Segundo Galvão et al. (2003) o uso de testes parasitológicos convencionais (xenodiagnóstico e hemocultura) para o diagnóstico da doença de Chagas é dificultado por sua baixa sensibilidade, uma vez que mais da metade dos indivíduos não tratados tem a possibilidade de um resultado negativo por esses testes. Além disso, esses testes são demorados e não estão comercialmente disponíveis. A introdução da PCR para o diagnóstico da doença de Chagas abriu perspectivas mais
amplas, pois demonstrou maior sensibilidade para detectar o T. cruzi, principalmente em pacientes chagásicos crônicos, onde são encontrados níveis baixos de parasitos circulantes no sangue.
Em um estudo que investigou se a PCR poderia facilitar a detecção precoce do T. cruzi em amostras de pacientes com doença de Chagas que realizaram transplante cardíaco, foram realizados ensaios de PCR direcionados para os marcadores rDNA 24Sα e kDNA e comparou-se a eficiência dessa técnica com outros testes convencionais (histopatológico, parasitológico e hemocultura). Nos resultados encontrados foi observado uma boa associação entre o diagnóstico por PCR e os sinais clínicos da doença, indicando que essa abordagem é adequada para o diagnóstico precoce da reativação da doença de Chagas, com alto potencial para auxiliar os médicos nas decisões de tratamento (DA COSTA et al., 2017).
O diagnóstico molecular da doença de Chagas é muito importante em vários casos como no diagnóstico precoce da transmissão congênita em recém-nascidos onde a presença de anticorpos anti T. cruzi maternos pode produzir resultados falso- positivos, em casos de infecções orais para um diagnóstico específico e mais rápido, na detecção precoce da doença de Chagas em receptores e doadores de órgãos, na monitorização da reativação da doença de Chagas em pacientes imunodeprimidos devido a transplante ou HIV positivo e na avaliação da resposta ao tratamento, pois a detecção de conversão sorológica negativa em pacientes tratados com um desfecho favorável pode levar muitos anos para ocorrer (SCHIJMAN, 2018).
Os ensaios de PCR mais amplamente utilizados para fins de diagnóstico molecular têm como alvo o DNA do cinetoplasto (kDNA) ou as regiões do DNA satélite. Ambos são alvos que estão presentes em múltiplas cópias no genoma do parasito, o que aumenta a sensibilidade da detecção (BALOUZ; AGÜERO; BUSCAGLIA, 2017). De acordo com Qvarnstrom et al. (2012) a sensibilidade para detecção do parasito através de ensaios de PCR em Tempo Real foi de 0,1fg/µL em uma amostra de T. cruzi I e de 1fg/µL T. cruzi IV utilizado esses marcadores. No entanto esses marcadores não são capazes de distinguir o T. cruzi em suas diferentes DTUs o que seria de grande importância para melhor compreensão da epidemiologia e patologia da doença de Chagas (IZETA-ALBERDI et al., 2016).
Os marcadores rDNA 24Sα, mini-éxon e Citocromo Oxidase II quando utilizados conjuntamente são capazes de distinguir o T. cruzi em suas diferentes DTUs e já foram utilizados em vários estudos para o diagnóstico e a genotipagem do
T. cruzi como, por exemplo, no monitoramento de crianças nascidas de mães com doença de Chagas na Argentina (BURGOS et al., 2009), em amostras de pacientes chagásicos agudos no estado do Pará (SILVA, 2016) e na Venezuela (DE NOYA et al., 2016) e em amostras de pacientes chagásicos crônicos na Amazônia brasileira (SANTANA et al., 2014), no estado da Bahia (SANTOS, 2014) e no estado do Rio Grande do Norte (MARTINS, 2014).
II JUSTIFICATIVA
O T. cruzi é um parasito complexo e heterogêneo em suas linhagens filogenéticas e tal complexidade gera efeitos relevantes na virulência, transmissão congênita e na severidade da doença de Chagas. Além disso, as DTUs propostas para o T. cruzi tem mostrado diferenças marcantes entre as cepas quanto à distribuição geográfica, propriedades biológicas e susceptibilidade às drogas utilizadas no tratamento da doença de Chagas (revisado por ZINGALES, 2017).
Em hospedeiros e reservatórios para o T. cruzi as infecções multiclonais não são excepcionais, mas, em muitos casos, inevitáveis. Em áreas endêmicas, os habitantes de longo prazo podem ser repetidamente infectados por múltiplos contatos com diferentes triatomíneos, que por sua vez podem ter se alimentado de vários outros humanos ou mamíferos infectados, favorecendo o surgimento de populações multiclonais do T. cruzi, as quais são geralmente compostas por duas subpopulações do parasito (MESSENGER; MILES; BERN, 2015). Tais infecções multiclonais podem levar a alterações nas propriedades biológicas do parasito e também no curso clínico e tratamento etiológico da doença de Chagas. Neste contexto, a identificação das subpopulações presentes numa cepa multiclonal do T. cruzi é de extrema importância, pois pode ter impacto direto no prognóstico e na morbidade da doença (revisado por ZINGALES, 2017).
Segundo Jansen et al. (2015) hospedeiros naturalmente infectados no ambiente silvestre raramente são parasitados por uma única população do parasito. Em seus estudos sobre a distribuição de infecções por T. cruzi em animais silvestres naturalmente infectados no Brasil foram detectados 16% de infecções mistas com diferentes DTUs nos mamíferos positivos para hemocultura e a combinação mais frequente foi de T. cruzi I com T. cruzi II. Em outro estudo, uma porcentagem de 48% de infecções mistas foi observada em amostras de humanos e cães na Argentina, sendo que as combinações mais frequentes encontradas foram de T. cruzi V com T. cruzi VI em humanos e T. cruzi I com T. cruzi VI em cães (MONJE-RUMI et al., 2015).
Embora tenham sido descritos na literatura vários trabalhos identificando populações multiclonais do T. cruzi em amostras coletadas de hospedeiros e vetores, não foram encontrados estudos que relatem sobre a sensibilidade dos marcadores moleculares nos ensaios de PCR para a detecção de cada uma das subpopulações presentes nestas cepas.
Assim, partindo destes pressupostos de que populações do T. cruzi de diferentes DTUs podem coexistir dentro de uma cepa multiclonal e devido à escassez de estudos na literatura referentes à sensibilidade dos marcadores moleculares nos ensaios de PCR para a caracterização dessas misturas populacionais, tem-se como meta deste trabalho investigar a sensibilidade dos ensaios de PCR para os marcadores moleculares rDNA 24Sα, mini-éxon e Citocromo Oxidase II, que conjuntamente são capazes de identificar as diferentes DTUs do T. cruzi, empregando misturas artificiais duplas de populações do T. cruzi pertencentes às diferentes DTUs e amostras de tecido cardíaco de pacientes chagásicos crônicos.
Além disso, em um estudo realizado por Valadares et al. (2012) foi demonstrado que as subpopulações nas cepas multiclonais estão presentes em diferentes proporções e, diante deste achado, tem-se também como meta, estabelecer a quantidade mínima de DNA do parasito necessária nos ensaios de PCR para a identificação precisa de cada uma das subpopulações.
Assim, com este estudo, os marcadores moleculares de maior sensibilidade serão identificados viabilizando o seu uso preferencial em estudos envolvendo a detecção das subpopulações presentes nas cepas multiclonais do T. cruzi e nas análises populacionais de amostras de pacientes chagásicos.