C (cattle) por ser o mais encontrado em bovinos, mas também em caprinos, sendo que estes também podem ser infetado pelo outro tipo (Collins et al., 1990). Esta classificação foi alterada por métodos de genotipagem que mostraram a existência de um tipo III ou intermédio que é considerado um subtipo do tipo I. Por sua vez surgiu também um subtipo do tipo II, o tipo B (bison) isolado a partir de um bisonte (Whittington et al., 2001). M. avium subespécie paratuberculosis isolado a partir de seres humanos apresenta maior homogeneidade genómica com o tipo II (Paustian et al., 2008).

6 Os Postulados de Koch são usados para estabelecer a etiologia de uma doença. No caso da Doença de Johne concluiu-se que o agente da doença era Map, depois de este cumprir os critérios estabelecidos. O primeiro postulado refere que o agente deve ser encontrado em todos os casos de doença. Em 1895, Johne e Frotingham analisaram os intestinos de uma vaca que não conseguia ganhar peso e acabou mesmo por morrer. Detetaram a presença de bacilos álcool-ácido resistentes, estabelecendo que este bacilo poderia ser isolado em animais infetados. Os postulados de Koch também requerem que se consiga fazer crescer o agente numa cultura pura, o que foi conseguido por F. Twort após ter isolado o bacilo em 1910. De seguida era necessário reintroduzir o bacilo num hospedeiro sensível, com o objetivo de desenvolver a doença. Este objetivo foi também atingido por Twort em 1914. No entanto neste ponto é difícil retirar conclusões uma vez que ele recorreu a animais de laboratório. Assim, só em 1933 é que Hagan e Zeissig reportaram a infeção de um rebanho experimentalmente. (Chiodini, 1993; Chacon et al., 2004)

2.1.3. Epidemiologia

2.1.3.1. Espécies suscetíveis

MAP afeta principalmente ruminantes (Stevenson et al., 2009). No entanto, pode também infetar outros animais domésticos tais como o cão e o gato (Kukanich et al., 2013), cavalo (Rindi e Garzelli, 2014) e o porco (Chacon et al., 2004). Num estudo em animais selvagens, foram identificados como portadores de MAP a raposa, o furão, a doninha, o corvo, a gralha, o rato e ratazana, a lebre e o texugo (Beard et al., 2001), assim como também já foi detetado em ursos (Kopecna et al., 2006) e em primatas não humanos (Singh et al., 2011).

Dentro dos ruminantes, pensa-se que os caprinos são mais suscetíveis à infeção por MAP e é mais provável que desenvolvam sinais clínicos da doença do que os ovinos e os bovinos, sendo os bovinos considerados os mais resistentes ao desenvolvimento da doença clinica (Stewart et al., 2007).

2.1.3.2. Fatores de risco 2.1.3.2.1. Maneio

São várias as práticas de maneio nas explorações que podem colocar em risco a saúde de um animal, uma vez que aumentam a possibilidade de infeção dos animais. Em primeiro lugar, as práticas de higiene, tanto a nível dos animais como a nível do seu ambiente afetam o risco de infeção pelo Map (Wolf et al., 2016). Os fatores que influenciam diretamente a infeção são o contacto entre animais de diferentes idades, sejam eles jovens, pré-adultos ou adultos, uma vez que aumenta o contato entre animais disseminadores e animais mais suscetíveis. A

7 própria dimensão do rebanho pode influenciar. Os próprios pastos podem ajudar na disseminação do agente, se a presença de fezes for elevada e sobretudo se o mesmo pasto for usado por vários rebanhos. No entanto, a fase que requer mais preocupação é o parto, tanto o período antes, como durante e depois. É importante tomar medidas sanitárias antes do parto, vigiar as fêmeas gestantes, e após o parto, monitorizar o tempo durante o qual os recém-nascidos são deixados com as mães. O leite e colostro que lhe é fornecido e como é fornecido também tem muita importância. Outra situação que ocorre muitas vezes e não é recomendado, é o uso das chamadas maternidades para estabular animais doentes (Berghaus et al., 2005) . Assim como, a utilização dos mesmos utensílios para diferentes efeitos, desde fornecer alimento até retirar estrume (Berghaus et al., 2005; Wolf et al., 2016). Práticas que induzam stresse ao animal, tais como, a realização da tosquia no Inverno, também podem predispor à infeção (Lugton, 2004a).

A origem dos animais de reposição é também considerado um fator importante. A compra, mesmo que a partir de origens conhecidas, é considerado um fator de risco para a introdução da doença (Cetinkaya et al., 1997). Claro que, se a introdução for de animais livres da infeção, o efeito é benéfico (Lugton, 2004a). No entanto, não é fácil conseguir encontrar animais que seja garantido estarem livres da doença, uma vez que economicamente não é viável testar os animais antes (Rangel et al., 2015). O ideal seria a reposição com animais criados na própria exploração, mas nem sempre é possível e por vezes é necessário introduzir alguma variabilidade genética.

2.1.3.2.2. Alimentação

Tanto o concentrado como o feno estão associados com uma diminuição do risco de doença. Pensa-se mesmo que o feno tem um efeito protetor. A dieta é um fator importante, sobretudo numa fase mais precoce da vida. Está descrito que melhorar os padrões de alimentação ajuda a reduzir a incidência da paratuberculose (Cetinkaya et al., 1997).

Os micronutrientes são importantes para a manutenção de um sistema imunitário em bom funcionamento (Downs et al., 2008). A deficiência ou o desequilíbrio de micronutrientes pode estimular a progressão da paratuberculose e induzir a expressão clínica da doença (Lugton, 2004b). Por outro lado, o fornecimento de bons suplementos alimentares está ligada a uma baixa expressão de sinais clínicos (Cetinkaya et al., 1997).

Altas concentrações de ferro são encontradas muitas vezes nos lençóis freáticos e nos furos de água (Lugton, 2004a). Um estudo concluiu que o aumento do ferro no solo está associado com o aumento de testes ELISA positivos em rebanhos (Johnson-Ifearulundu e Kaneene, 1999). Pensa-se que o ferro não só permite a expressão dos sinais clínicos como também

8 permite a sobrevivência ou o crescimento de Map no ambiente e portanto aumenta a probabilidade de transmissão (Lugton, 2004b).

A deficiência em cobre foi já associada com paratuberculose. As deficiências em melanina e em elastina são considerados sinais clínicos da carência em cobre, uma vez que estas estão relacionadas com enzimas que contem cobre. Assim a despigmentação muitas vezes associada à paratuberculose, pode ser devido a carência deste elemento. Também a degenerescência das fibras de elastina e deposição de ferro, que provocam a degeneração da aorta média, se encontra ligada a casos clínicos de paratuberculose. As lesões na aorta desenvolvem-se independentemente do estado da doença (Majeed e Goudswaard, 1971; Lugton, 2004b).

As concentrações no soro de cálcio, magnésio, fósforo e selénio, é mais baixa em animais clinicamente afetados. Sendo que, o grau de hipocalcémia está diretamente relacionado com a gravidade da doença. As concentrações de cálcio e o magnésio diminuídas podem-se dever à interferência com a absorção intestinal. (Jones e Kay, 1996; Lugton, 2004b) Em contrapartida, o molibdénio, tal como o ferro, aparecem associados à paratuberculose em excesso. (Lugton, 2004b)

A elevada mortalidade associada a solos arenosos evidencia que a expressão clínica está relacionada com deficiências ou desequilíbrios nutricionais (Lugton, 2004a).

Assim, parece ser necessário uma alimentação completa que contenha todos os micronutrientes essenciais nas proporções adequadas às necessidades do animal, para prevenir a evolução da doença ou regredir as lesões. Embora não haja evidências, que um micronutriente seja causador de sinais clínicos ou de progressão da doença, acredita-se que todos os micronutrientes e outros fatores nutricionais possam estar envolvidos.

Também a água utilizada tem influência, não só pela presença ou ausência de certos micronutrientes, mas também pela sua contaminação, no caso de águas abertas. No entanto, o uso de águas canalizadas pode não contribuir para a melhoria desta situação uma vez que os bebedouros são facilmente contaminados (Daniels et al., 2002).

2.1.3.2.3. Ambiente

Os solos mais arenosos e ácidos tem menor fertilidade e maior probabilidade de infeção do rebanho, por outro lado, os solos mais alcalinos e argilosos são mais férteis e a probabilidade de infeção é mais reduzida (Lugton, 2004a, 2004b). Os solos mais inférteis estão também mais associados à aplicação de estrume como fertilizante, podendo esta ser uma forma de

9 disseminação do agente, direta ou indireta (pela contaminação das águas) (Daniels et al., 2002).

Os veados são suscetíveis à paratuberculose, assim pensa-se que o contacto entre eles e rebanhos, nas explorações ou simplesmente no uso de pastos por onde eles passaram pode ser um fator de maior risco (Cetinkaya et al., 1997). O veado é considerado um reservatório de Map para os animais domésticos (Chiodini e Van Kruiningen, 1983), assim como o coelho (Daniels et al., 2001) e roedores cujas fezes contaminam alimento armazenado (Daniels e Hutchings, 2001).

2.1.3.2.4. Caraterísticas inerentes ao animal

São vários os estudos que indicam que animais jovens são mais suscetíveis à infeção que os adultos. No entanto, animais mais velhos que sejam expostos continuamente ao agente, podem adquirir a infeção progressivamente (Dennis et al., 2011). Esta maior suscetibilidade está relacionada com a presença de um grande número de Placas de Peyer no íleo, que são transitórias, diminuindo após o primeiro ano de vida, em animais jovens o que garante a existência de um maior número de células-M, que funcionam como porta de entrada para a infeção. Esta maior suscetibilidade deve-se também ao facto de estes animais jovens terem ainda o sistema imunitário em desenvolvimento (Koets et al., 2015). A mortalidade, por sua vez, está descrita como sendo mais elevada em animais mais velhos (com mais de cinco anos de idade) e mais baixa em animais muito jovens (Hemalatha et al., 2013). Sendo que na maioria das explorações, as perdas ocorrem sobretudo no quinto e sexto ano de vida dos animais (Lugton, 2004a).

Existem raças nas quais é mais provável observar a doença, no entanto, esta relação não esta bem esclarecida, isto é, não está bem definido se determinada raça tem realmente maior prevalência da infeção ou se simplesmente são mais suscetíveis a desenvolver a doença clínica (Cetinkaya et al., 1997). Uma das situações onde se verifica esta predisposição/suscetibilidade é nas ovelhas Merino de lã fina (Lugton, 2004a). Num outro estudo retrospetivo em ovinos realizado na Índia, a conclusão retirada foi que que as raças locais eram mais suscetíveis à doença do que raças exóticas (Hemalatha et al., 2013). Este mesmo estudo na Índia, também concluiu que as fêmeas são mais suscetíveis que os machos (Hemalatha et al., 2013).

Sabe-se que os traços genéticos têm influência na resposta dos animais à infeção, genes associados com a suscetibilidade e com a resistência podem alterar a forma como o organismo responde à infeção (Mortier et al., 2015).

10 2.1.3.3. Transmissão

A infeção dos animais ocorre numa fase precoce da vida por ingestão oral de Map (Sweeney, 1996), sendo que a maioria dos autores concorda que este é o principal mecanismo de transmissão, a via feco-oral (Clarke, 1997; Lombard, 2011) uma vez que a origem dos microrganismos são sobretudo as fezes de outros animais, sem esquecer outras fontes de contaminação (Chiodini et al., 1984; Sweeney, 1996). Apesar de inicialmente se considerar que apenas ocorria transmissão de adultos para jovens, a transmissão entre jovens também é possível, ainda que em menor grau (van Roermund et al., 2007).

A gravidade e a progressão da doença dependem da quantidade de microrganismos a que o animal é exposto e da sua idade. Não é necessária uma dose muito elevada para que se estabeleça uma infeção num animal jovem, mas por outro lado, é possível ultrapassar a resistência de um animal adulto usando uma dose elevada de organismos (Sweeney, 1996). Outra potencial fonte de transmissão horizontal poderá ser a transmissão venérea, através do sémen ou mesmo o transplante de embriões, mas estas vias são ainda consideradas raras (Kruip et al., 2003). A excreção direta no leite e colostro não devem ser ignoradas (Nauta e van der Giessen, 1998; Sweeney, 1996). A transmissão vertical, transmissão in utero ou transplacentária já foi descrita (Sweeney, 1996; Berghaus et al., 2005; Lombard, 2011). Outro modelo refere uma transmissão indireta a partir do ambiente tendo em conta a capacidade de Map de sobreviver no ambiente (Marcé et al., 2010).

A presença de Map em linfonodos extraintestinais, no leite, no fígado, no baço, no sémen, nos testículos, nos epidídimos, na vesicula seminal, na glândula mamária, no útero e em outros órgãos parenquimatosos de bovinos e em tecidos similares de ovinos, caprinos, ruminantes selvagens e primatas, constitui uma evidência de que ocorre a disseminação de MAP para além do intestino. Pensa-se que esta disseminação no organismo pode ocorrer por via hemática ou linfática. A componente sistémica, aqui descrita constitui mais uma indicação de que o feto corre o risco de infeção (Pavlik et al., 2000; Ayele et al., 2004).

Para estudar esta transmissão in utero e através do leite, recorreu-se a ovelhas gestantes pertencentes a rebanhos positivos, e a diferentes grupos de estudo. Um grupo em que se testasse a transmissão in utero, outro para testar a transmissão no leite e outro que combinasse as duas situações. Apesar de ser considerado o leite e o colostro uma importante via de transmissão perinatal, os animais que aparentemente estavam mais infetados eram os do grupo onde ambas as formas de transmissão fossem possíveis, intrauterina e pelo colostro/leite. O que nos coloca perante uma hipótese de uma rota de transmissão combinada (Verin et al., 2016).

11 A percentagem de fetos infetados descritos não é muito elevada e são na sua maioria fetos cujas mães apresentam sinais clínicos, os casos em que a mãe tem uma infeção subclínica são raros. É difícil, no entanto, de prever a evolução destes casos, isto é, se se vão tornar portadores subclínicos, se se tornam casos clínicos ou se com a maturação do sistema imunitário se desenvolve algum tipo de tolerância ou se torna possível eliminar a infeção (Lambeth et al., 2004).

2.1.3.4. Distribuição geográfica e prevalência

A doença de Johne foi reconhecida pela primeira vez à pouco mais de 100 anos na Europa e na América do Norte. Apesar de inicialmente se ter disseminado para regiões de baixa incidência, cada vez mais se está a tornar num problema global (Hermon-Taylor, 2009; Todd, 2014) .

Os estudos epidemiológicos sobre Map são dificultados pelo facto dos testes de diagnóstico não serem capazes de detetar estadios precoces da infeção (Robins et al., 2015).

A maioria dos trabalhos existentes estão focados em bovinos, sendo a prevalência de Map em outras espécies menos conhecida. Os estudos indicam que Map é frequente tanto em bovinos de carne, como de leite, havendo no entanto, muita variabilidade entre estudos (Hruska et al., 2011).

Apenas existem investigações sobre a prevalência de paratuberculose em caprinos e ovinos, na Europa, Islândia, África do Sul, Nova Zelândia e Austrália, pois é onde a produção de pequenos ruminantes é mais importante (Stehman, 1996; Coelho, 2006).

Em Portugal muito poucos estudos foram efetuados para estimar a prevalência da doença. Em 1984, encontrou-se uma seroprevalência de 10,2% na área de Vouzela. No Alentejo, 7,8%-10,6% de ovinos e 18% das explorações reagiram positivamente ao teste ELISA, num estudo realizado no ano de 2002. Mais recentemente, em 2004, um estudo definiu a seropositividade em 27%, em rebanhos de ovinos e caprinos na área de Lisboa (Coelho, 2006).

Os estudos de paratuberculose bovina na Europa indicam que a prevalência deve variar de 7 a 55% (Manning e Collins, 2001). Em França, na região de Yonne, 3,3% dos bovinos apresentaram resultado positivo, sendo a seroprevalência por exploração de 68% (Petit, 2001). Na Holanda, os resultados apontaram para 54,7% de rebanhos positivos aos testes serológicos (ELISA), num estudo que incluía apenas explorações leiteiras (Muskens et al., 2000). Na Bélgica, a pesquisa realizada incluiu tanto bovinos de carne como de leite, os resultados obtidos indicavam uma prevalência individual de 0,87% e no rebanho de 18%.

12 Apesar da dificuldade, tentou-se fazer uma estimativa da verdadeira prevalência, aumentando a especificidade dos rebanhos, para isso eliminou-se rebanhos com apenas um teste positivo, a não ser que eles tivessem evidências da doença. Assim, definiu-se como sendo a verdadeira prevalência de 6%, sendo que detetaram variações entre os tipos de explorações, as leiteiras (10%), as de carne (3%) e as que possuem os dois tipos (11%) (Boelaert et al., 2000). Uma pesquisa em tanques de leite realizada na Suíça, 24% das amostras de ovinos e 23% das amostras de caprinos foram positivos para Map, o que indica que existe uma ampla distribuição de infeções subclínicas por Map no país (Muehlherr et al., 2003). Existe um estudo que pesquisou a prevalência de Map em leite em pó para crianças. O estudo incluiu 51 produtos de 10 fabricantes que operam em sete países da Europa. O teste selecionado foi a PCR quantitativa em tempo real. Os resultados obtidos mostraram que em 18 das amostras foram encontradas de 48 a 32 500 células Map por grama de leite em pó, sendo que eram 4 as amostras que apresentavam mais de 10 000 células Map por grama de leite em pó. Apesar de não ficarem imediatamente infetados, o consumo deste leite por bebés parece desencadear doenças inflamatórias crónicas, tais como a Doença de Crohn (DC) (Hruska et al., 2011). Na Califórnia, EUA, o estudo realizado envolveu bovinos de leite e o resultado da seroprevalência global foi de 9,4%, sendo neste caso detetadas variações de acordo com a região dos rebanhos (Adaska e Anderson, 2003). Já na Austrália, o estudo realizado em ovelhas indicou que 2,4 a 4,4% dos rebanhos possam estar infetados (Sergeant e Baldock, 2002), mas a pesquisa em bovinos indica que a prevalência é mais elevada, variando entre 9 e 22% (Manning e Collins, 2001).

Em muitas destas situações encontra-se uma elevada prevalência no rebanho, mas baixa a nível individual, isto porque muitas vezes apenas um teste no rebanho é positivo. O que constitui um problema no caso de falsos positivos. É difícil tirar conclusões devido aos diferentes métodos usados. Sendo que a maioria apresenta baixa sensibilidade.

2.1.3.5. Importância económica

As perdas económicas decorrentes da paratuberculose podem ser devidas a várias causas. São difíceis de contabilizar uma vez que muitas vezes a paratuberculose não é conhecida como a causa (Lombard, 2011). No caso de animais de leite, as perdas são bem visíveis a nível da diminuição da produção leiteira. Já nos animais de carne, há perdas no valor dos animais no matadouro, sobretudo nos animais que apresentem já sinais clínicos (Radia et al., 2013). A diminuição de condição corporal ou a incapacidade de ganhar peso corporal leva muitas vezes a que seja necessário refugar os animais mais cedo (Lombard, 2011). Associado a isto, ocorrem também casos de mortalidade, o que por si só traz perdas, mas mais ainda quando se junta a necessidade de repor o efetivo. A paratuberculose tem também sido

13 associada a problemas reprodutivos, casos de infertilidade e outras doenças como as mastites. Existem ainda outras despesas relacionadas com os custos dos testes de diagnóstico e recurso a serviços veterinários (Garcia e Shalloo, 2015). O facto de haver perdas económicas é o maior desencadeador da necessidade de adotar um programa de controlo, no entanto nem sempre se sabe se é economicamente rentável a sua aplicação uma vez que pode também requerer custos (Lombard, 2011).

O impacto pode ser variável, uma vez que depende de vários fatores, tais como, a prevalência, a área geográfica, a idade dos animais afetados, o tipo de sistema de produção, o tamanho do rebanho, entre outros. Para estimar o impacto deve ser tomado em conta os efeitos adversos na saúde animal, o bem-estar e a rentabilidade do próprio negócio (Garcia e Shalloo, 2015).

2.1.4. Patogenia

As placas de Peyer constituem um tecido linfóide secundário cuja função é desencadear uma resposta imunitária adaptativa. Na região do intestino em que elas existem, existem também as células M, células epiteliais especializadas, que captam os antigénios para as Placas de Peyer (Reboldi e Cyster, 2016).

Assim, após exposição oral, Map é captado pelas células M que recobrem as placas de Peyer no íleo. Em seguida, os macrófagos sub-epiteliais e intra-epiteliais da lâmina própria fagocitam os bacilos que são expelidos pelas células M (Momotani et al., 1988).

Desenvolve-se uma enterite granulomatosa crónica, quando se acumulam células epiteliais contendo inúmeros bacilos de Map (lesões multibacilares ou lepromatosas), no entanto, em alguns animais, os bacilos podem não ser numerosos nas lesões (lesões paucibacilares ou tuberculóides) (Clarke, 1997; Whittington e Windsor, 2009).

A quantidade de micobactérias no interior das lesões é diretamente proporcional ao estadio da doença, ou seja, estadios mais graves são multibacilares, enquanto que, estadios mais leves ou moderados são paucibacilares (Dennis et al., 2011).

A variabilidade de lesões observadas podem ser explicadas pelo nível de infeção. A enterite paucibacilar leve e moderada que pode ser associada às lesões mais precoces, o que constitui uma resposta inicial comum. Pode, no entanto, progredir posteriormente para enterite multibacilar severa (Dennis et al., 2011).

As lesões intestinais ocorrem predominantemente na lâmina própria do intestino delgado assim como, nos linfonodos drenantes dessa área (Koets et al., 2015). No entanto, a localização primária das lesões tem sido muito discutida e pensa-se que possa variar com a

14 idade do animal uma vez que o tecido linfoide das Placas de Peyer varia tanto anatómica como imunologicamente de jovens para adultos (McGregor et al., 2012).

A maioria dos animais que morrem devido a infeção por Map apresentam idades entre 18 meses e 5 anos, dependendo de inúmeros fatores, tais como o nível e o número de exposições, a patogenicidade do organismo e os fatores de stresse e ambientais (Whittington e Sergeant, 2001; McGregor et al., 2012). No entanto, as mortes podem ocorrer mais cedo e mais frequentemente em situações de elevada prevalência. A mortalidade devido à paratuberculose encontra-se muito ligada à dose de exposição, havendo uma tendência para as taxas de mortalidade serem mais elevadas quando os animais são expostos quando jovens comparando com a exposição em adultos (McGregor et al., 2012).

2.1.5. Imunologia

A progressão da doença está relacionada com uma transição na resposta imunitária, havendo uma substituição de células Th1 por células Th2. Esta teoria baseia-se no facto de quando temos uma enterite paucibacilar leve ou moderada, a resposta imunitária é sobretudo mediada por células, sendo a resposta humoral fraca. Em contrapartida, quando evolui para enterite multibacilar, observa-se sobretudo a resposta humoral e a resposta mediada por células é menor (Dennis et al., 2011).

Inicialmente, a resposta imunitária mediada por células limita o organismo, mas acaba por entrar em declínio e permite o desenvolvimento da forma multibacilar. Os anticorpos séricos são detetados em estados mais tardios da doença. Posteriormente, os animais podem disseminar Map nas fezes. (Whittington e Windsor, 2009).

Estas lesões levam a mudanças na mucosa intestinal, o que resulta em desperdícios alimentares devido à má absorção de nutrientes ou perda de proteínas (Dennis et al., 2011). Quando as lesões evoluem, atravessando várias etapas, acabam por se tornar em lesões graves que estão quase sempre ligadas à excreção do agente. Existem, no entanto, animais que se encontram a excretar mas que não apresentam lesões, e por isso considera-se que estiveram expostos ao agente mas que tiveram uma resposta imunitária bem sucedida, que fez com que a infeção não persistisse, nem se desenvolvesse. Estas variações em resposta à exposição não é totalmente compreendida mas pensa-se que seja multifatorial, e envolve tanto a genética do animal como fatores inerentes ao próprio agente (McGregor et al., 2012). Suspeita-se que alguns animais têm a capacidade de eliminar Map, apesar de não estar confirmado. O que é mais credível é que o animal, apesar de não ficar livre da infeção, consegue que as lesões causadas pela doença regridam (Dennis et al., 2011).

15 Além disso, existem alguns animais que estando continuamente expostos, a infeção nunca é detetada, o que sugere que alguns animais possam ser resistentes à infeção (Dennis et al., 2011).

2.1.6. Quadro clínico e lesional 2.1.6.1. Sinais clínicos

O sinal clínico mais representativo da doença é a perda de condição corporal, não havendo outros sinais específicos. Além disso, ao contrário da doença em bovinos, em pequenos ruminantes, a diarreia intermitente não é um achado comum, apesar de em casos avançados as fezes poderem surgir com uma consistência mais mole e sem a forma característica (Kimberling, 1988). Os animais apresentam inicialmente uma incapacidade em crescer ou ganhar peso apesar de terem suficiente fornecimento de alimento com um apetite normal, ou ocasionalmente, até aumentado (Whitlock e Buergelt, 1996) e não apresentarem doença aparente. Esta situação evolui posteriormente para emaciação e fraqueza. A temperatura corporal varia, tendo episódios de elevação (Kimberling, 1988). A sede também aparece vulgarmente aumentada (Whitlock e Buergelt, 1996). A nível hematológico pode revelar anemia, hipoproteinemia e níveis sanguíneos de cálcio e magnésio no sangue diminuídos. Eventualmente, a maioria dos animais acabam por morrer (Kimberling, 1988).

Num estudo realizado em cabras, em que Map foi inoculado em 27 animais e 3 deles desenvolveram sinais clínicos, dos quais dois animais apresentaram diarreia não tratável e, o outro animal, sinais neurológicos (Köhler et al., 2015).

Alguns autores, como Whitlock e Buergelt, classificam os animais com paratuberculose em diferentes estadios de acordo com a gravidade dos sinais clínicos. O primeiro estadio equivale à doença silenciosa, que inclui maioritariamente animais jovens (idade inferior a 2 anos), que não manifestam evidência de infeção. O segundo estadio, corresponde à doença subclínica, na sua maioria adultos, são portadores que apesar de não apresentarem evidências da doença, podem ter anticorpos detetáveis. No entanto, na sua generalidade a infeção não é detetada com nenhuma técnica considerada rentável. A maioria destes animais evolui depois para o terceiro estadio, isto é, a doença clínica. Onde surgem os sinais clínicos iniciais, perda de peso com apetite normal e diarreia intermitente. Por último, o quarto estadio, equivalente à doença clinica avançada, onde os animais vão ficando cada vez mais fracos, letárgicos e emaciados, nesta fase observa-se o edema intermandibular devido à hipoproteinemia. A caquexia e a diarreia muito fluida caracterizam o estadio terminal da doença (Whitlock e Buergelt, 1996; Tiwari et al., 2006).

16 2.1.6.2. Lesões macroscópicas

As lesões mais específicas localizam-se a nível da válvula ileocecal e no íleo, bem como nos linfonodos associados. Nestes locais, observa-se uma mucosa engrossada com pregas transversais que se mantém mesmo com a tração do intestino. Os linfonodos por sua vez aparecem hipertrofiados e edematosos. Em casos mais avançados, a perda de depósitos gordos e atrofia serosa, característicos da caquexia são também vulgares. Menos frequentemente surgem calcificações no endocárdio e na aorta (Coelho et al., 2007).

2.1.6.3. Lesões microscópicas

As lesões histopatológicas são caracterizadas por células gigantes tipo Langhans e agrupamentos de macrófagos epitelióides. Quando presente, o bacilo de Map encontra-se mais facilmente no citoplasma das células gigantes tipo Langhans. A nível das vilosidades intestinais, pode-se também encontrar um exsudado inflamatório granulomatoso (Coelho et al., 2007).

2.1.7. Diagnóstico

2.1.7.1. Métodos de diagnóstico

De um modo geral, os métodos de diagnóstico podem ser divididos em dois grupos. Um dos grupos contém os métodos que detetam o microrganismo ou o seu ADN, enquanto o outro se baseia em detetar uma reação específica do hospedeiro contra os antigénios de Map (Chacon et al., 2004).

2.1.7.1.1. Diagnóstico clínico-epidemiológico

Este diagnóstico baseia-se em baseia-se em critérios clínicos e epidemiológicos. Os critérios epidemiológicos são bastante aleatórios uma vez que a infeção está bastante difundida. Os critérios clínicos são os sinais clínicos, que permitem suspeitar da doença (Brugère-Picoux, 1987). No entanto, os sinais clínicos apresentados pelos ovinos e caprinos são insuficientes para estabelecer um diagnóstico, mas determinadas características podem encaminhar o veterinário para um diagnóstico presuntivo (Coelho et al., 2007).

2.1.7.1.2. Diagnóstico Anatomopatológico Diagnóstico Macroscópico

Existem várias lesões macroscópicas bastante características que em animais com sinais clínicos permitem suspeitar de infeção por Map, no entanto, a sua ausência não exclui a possibilidade desta doença. As lesões mais específicas localizam-se a nível da válvula

17 íleocecal e no íleo, bem como nos linfonodos associados, como já foi anteriormente descrito (Coelho et al., 2007).

Diagnóstico Histopatológico

A nível histopatológico as lesões podem ser facilmente observadas, com colorações como hematoxilina-eosina (HE), que pode ser complementada com a técnica de Ziehl-Neelsen (ZN) para observar as bactérias álcool-ácido resistentes que se encontram associadas às lesões (Coelho et al., 2007). O uso do corante auramina-rodamina está também descrito (Jeyanathan et al., 2006).

Tanto na análise de amostras coradas com ZN como com auramina-rodamina, as micobactérias, quando individualizadas, apenas podem ser observadas com certeza usando uma ampliação x1000 com óleo de imersão, no entanto, no casa de formarem agregados, é possível observá-los a uma ampliação de x400 (Jeyanathan et al., 2006).

A vantagem do diagnóstico anatomopatológico ou histopatológico é que permite identificar animais com doença subclínica através das suas lesões, que serão maioritariamente focais, em casos que a excreção fecal e no leite seja insuficiente para cultura ou PCR. Por outro lado, estas técnicas requerem equipamento e pessoal especializado, o que faz com que tenha um custo mais elevado (Gilardoni et al., 2012).

Imunohistoquímica

Esta técnica usa um anticorpo específico para Map (antiMapAc) marcado com enzimas, que permite observar a reação no substrato enzimático. A vantagem deste método é que permite identificar esferoplastos e Map nos tecidos, permitindo localizar Map no interior das células e não ser restringida a tecidos frescos, uma vez que tecidos fixados em formol podem ser usados. Está provado que é tão ou mais sensível que a coloração de ZN (Coetsier et al., 1998). Tem também boa sensibilidade em animais com doença subclínica, no entanto, é considerada baixa quando comparada com a cultura, bem como, mais demorada e dispendiosa e pode ter reações cruzadas com outras micobactérias. A eficiência do método depende do anticorpo usado (Martinson et al., 2008; Gilardoni et al., 2012).

2.1.7.1.3. Diagnóstico direto: Deteção do agente Bacterioscopia

A coloração ácido-álcool resistente constitui um método relativamente barato e simples. Permite identificar 50% de todos os animais clinicamente infetados (Pugh e Baird, 2012).

18 A coloração pode ser feita com esfregaços a partir do íleo e dos linfonodos ileocecais. A coloração de vários aglomerados de bacilos ácido-álcool resistentes no interior dos macrófagos residentes é altamente sugestivo da Doença de Johne (Gilardoni et al., 2012; Pugh e Baird, 2012).

Esta coloração baseia-se na resistência da micobactéria à descoloração por ácido-álcool após coloração com fucsina, sendo os resultados obtidos qualitativos. É um método simples, rápido e barato, por outro lado tem como desvantagem ter baixa sensibilidade e especificidade, tanto em amostras de fezes, como de leite e colostro. Também a ocorrência de falsos negativos é frequente no caso de animais com doença subclínica porque tem uma baixa taxa de excreção ou em animais com diarreia que dilui a concentração de Map de acordo com a quantidade de fezes (Gilardoni et al., 2012).

Cultura bacteriana

O diagnóstico através da cultura do organismo a partir de amostras fecais foi um dos primeiros métodos a ser usado (Salgado et al., 2005). A cultura é considerado o teste “Golden Standard” na deteção de infeções por Map, uma vez que é capaz de detetar infeções em animais seronegativos e em animais sem lesões histopatológicas (Dennis et al., 2011).

Podem também ser usadas como amostras colostro, leite e raspagens da mucosa intestinal. É possível agrupar amostras individuais para poupar, sem perder muita sensibilidade (Gilardoni et al., 2012).

A cultura de linfonodos próximos das lesões macroscópicas, raspagens da válvula ileocecal, dos linfonodos ileocecais ou jejunais, do cólon ou do reto constituem as melhores amostras para isolar Map no caso de realização de necrópsia. Estas culturas apresentam uma sensibilidade de 70% e uma especificidade de 95% (Gilardoni et al., 2012; Tiwari et al., 2006). Os meios usados podem ser líquidos ou sólidos (meio de Herrold gema de ovo com micobactina) e são suplementados, devido às necessidades de crescimento e à contaminação das amostras, que é bastante superior nas amostras fecais. Para eliminar esta contaminação podem-se adicionar aos meios de cultura antibióticos e antifúngicos. Todos os meios para o crescimento de Map contém além destes, a micobactina e o piruvato de sódio (Gilardoni et al., 2012).

As colónias formadas são pequenas, com aproximadamente 1 mm de diâmetro, e com uma forma hemisférica, têm um aspeto liso e brilhante (Gilardoni et al., 2012).

A vantagem deste método é permitir um diagnóstico preciso por isolamento do agente e permitir a sua quantificação em unidades formadoras de colónias (UFC) por mililitro (mL)

19 (Gilardoni et al., 2012). No entanto, traz também inúmeras desvantagens, em primeiro lugar demora entre 8 a 14 semanas, as fezes de animais não infetados pertencentes a rebanhos muito infetados pode resultar numa cultura positiva devido a passagem oro-fecal através do organismo (Manning et al., 2003), por outro lado as estirpes que infetam ovinos e caprinos, são aparentemente mais difíceis de cultivar em meios usados para identificar estirpes de bovinos (Pugh e Baird, 2012). Além disso, devemos ter em conta a possibilidade de ocorrerem falsos negativos devido ao uso de descontaminantes químicos da amostra que pode reduzir a viabilidade dos microrganismos (Reddacliff et al., 2003).

A sensibilidade em estadios clínicos pode ser de 91%, mas este valor pode reduzir para 45 a 72% em estadios subclínicos, no entanto a especificidade é muito alta em todos os estadios, 100% (Alinovi et al., 2009).

Estudos demonstraram que a cultura de fezes e o ELISA com soro são ferramentas de diagnóstico importantes para identificar animais que sejam fortes excretores fecais e animais não excretores. No entanto no diagnóstico de animais considerados fracos excretores apresentam fraco desempenho uma vez que os identifica como animais negativos (Espejo et al., 2015).

Microscopia de fluorescência

Esta técnica baseia-se no uso de um composto fluorogénico, que por ação de células viáveis se transforma em carboxifluoresceína, permitindo identificar a viabilidade bacteriana. No entanto, esta metodologia não é usada rotineiramente na maioria dos laboratórios (Gilardoni et al., 2012).

Bioluminescência

Esta técnica propõe uma junção de plasmídeos e bacteriófagos marcados com luciferase, permitindo uma rápida deteção de Map viável. A proteína luciferina é oxidada pela ação da enzima luciferase que funciona como catalisadora, originando oxiluciferina. Para que esta reação ocorra é necessário ATP, que só pode ser fornecida por bactérias viáveis. Apesar de este ser um método rápido e sensível, requer instalações que muitas vezes não se encontram disponíveis (Sasahara et al., 2004; Gilardoni et al., 2012).

2.1.7.1.4. Técnicas moleculares PCR (Reação em cadeia da polimerase)

A técnica de PCR é baseia-se na deteção de sequências específicas de ADN. Para fazer o diagnóstico de Map a sequência mais usada é a sequência de inserção IS900 que apresenta

20 1451 pares de bases e está presente com 15 a 20 cópias no genoma de Map (Collins et al., 1989; Green et al., 1989; Li et al., 2005).

As amostras podem ser leite, colostro, fezes, tecidos da válvula ileocecal, íleo, jejuno ou linfonodos ileocecais ou jejunais. Como a bactéria está presente na fase inicial de infeção, realizar PCR no sangue também pode ser uma opção, apesar da baixa sensibilidade (Buergelt e Williams, 2004).

As vantagens da PCR são o tempo de deteção e o facto de não necessitar de bactérias viáveis na amostra; por outro lado, o custo e a possibilidade de falsos positivos, por contaminação durante a realização da técnica e de falsos negativos devido aos componentes inibidores da Taq polimerase constituem as maiores desvantagens (Gilardoni et al., 2012).

O PCR apresenta também uma sensibilidade menor que a cultura fecal (Pugh e Baird, 2012). Hibridização in situ (HIS)

A hibridização in situ é uma técnica altamente sensível, que funciona através da deteção e localização de moléculas de ADN ou ARN em células isoladas, secções histológicas de tecido ou preparações de cromossomas (Nouri-Aria, 2008).

A sensibilidade da HIS de IS900 é muito mais baixa quando comparada à coloração com ZN, por sua vez a HIS de rARN é considerada comparável com a coloração ZN (Jeyanathan et al., 2006). Assim, a HIS, apesar de ser capaz de detetar a infeção por Map, apresenta uma coloração com menor intensidade, quando comparada com a técnica de imunohistoquímica (Delgado et al., 2009).

2.1.7.1.5. Diagnóstico indireto: Resposta imunitária do hospedeiro

Resposta imunitária celular

Os testes que medem a resposta imunitária celular, podem auxiliar no controla da doença, uma vez que podem permitir fazer o diagnóstico antes de os animais se tornarem infeciosos (Kalis et al., 2003).

In vivo: Intradermorreação (IDR)

Esta técnica baseia-se na injeção de Johnina PPD (derivado proteico purificado), que é constituído por antigénios obtidos a partir de Map, após o corte do pelo no local da inoculação. O resultado do teste é observado através da mensuração da espessura da pele antes e depois da inoculação (aproximadamente 72h depois) (Kalis et al., 2003). A reação é considerada

21 positiva quando ocorre um aumento da espessura da pele de 4 ou mais milímetros (Kalis et al., 2003; Rawther et al., 2012).

In vitro: Deteção do Interferão Gama (IFN-γ)

A prova do IFN-γ é realizada a partir de uma amostra de plasma, à qual é adicionada a Johnina PPD, em que a estimulação antigénica do plasma leva à libertação de uma citoquina, IFN-γ. Os resultados são obtidos através da medição da densidade ótica (Stewart et al., 2007). Resposta imunitária humoral

Os testes serológicos são mais rápidos e apresentam baixo custo. Este tipo de testes diagnóstico permitem obter bons resultados em animais que apresentem sinais clínicos, nos estados mais tardios de infeção em que excretam em maior quantidade o agente (Salgado et al., 2005; Pugh e Baird, 2012). A especificidade de todos os testes é superior a 95% em ovinos e caprinos, com sinais clínicos da doença, apesar de a sensibilidade não ser tão elevada (Pugh e Baird, 2012). No caso de animais infetados subclinicamente a sensibilidade é de aproximadamente 50% (Pugh e Baird, 2012).

Os caprinos e os ovinos apresentam aparentemente uma resposta diferente relativamente à formação de anticorpos. Nas ovelhas a formação de anticorpos tende a desenvolver-se na fase mais tardia da doença, sendo que nas cabras os anticorpos podem ser detetados muito mais cedo (Pugh e Baird, 2012).

É importante ter sempre em atenção que, um resultado positivo num animal que apresente sinais clínicos é indicativo que ele tem paratuberculose, no entanto, o contrário não pode ser dito, isto é, um teste negativo não permite descartar a doença (Pugh e Baird, 2012).

Teste da Fixação do complemento (FC)

O teste de fixação do complemento, é um teste serológico, tal como o teste de ELISA, mas menos preciso do que este (Kalis et al., 2002). Este teste foi já muito usado no passado, no entanto, é mais adequado para animais que apresentem já sinais clínicos sugestivos de paratuberculose. Não é específico o suficiente para ser usado em programas de controlo. As técnicas são variáveis, mas usa-se como amostra soro diluído (Gilardoni et al., 2012).

22 AGID (Imunodifusão em gel de Agar)

A AGID baseia-se na precipitação de imunocomplexos que se formam entre os anticorpos de animais infetados com um antigénio extraído de Map solúvel em gel de agar (Gilardoni et al., 2012).

A AGID tem sido usada em alguns estudos, dos quais se concluiu que ovelhas com lesões mais difusas tendem a ter valores maiores nos testes com AGID em comparação com ovelhas que apresentam lesões mais discretas. Este método tem como vantagem não ter falsos-positivos devido a reações cruzadas com Corynebacterium pseudotuberculosis (Shulaw et al., 1993).

Os testes de ELISA e AGID são altamente sensíveis quando se testam lesões do tipo lepromatoso ou multibacilar (86,4% e 100% respetivamente), mas a sensibilidade ao grupo tuberculoide ou paucibacilar é significativamente mais baixa (10 a 50% e 30% respetivamente), o que nos permite concluir que estes testes são úteis no diagnóstico das lesões multibacilares mas apresentam dificuldades em animais que apresentem a forma paucibacilar da doença (Clarke et al., 1996).

ELISA (Ensaio Imunoenzimático)

O teste ELISA apresenta uma sensibilidade de 64% e uma especificidade de 100%, no entanto estes valores variam de acordo com o antigénio usado (Salgado et al., 2005).

As vantagens do teste ELISA são a facilidade de automatização, a repetibilidade, permitir uma interpretação dos resultados objetiva e possibilitar a análise de múltiplas amostras ao mesmo tempo. Em contrapartida a variabilidade antigénica dos diferentes ELISA’s e as diferentes idades dos animais testados podem levar a erros de sensibilidade e especificidade e a possibilidade de ocorrerem reações cruzadas (Gilardoni et al., 2012).

Devido às diferenças na sensibilidade, é preferível usar o ELISA no soro do que no leite, no entanto a diferença de custos é tão marcada que o ELISA no leite apresenta um melhor rácio custo-benefício (Salgado et al., 2005).

Com ELISA e o teste de fixação do complemento, pode ocorrer reações cruzadas com

Corynebacterium pseudotuberculosis, o que limita o valor destes testes em rebanhos que

apresentem linfadenite caseosa (Manning et al., 2007; Pugh e Baird, 2012).

O ELISA realizado em amostras de leite de caprino tem sensibilidade reduzida mas uma especificidade maior uma vez que há menos reações cruzadas, comparando com o soro (Pugh e Baird, 2012).