EM BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR
KÊNIA TÁSSIA PEREIRA
Avaliação da sensibilidade dos marcadores rDNA 24Sα,
mini-éxon e Citocromo Oxidase II em análises
populacionais do Trypanosoma cruzi
Divinópolis/MG Maio/2018
KÊNIA TÁSSIA PEREIRA
Avaliação da sensibilidade dos marcadores rDNA 24Sα,
mini-éxon e Citocromo Oxidase II em análises
populacionais do Trypanosoma cruzi
Dissertação apresentada ao Programa Multicêntrico de Pós-Graduação em Bioquímica e Biologia Molecular da Universidade Federal de São João Del Rei, como requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre.
Orientador: Prof. Dr. Helder Magno Silva Valadares
Co-orientador: Prof. Dr. Ivarne Luís dos Santos Tersoriol
Divinópolis/MG Maio/2018
P436
Pereia, Kênia Tássia.
Avaliação da sensibilidade dos marcadores rDNA 24Sa, mini-éxon e Citocromo Oxidase II em análises populacionais do Trypanosoma cruzi / Kênia Tássia Pereia ; orientador Helder Magno Silva Valadares; coorientador Ivarne Luís dos Santos Tersoriol . --Divinópolis, 2018.
114 p.
Dissertação (Mestrado - Programa Multicêntrico de Pós-Graduação em Bioquímica e Biologia Molecular) --Universidade Federal de São João del-Rei, 2018.
1. Trypanosoma cruzi. 2. Cepas multiclonais. 3. Misturas artificiais duplas. 4. Marcadores
moleculares. 5. Sensibilidade da PCR. I. Valadares, Helder Magno Silva, orient. II. Tersoriol , Ivarne Luís dos Santos , co-orient. III. Título.
AGRADECIMENTOS Agradeço a Deus por me iluminar e me guiar.
A toda minha família, por tudo que fizeram por mim.
Ao professor Dr. Helder Valadares, pela orientação e pelos ensinamentos.
Aos professores Dra. Andréa Mara Macedo e Dr. Carlos Renato Machado do Laboratório de Genética Bioquímica, Dr. Egler Chiari e Dra. Maria Lúcia da Cunha Galvão do Laboratório de Biologia do T. cruzi, ambos da Universidade Federal de Minas Gerais, pela colaboração que tiveram para execução deste projeto.
A todos que fizeram parte desta jornada.
Às amigas do Laboratório de Genética Molecular.
RESUMO
O parasito Trypanosoma cruzi, agente etiológico da doença de Chagas, apresenta uma grande variabilidade intraespecífica demonstrada por diversos estudos biológicos e moleculares. Atualmente as cepas do T. cruzi estão divididas em seis Unidades Taxonômicas Discretas (DTUs) chamadas de T. cruzi I a T. cruzi VI. Em áreas endêmicas para a doença de Chagas, os pacientes chagásicos podem ser infectados por múltiplos contatos com diferentes triatomíneos, e estes, por sua vez, podem se alimentar de diferentes indivíduos infectados propiciando a formação de populações multiclonais em hospedeiros e vetores, as quais são geralmente compostas por duas populações diferentes do parasito. Uma vez que a identificação das subpopulações presentes nas cepas multiclonais depende primariamente da sensibilidade dos ensaios de PCR para os marcadores moleculares empregados, o objetivo deste trabalho foi investigar a sensibilidade dos marcadores rDNA 24Sα, mini-éxon e Citocromo Oxidase II (COII) em misturas artificiais duplas de cepas e clones do T. cruzi pertencentes às diferentes DTUs e em amostras de tecido cardíaco de pacientes chagásicos. Assim, foram produzidas sete misturas artificiais duplas cada uma com 27 diluições percentuais de DNA e 1µL destas diluições foi submetido aos ensaios de PCR convencional para os três marcadores. Posteriormente, foram produzidas diluições seriadas para uma das misturas artificiais duplas e foram realizados os ensaios de PCR convencional e Full Nested PCR. Para acessar a sensibilidade dos marcadores em amostras de tecido cardíaco de pacientes chagásicos crônicos foram realizados ensaios de PCR convencional e Full Nested PCR. Os resultados indicaram que em todas as análises o marcador mini-éxon apresentou maior sensibilidade na detecção do DNA do T. cruzi quando comparado aos marcadores rDNA 24Sα e COII. Estes resultados podem estar relacionados com o maior número de cópias do gene mini-éxon no genoma do parasito em relação aos outros dois marcadores. Baseados nestes achados, em estudos envolvendo a detecção das subpopulações presentes nas cepas multiclonais do T. cruzi e nas análises populacionais de amostras de pacientes chagásicos, o mini-éxon deve ser empregado preferencialmente em relação aos marcadores rDNA 24Sα e COII.
Palavras-chave: Trypanosoma cruzi, Cepas multiclonais, Misturas artificiais duplas, Marcadores moleculares, Sensibilidade da PCR.
ABSTRACT
The parasite Trypanosoma cruzi, etiologic agent of Chagas disease, presents a great intraspecific variability demonstrated by several biological and molecular studies. Currently, the T. cruzi strains are divided in six Discrete Taxonomic Units (DTUs) called T. cruzi I to T. cruzi VI. In endemic areas for Chagas disease, chagasic patients may be infected by multiple contacts with different triatomines, and these, in turn, may feed on different infected individuals, causing the formation of multiclonal populations in the hosts and vectors, which are usually composed by two different populations of the parasite. Since the identification of the subpopulations present in a multiclonal strain primarily depends of the PCR assays sensitivity for employed molecular markers, the aim of this work was to investigate the sensitivity of 24Sα rDNA, mini-exon and Cytochrome oxidase II (COII) markers in double artificial mixtures of strains and clones of T. cruzi belonging to different DTUs and in samples of cardiac tissue from chagasic patients. Thus, seven double artificial mixtures were produced each one with 27 DNA percentage dilutions and 1μL of these dilutions was submitted to conventional PCR assays for the three markers. Subsequently, serial dilutions were produced for one of the double artificial mixtures and submitted to conventional and Full Nested PCR assays. To access the sensitivity of the markers in cardiac tissue samples from chronic chagasic patients were performed conventional and Full Nested PCR assays. The results indicated that in all the analyses the mini-exon molecular marker presented greater sensitivity in the detection of DNA T. cruzi when compared to 24Sα rDNA and COII. These results may be related to the higher number of copies of the mini-exon gene in the parasite genome compared to the other two markers. Based on these findings, studies involving the detection of subpopulations present in T. cruzi multiclonal strains and in the populational analysis of samples from chagasic patients, the mini-exon should be preferably employed in relation to 24Sα rDNA and COII markers.
Keywords: Trypanosoma cruzi, Multiclonal strains, Double artificial mixtures, Molecular markers, PCR sensitivity.
SUMÁRIO
I INTRODUÇÃO ... 15
I.1 A descoberta do Trypanosoma cruzi e da doença de Chagas ... 16
I.2 O Trypanosoma cruzi ... 17
I.3 Ciclo de vida do T. cruzi ... 17
I.4 Transmissão do T. cruzi ... 18
I.5 A doença de Chagas ... 21
I.6 Aspectos epidemiológicos da doença de Chagas ... 24
I.7 O T. cruzi e sua organização genômica ... 26
I.8 Variabilidade intraespecífica do T. cruzi ... 28
I.9 Marcadores Moleculares do T. cruzi ... 31
I.9.1 rDNA 24Sα ... 32
I.9.2 Mini-éxon ... 32
I.9.3 Citocromo Oxidase II (COII) ... 33
I.10 Diagnóstico molecular da doença de Chagas ... 33
II JUSTIFICATIVA ... 36
III OBJETIVOS ... 39
III.1 Objetivo Geral ... 40
III.2 Objetivos Específicos ... 40
IV MATERIAIS E MÉTODOS ... 41
IV.1 Cepas e clones do T. cruzi ... 42
IV.2 Extração e quantificação do DNA genômico ... 42
IV.3 Ensaio de PCR convencional para avaliar a equivalência das concentrações de DNA nas misturas artificiais duplas ... 44
IV.4 Produção de misturas artificiais duplas de populações do T. cruzi empregando diluições percentuais de DNA ... 46
IV.5 Ensaios de PCR convencional para avaliar a sensibilidade dos marcadores moleculares nas misturas duplas do T. cruzi empregando diluições percentuais de DNA ... 46
IV.5.1 rDNA 24Sα ... 46
IV.5.2 Mini-éxon ... 48
IV.5.3 Citocromo Oxidase II ... 49
IV.6. Produção de misturas artificiais duplas de populações do T. cruzi empregando diluições seriadas de DNA ... 51
IV.7 Ensaios de PCR para avaliar a sensibilidade dos marcadores moleculares nas
misturas duplas do T. cruzi empregando diluições seriadas de DNA ... 51
IV.7.1 PCR convencional ... 51
IV.7.2 Full Nested PCR ... 51
IV.8 Ensaios de PCR para avaliar a sensibilidade dos marcadores moleculares empregando amostras de tecido cardíaco de pacientes chagásicos crônicos e determinação da DTU ... 53
IV.8.1 PCR convencional ... 56
IV.8.2 Full Nested PCR ... 56
IV.8.3 Determinação da DTU ... 56
IV.9 Eletroforese em gel de agarose ... 57
IV.10 Eletroforese em gel de poliacrilamida ... 57
V RESULTADOS ... 59
V.1 Extração e quantificação do DNA genômico ... 60
V.2 Ensaio de PCR convencional para avaliar a equivalência das concentrações de DNA nas misturas artificiais duplas ... 60
V.3 Produção das misturas artificiais duplas de populações do T. cruzi em diferentes percentagens ... 60
V.4 Ensaios de PCR convencional para avaliar a sensibilidade dos marcadores moleculares nas misturas duplas do T. cruzi empregando diluições percentuais de DNA ... 66
V.4.1 rDNA 24Sα ... 66
V.4.2 Mini-éxon ... 70
V.4.3 Citocromo Oxidase II ... 73
V.5 Ensaios de PCR para avaliar a sensibilidade dos marcadores moleculares nas misturas duplas do T. cruzi empregando diluições seriadas de DNA ... 80
V.5.1 PCR convencional ... 80
V.5.2 Full Nested PCR ... 80
V.6 Ensaios de PCR para avaliar a sensibilidade dos marcadores moleculares empregando amostras de tecido cardíaco de pacientes chagásicos e determinação da DTU ... 83
V.6.1 PCR convencional ... 83
V.6.2 Full Nested PCR ... 83
VI DISCUSSÃO ... 87 VII CONCLUSÕES ... 101 VIII REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 103
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Ciclo de vida do Trypanosoma cruzi. ... 19 Figura 2 – Mapa de restrição gerado pela digestão dos fragmentos amplificados por PCR para o gene COII com a enzima AluI correspondentes aos três haplogrupos mitocondriais do T. cruzi: ... 50 Figura 3 – Esquema representativo para a produção das diluições seriadas contendo DNA das cepas JG e 231 do T. cruzi de 1ng/μL até o nível de 10 fg/μL. .. 52 Figura 4 – Desenho esquemático para a estratégia de Full Nested PCR. ... 54 Figura 5 – Análise da integridade do DNA genômico obtido para as cepas e clones do T. cruzi analisadas neste trabalho após as extrações de DNA usando o método do fenol:clorofórmio:álcool isoamílico. ... 61 Figura 6 – Ensaio de PCR para o marcador rDNA 24S para verificar a equivalência das concentrações de 1ng/L para os DNAs genômicos das misturas duplas Silvio X10 cl1/JG, Silvio X10 cl1/ AM64, Silvio X10 cl1/CanIII cl1 e Silvio X10/CL Brener ... 62 Figura 7 – Ensaio de PCR para o marcador rDNA 24S para verificar a equivalência das concentrações de 1ng/L para os DNAs genômicos das misturas duplas 231/ JG, 231/CanIII cl1 e 231/CL Brener. ... 63 Figura 8 – Ensaios de PCR para o marcador rDNA 24S empregando as diluições percentuais de Silvio X10 cl1/JG e Silvio X10 cl1/AM64. ... 67 Figura 9 – Ensaios de PCR para o marcador rDNA 24S empregando as diluições percentuais de Silvio X10 cl1/CL Brener e 231/JG. ... 68 Figura 10 – Ensaios de PCR para o marcador rDNA 24S empregando as diluições percentuais de 231/CanIII cl1 e 231/CL Brener. ... 69 Figura 11 – Ensaios de PCR para o marcador mini-éxon empregando as diluições percentuais de Silvio X10 cl1/AM64 e Silvio X10 cl1/CanIII cl1... 71 Figura 12 – Ensaios de PCR para o marcador mini-éxon empregando as diluições percentuais de 231/JG e 231/CL Brener. ... 72 Figura 13 – Ensaios de PCR para o marcador COII empregando as diluições percentuais de Silvio X10 cl1/JG, Silvio X10 cl1/AM64, Silvio X10 cl1/ CL Brener e 231/JG. ... 74
Figura 14 – Polimorfismos de Fragmentos de Restrição (RFLP) para o marcador COII após a digestão com a enzima de restrição AluI empregando as diluições percentuais de Silvio X10 cl1 e JG. ... 75 Figura 15 – Polimorfismos de Fragmentos de Restrição (RFLP) para o marcador COII após a digestão com a enzima de restrição AluI empregando as diluições percentuais de Silvio X10 cl1 e AM64. ... 76 Figura 16 – Polimorfismos de Fragmentos de Restrição (RFLP) para o marcador COII após a digestão com a enzima de restrição AluI empregando as diluições percentuais de Silvio X10 cl1 e CL Brener. ... 77 Figura 17 – Polimorfismos de Fragmentos de Restrição (RFLP) para o marcador COII após a digestão com a enzima de restrição AluI empregando as diluições percentuais de 231 e JG. ... 78 Figura 18 – Ensaios de PCR convencional para os marcadores rDNA 24Sα, mini-éxon e Citocromo Oxidase II empregando diluições seriadas da mistura artificial dupla 231 e JG. ... 81 Figura 19 – Ensaios de PCR através do protocolo de Full Nested PCR dos marcadores rDNA 24Sα, mini-éxon e Citocromo Oxidase II empregando diluições seriadas da mistura artificial dupla 231 e JG. ... 82 Figura 20 – Ensaios de PCR convencional para os marcadores rDNA 24Sα, mini-éxon e Citocromo Oxidase II empregando o DNA extraído de tecido cardíaco de pacientes chagásicos crônicos. ... 84 Figura 21 – Ensaios de PCR através da estratégia de Full Nested PCR para os marcadores rDNA 24Sα, mini-éxon e Citocromo Oxidase II empregando o DNA extraído de tecido cardíaco de pacientes chagásicos crônicos. ... 85
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Lista das cepas e clones do T. cruzi empregadas neste trabalho. ... 43 Tabela 2 – Sequência dos iniciadores utilizados neste trabalho. ... 45 Tabela 3 – Tamanho dos amplicons esperados nos ensaios de PCR para os marcadores rDNA 24Sα, mini-éxon e dos principais fragmentos de RFLP gerados para o marcador Citocromo Oxidase II para as misturas artificiais duplas das populações do T. cruzi utilizadas neste trabalho. ... 47 Tabela 4 – Descrição das amostras de tecido cardíaco isoladas de pacientes chagásicos crônicos analisadas neste trabalho. ... 55 Tabela 5 – Avaliação das concentrações dos DNAs genômicos extraídos das cepas e clones do T. cruzi analisadas neste trabalho por espectrofotometria a 260nm e das relações A260/A280 e A260/A230. ... 61
Tabela 6 – Misturas artificiais duplas de populações do T. cruzi de diferentes DTUs produzidas neste trabalho. ... 64 Tabela 7 – Esquema representativo das diluições percentuais e da quantidade de DNA para as 27 diluições percentuais empregando DNA de Sílvio X10 cl1 e CL Brener. ... 65 Tabela 8 – Limite de detecção para cada uma das subpopulações presentes nas misturas artificiais duplas empregando as diluições percentuais de DNA como DNA molde nos ensaios de PCR para os marcadores moleculares rDNA 24Sα, mini-éxon e Citocromo Oxidase II. ... 79 Tabela 9 – Determinação da DTU para as populações do T. cruzi identificadas nas análises de amostras de tecidos cardíacos de pacientes chagásicos crônicos. ... 86
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AluI Enzima de restrição AluI
α Alfa
ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária BSA Albumina do soro bovino
°C Graus Celsius
COII Citocromo Oxidase subunidade II dNTP’s Desoxirribonucleotídeos Trifosfatados DNA Ácido desoxirribonucléico
DTUs Discretas Unidades Taxonômicas
DTT Ditiotreitol
EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético Fg Fentogramas (10-15g)
HCl Ácido clorídrico
HIV Vírus da Imunodeficiência Humana, do inglês, Human Immunodeficiency Virus
Kb Kilobases
KCl Cloreto de potássio kDNA DNA do cinetoplasto KH2PO4 Fosfato monopotássico mL Mililitros µL Microlitros µg Micrograma MgCl2 Cloreto de magnésio µM Micromolar mM Milimolar
NaCl Cloreto de sódio
NaH2PO4(H2O) Fosfato de sódio monobásico hidratado
Ng Nanograma
Nm Nanômetros
Pb Pares de bases
PCR Reação em Cadeia da Polimerase Pg Picograma (10-12g)
pH Potencial de hidrogênio
p/v Peso/volume
RFLP Polimorfismo de Tamanho de Fragmentos de Restrição, do inglês, Restriction Fragment Length Polymorphism
RNA Ácido ribonucleico SDS Dodecil sulfato de sódio TAE Tampão Tris-Acetato-EDTA
TBE Tampão Tris-Borato-EDTA
TEMED Tetrametiletilenodiamina
U Unidades
v/v Volume/volume
WHO Organização Mundial de Saúde, do Inglês, World Health Organization % Porcentagem
I.1 A descoberta do Trypanosoma cruzi e da doença de Chagas
No ano de 1908, no decorrer da construção de uma ferrovia na região norte do estado de Minas Gerais, foi comunicado ao brasileiro sanitarista e bacteriologista Carlos Chagas (1879-1934) sobre a presença de um inseto grande hematófago que se escondia nas cabanas de pau-a-pique da região e picava as pessoas à noite enquanto dormiam, principalmente no rosto. A partir dessa informação, a fim de investigar se havia algum patógeno em potencial para os humanos nos insetos, Carlos Chagas fez a dissecação desses insetos e encontrou formas de protozoários flagelados no intestino de alguns insetos e propôs a hipótese de que estes protozoários poderiam ser parasitos naturais do inseto ou de vertebrados (revisado por STEVERDING, 2014).
Já no Rio de Janeiro, Carlos Chagas fez outros estudos sobre esses parasitos. Em um desses estudos, foi permitido que insetos infectados com o parasito encontrado picassem macacos e estes, após um período de 3 a 4 dias, apresentaram o parasito no sangue. Com esses resultados Chagas acreditava ter descoberto um organismo patogênico para os seres humanos (revisado por STEVERDING, 2014).
A validação da hipótese de Carlos Chagas aconteceu em 1909 quando ele examinou uma criança de dois anos de idade chamada Berenice que tinha os sintomas de febre, aumento de fígado e baço e inchaço dos linfonodos. O primeiro exame do sangue da criança não indicou a presença de tripanosomas, porém, quatro dias depois, vários tripanosomas com morfologia semelhante aos achados nos macacos foram observados no sangue da Berenice. Assim, estava identificada uma nova tripanosomíase humana, a doença de Chagas. Sendo estes parasitos encontrados hoje conhecidos como Trypanosoma cruzi em tributo ao mentor de Carlos Chagas, o bacteriologista Oswaldo Cruz (1872-1917). O sanitarista também fez a descrição clínica da fase aguda da doença, relacionou a infecção com a sintomatologia crônica da doença e descreveu o ciclo de vida do parasito (CHAGAS, 1909).
Carlos Chagas foi o único e o primeiro pesquisador a descobrir o parasito e seus vetores, os aspectos clínicos da doença e os possíveis reservatórios do parasito. Este acontecimento inédito na história da medicina tornou Carlos Chagas conhecido mundialmente (PÉREZ-MOLINA et al., 2015).
Apesar do conhecimento da doença de Chagas ter ocorrido há pouco mais de cem anos, estudos paleoparasitológicos sugerem que a doença de Chagas é certamente uma doença antiga. O DNA do T. cruzi foi detectado em múmias encontradas no deserto do Atacama, no norte do Chile e sul do Peru, datadas de 9000 a 450 anos atrás (AUFDERHEIDE et al., 2004; STEVERDING, 2014). O sucesso do parasito em infectar e manter um quadro de infecção de períodos longínquos pode ser resultado, principalmente, da capacidade do parasito em evadir o sistema imune do hospedeiro (CARDOSO; CUNHA; BARTOLOMEU, 2016). Além disso, o parasito apresenta diversas formas de transmissão e diversos epítopos em sua superfície dificultando a produção de uma vacina como medida profilática (CARDOSO; CUNHA; BARTOLOMEU, 2016; RASSI Jr; RASSI; MARIN-NETO, 2010).
I.2 O Trypanosoma cruzi
O T. cruzi é um protozoário flagelado classificado no domínio Eukarya, reino Protista, sub-reino Protozoa, filo Sarcomastigophora, subfilo Mastigophora, classe Zoomastigophora, ordem Kinetoplastida, família Trypanosomatidae e gênero Trypanosoma (RASSI Jr; RASSI; DE REZENDE, 2012). O organismo monoflagelado do T. cruzi apresenta uma mitocôndria tubular única que percorre todo o corpo da célula e uma região especializada em forma de disco, denominada de cinetoplasto, onde se encontram altas densidades de DNA (kDNA) (MYLER et al., 1993).
I.3 Ciclo de vida do T. cruzi
Durante seu ciclo de vida, o parasito se diferencia em quatro estágios evolutivos principais: epimastigota e tripomastigota metacíclico no inseto vetor, tripomastigota sanguíneo e amastigota no hospedeiro vertebrado. O ciclo de vida pode se iniciar quando o inseto vetor pica o hospedeiro vertebrado infectado e ingere as formas tripomastigotas circulantes no sangue. Estes parasitos diferenciam-se pela primeira vez no estômago do indiferenciam-seto vetor onde as formas tripomastigotas não replicativas transformam-se em epimastigotas replicativas. Estas formas dividem-se no intestino médio, migram para o intestino posterior e, no reto do inseto, se aderem e ocorre a segunda diferenciação do parasito em tripomastigotas
metacíclicos em um processo chamado de metaciclogênese. Estes tripomastigotas metacíclicos são liberados durante o repasto sanguíneo através das fezes ou urina do vetor atingindo o hospedeiro vertebrado por uma ferida no sítio da picada ou pré-existente na pele ou através das mucosas dos olhos e da boca. Os parasitos invadem diferentes tipos de células nucleadas no hospedeiro e se diferenciam intracelularmente em amastigotas, sofrendo múltiplas divisões no interior das células infectadas. Em seguida, os amastigotas se diferenciam em tripomastigotas, que são liberados na corrente sanguínea após o rompimento da membrana celular. Uma vez livres, podem penetrar nas células adjacentes ou cair na circulação sanguínea e linfática, infectando novas células de outros órgãos e tecidos ou iniciar um novo ciclo biológico quando ingerido pelo inseto vetor durante o repasto sanguíneo (PÉREZ-MOLINA; MOLINA, 2017; RASSI Jr; RASSI; DE REZENDE, 2012) (Figura 1).
A invasão da célula hospedeira é um passo decisivo para o estabelecimento da infecção do T. cruzi. O primeiro passo da invasão é a adesão dos tripomastigotas às células hospedeiras por diferentes moléculas de superfície como, por exemplo, as glicoproteínas e proteases. Entre as moléculas de superfície mais numerosas estão as glicoproteínas ancoradas pela porção glicosil-fosfatidilinositol. Abundantemente expressas, as glicoproteínas de superfície ancoradas por glicosil-fosfatidilinositol, codificada por famílias multigênicas, incluem mucinas, proteínas mucinas de superfície associadas e trans-sialidases. Os genes para estas proteínas compreendem cerca de 17% dos genes codificadores para proteínas no genoma do T. cruzi e estão envolvidos nas interações hospedeiro-parasito. Estas interações permitem a internalização do parasito, pois acarretam uma cascata de sinalização na célula do hospedeiro permitindo a penetração do parasito na célula (MARTINS et al., 2015).
I.4 Transmissão do T. cruzi
A via clássica de transmissão do T. cruzi ao hospedeiro vertebrado é a vetorial, a qual inclui cerca de 100 espécies de triatomíneos, insetos hematófagos conhecidos popularmente como “barbeiros” (COURA, 2008; revisado por ZINGALES, 2017). Porém, o T. cruzi também pode ser transmitido aos humanos através de outras vias, como a transmissão por via oral através da ingestão de
Figura 1 – Ciclo de vida do Trypanosoma cruzi. Os números de 1 a 8 representam a sequência em que normalmente procede a infecção do T. cruzi pela via vetorial. (1) O inseto vetor triatomíneo infectado libera sobre a pele do hospedeiro fezes e urina contaminadas com tripomastigotas metacíclicos após o repasto sanguíneo; (2) As formas tripomastigotas atingem a corrente sanguínea do hospedeiro; (3) Os tripomastigotas invadem células onde se diferenciam em amastigotas; (4) Os amastigotas se multiplicam dentro da célula e se diferenciam em tripomastigotas. As células se rompem e liberam na corrente sanguínea os parasitos que invadem outras células; (5) Os tripomastigotas circulantes são ingeridos por outro triatomíneo no momento da hematofagia; (6) No intestino do triatomíneo, os tripomastigotas se diferenciam em epimastigotas; (7) se multiplicam por divisão binária e (8) os epimastigotas se deslocam para o intestino posterior e se diferenciam em tripomastigotas metacíclicos, reiniciando o ciclo. Fonte: Adaptado de CDC – Centers for Disease Control (2016).
alimentos contaminados com o T. cruzi, via congênita, por transfusão de sangue, acidentes em laboratório, manipulação de animais infectados e através do transplante de órgãos (COURA, 2015). E ainda, deve ser considerada, a possibilidade de transmissão através do leite materno (MARTINS et al., 2011) e sexual em humanos, sendo recomendada a prevenção ou abstinência sexual em indivíduos com alta parasitemia (em fase aguda ou imunossuprimidos) (DIAS; AMATO-NETO; LUNA, 2011).
Assim como a transmissão vetorial, a transfusão sanguínea tem sido considerada de grande importância epidemiológica, principalmente em países onde não se tem o controle em larga escala dos bancos de sangue (MESSENGER; MILES; BERN, 2015). Diante disso, desde a década de 1990, a Organização Mundial de Saúde, a Organização Pan-Americana de Saúde e os Ministérios da Saúde de vários países, vêm realizando ações com a intenção de reduzir a doença de Chagas contraída através da via vetorial e por transfusão de sangue. Este esforço resultou na redução substancial dos casos agudos da doença de Chagas na América Latina e, devido a tais ações, nos últimos anos a maioria dos casos da doença de Chagas está relacionada principalmente com a transmissão oral, ao transplante de órgãos ou a acidentes laboratoriais (revisado por ZINGALES, 2017).
A transmissão oral do T. cruzi se tornou uma ocorrência frequente nas regiões latino-americanas, sendo predominante no Brasil e responsável por 62% dos casos de doença de Chagas do país entre 2006 e 2012 (XAVIER et al., 2014). Na região Norte, em 2007, a doença de Chagas fez inúmeras vítimas associadas ao consumo de alimentos contaminados, principalmente o açaí. Este e vários outros relatos da contaminação de alimentos pelo T. cruzi resultou na criação de iniciativas por autoridades governamentais para a contenção dessa via de transmissão. Assim, a ANVISA elaborou um plano de ação que tem como principal objetivo a capacitação de órgãos de vigilância sanitária locais, da população e dos batedores de açaí e a conscientização da população sobre a doença de Chagas advinda por transmissão oral (BRASIL, 2008; DIAS; PRATA; CORREIA, 2008).
Tendo em vista a importância da contenção dessa via de transmissão e de que o Brasil ainda se encontra num estágio precário no combate à doença de Chagas transmitida via alimentos contaminados, nosso grupo de pesquisa desenvolveu uma metodologia eficiente para a identificação molecular do T. cruzi em
alimentos contaminados como açaí em polpa e em caldo de cana (COLARES, 2016).
I.5 A doença de Chagas
A doença de Chagas é um problema preocupante para a saúde humana pela enorme quantidade e variedade de danos nos pacientes chagásicos tornando-se uma doença extremamente séria em suas consequências. Clinicamente, a doença de Chagas apresenta duas fases bastante distintas: a fase aguda e a fase crônica (RASSI et al., 2000; PÉREZ-MOLINA; MOLINA, 2017).
Após a infecção por qualquer uma das vias de transmissão do T. cruzi, o indivíduo desenvolverá inicialmente a fase aguda da doença de Chagas. Esta fase é assintomática na maioria dos casos (98%), principalmente em adultos. E, ocasionalmente, a manifestação sintomática nesta fase pode iniciar de oito a dez dias após a entrada do parasito na corrente sanguínea (COLOSIO, 2008; SANTOS, 2011). Os sintomas variam em frequência e intensidade, como o Chagoma de inoculação (parasitos depositados nos ferimentos da pele ou em mucosas causando uma reação inflamatória local), o sinal de Romaña (edema indolor na pálpebra inferior e superior de um dos olhos devido a uma resposta linforreticular), edemas, linfoadenopatias e febre (RASSI et al., 2000). Nos casos mais graves, podem ocorrer miocardite intensa, envolvimento neurológico, esplenomegalia e hepatomegalia, principalmente, em crianças menores de dois anos de idade (grupo em que pode atingir cerca de 10 a 15% de mortalidade) e prematuridade ou natimorto nos casos de transmissão vertical. Essa fase dura em média de um a quatro meses durante a qual são observadas altas taxas do parasito no sangue (COLOSIO, 2008; SANTOS, 2011).
A fase aguda é seguida pela fase crônica que pode durar por toda a vida do paciente chagásico, sendo caracterizada pela escassez de parasitos no sangue, devido ao desenvolvimento de uma resposta imune específica capaz de controlar a multiplicação do parasito (RASSI et al., 2000). Na maioria dos casos, os pacientes crônicos apresentam a forma indeterminada, uma forma assintomática da doença de Chagas, na qual os pacientes apresentam resultados normais de eletrocardiograma e raios-X do coração, esôfago e cólon. Entretanto, cerca de 10 a 30 anos após a infecção, 30 a 35% dos pacientes infectados desenvolvem as formas clínicas
sintomáticas, caracterizando as formas cardíaca, digestiva ou mista (presença da forma cardíaca e digestiva, simultaneamente) (PÉREZ-MOLINA; MOLINA, 2017; WHO, 2017).
Existem duas hipóteses que explicam o progresso da doença de Chagas para a fase crônica. A primeira, a qual é a mais aceita entre os pesquisadores, defende a persistência do parasito no organismo hospedeiro como a causa primária dos sintomas característicos da fase crônica (HYLAND; ENGMAN, 2006; KIERSZENBAUM, 2005). E a segunda considera que as lesões tissulares que surgem nos órgãos afetados são devido a uma resposta autoimune do hospedeiro (DUTRA; GOLLOB, 2008; HYLAND; ENGMAN, 2006; KIERSZENBAUM, 2005).
A forma crônica cardíaca da doença de Chagas é a mais relevante pelos diversos danos ocorridos no sistema de condução ocasionando a falência cardíaca nos casos graves da doença de Chagas. Essa forma pode apresentar prognóstico e evolução variáveis, oscilando de pequenas alterações eletrocardiográficas até insuficiência cardíaca ou progressão para uma eventual morte súbita (PÉREZ-MOLINA; MOLINA, 2017). Estes fatos fazem da doença de Chagas líder entre as causas de morbidade cardiovascular e morte prematura na América Latina (revisado por ZINGALES, 2017).
Por sua vez, a forma digestiva da doença de Chagas pode acometer todos os órgãos do trato gastrintestinal, principalmente esôfago e intestino grosso, levando ao aparecimento de megaesôfago e megacólon, respectivamente (DIAS et al., 2016).
Ainda dentro das manifestações clínicas da doença de Chagas, pode existir também a forma cerebral da doença. Em 2002 foi relatado que uma mulher de 36 anos procurou um hospital com sintomas de dor de cabeça, náuseas e vômitos, sonolência e diminuição da memória, associadas a emagrecimento, sem histórico de febre. Um exame de tomografia computadorizada do crânio mostrou lesões consideráveis no cérebro e, devido a possibilidade de uma neuroinfecção, foi realizado uma punção lombar que revelou a presença de parasitos com características de tripanosomas e os testes para HIV foram positivos. Ela foi tratada com Benznidazol e apresentou melhora neurológica e tomográfica, porém, faleceu 6 semanas após, por insuficiência respiratória. A infecção por T. cruzi no sistema nervoso central é rara, mas tem se observando um número crescente de casos em pacientes imunocomprometidos por infecção pelo HIV, principalmente em áreas endêmicas da doença de Chagas (ANTUNES et al., 2002).
Diversos fatores como caraterísticas genéticas do parasito e do hospedeiro, infecções mistas (causadas por mais de um clone do T. cruzi), podem estar relacionados com a diversidade de sintomas da doença de Chagas (ZINGALES et al., 2012). E, na tentativa de esclarecer essa diversidade, vários estudos foram realizados com o objetivo de investigar as possíveis correlações entre as formas clínicas com a variabilidade genética do parasito, porém os resultados dessa relação são bastante controversos. Entretanto, já está bem definido que propriedades biológicas específicas do parasito estão mais associadas a certos grupos filogenéticos do T. cruzi, o que poderia refletir na resposta ao tratamento etiológico, no curso da infecção e, consequentemente, nas manifestações clínicas (DIAS et al., 2016).
A terapêutica para a doença de Chagas, ainda constitui num desafio, assim como, a busca por formas alternativas de tratamento (CHATELAIN, 2017). Até o momento, somente dois compostos ativos, desenvolvidos durante os anos de 1960, se revelaram favoráveis para uso clínico, sendo eles o Nirfurtimox e o Benznidazol (PÉREZ-MOLINA; MOLINA, 2017; WHO, 2017).
A administração de Benznidazol ou Nirfurtimox na infecção aguda reduz a intensidade dos sintomas, reduz o curso clínico e a duração da parasitemia detectável e evita as manifestações crônicas. A cura parasitológica é observada em cerca de 60 a 85% dos pacientes tratados nesta fase (RASSI Jr; RASSI; DE REZENDE, 2012). Apesar dos benefícios da terapia tripanosomicida serem evidentes na fase aguda da doença, na fase crônica não se observa melhoras significativas nas manifestações clínicas (MORILLO et al., 2015).
Em um projeto chamado BENEFIT (Benznidazole Evaluation for Interrupting Trypanosomiasis), um estudo clínico do tratamento do Benznidazol em pacientes entre 18 e 75 anos que apresentavam cardiopatia chagásica crônica sem lesões muito graves, relatou que os pacientes que receberam o tratamento apresentaram uma diminuição significativa na detecção dos parasitos circulantes no sangue, mas não houve diminuição nas manifestações cardíacas nos 5 anos de duração do estudo. Estes dados salientam a necessidade do desenvolvimento de novas drogas e estratégias de tratamento mais eficazes para todas as fases da doença, com o mínimo possível de efeitos colaterais (MORILLO et al., 2015).
Uma outra limitação do tratamento da doença de Chagas, além da baixa eficácia e toxicidade do Benznidazol e do Nirfurtimox, é a existência de cepas do T.
cruzi naturalmente resistentes a essas drogas. É possível observar que há diferenças na eficácia do tratamento da doença de Chagas com esses medicamentos entre as cepas, em vários países e em diferentes localidades dentro de um mesmo país (WILKINSON et al., 2008; revisado por ZINGALES, 2017).
Novas propostas terapêuticas têm sido abordadas na literatura como a identificação de potenciais candidatos vacinais. O desenvolvimento de uma vacina contra o T. cruzi com objetivos profiláticos e terapêuticos poderia favorecer substanciamente para o controle da doença de Chagas, principalmente em áreas endêmicas. A proteção imune contra a infecção do T. cruzi vem sendo estudada desde o século passado, e muitos tipos de substâncias capazes de induzir uma resposta imune já foram estudadas, como parasitos inativados ou atenuados e vacinas de DNA (RODRÍGUEZ-MORALES et al., 2015). Porém, atualmente nenhuma vacina está disponível para o tratamento ou prevenção da doença de Chagas (PÉREZ-MOLINA; MOLINA, 2017).
Novos quimioterápicos obtidos de produtos naturais, medicamentos ou fármacos ativos em outras doenças e compostos químicos de síntese têm exibido resultados promissores, porém, a grande maioria ainda se encontra em fase pré-clínica e não existe previsão de chegada destes compostos ao mercado farmacêutico (CHATELAIN, 2017; PÉREZ-MOLINA; MOLINA, 2017; SOEIRO; DE CASTRO, 2011).
Devido às limitações no desenvolvimento de novos compostos e na avaliação da eficácia do tratamento em prevenir a morbidade, ainda hoje, a melhor maneira de enfrentar a doença de Chagas se dá por meio da prevenção e do controle, combatendo sistematicamente os vetores mediante o emprego de inseticidas eficazes, melhoria das habitações e saneamento básico, eliminação dos animais domésticos infectados, controle e descarte do sangue contaminado pelo parasito e seus derivados (WHO, 2017).
I.6 Aspectos epidemiológicos da doença de Chagas
A área de abrangência da doença de Chagas é ampla e difusamente dispersa atingindo 21 países no continente Americano compreendidos desde o sul dos Estados Unidos até o norte da Argentina e Chile, representando uma doença
parasitária de grande impacto social e econômico (PÉREZ-MOLINA; MOLINA, 2017).
O T. cruzi pode estar presente em áreas silvestres, domésticas e peridomésticas. A transmissão do T. cruzi nas áreas silvestres compreende os hospedeiros invertebrados (triatomíneos) e vertebrados (marsupiais, carnívoros, roedores, primatas, mamíferos silvestres, dentre outros animais). E, nas áreas domésticas e peridomésticas, é resultado do contato entre o homem e o vetor devido às modificações sociais e ecológicas provocadas pelo próprio homem (DIAS et al., 2016).
Entre os anos de 1980 e 1985 era estimado, principalmente na América Latina, que cerca de 100 milhões de pessoas corriam o risco de adquirir a doença de Chagas e que aproximadamente 24 milhões estavam infectados (WHO, 1991). A estimativa de indivíduos infectados com o T. cruzi foram retificadas em 2001 para 9,8 milhões e em 2017 para cerca de 6 a 7 milhões (WHO, 2017). Apesar da redução do número de casos da doença de Chagas, a relevância da doença é grande e representa um enorme problema de saúde pública na América Latina.
Um fator importante que contribuiu para a redução dos casos da doença de Chagas foi a interrupção da transmissão da doença de Chagas pelo principal vetor domiciliado, o Triatoma infestans, em vários países da América do Sul como Chile, Uruguai, Brasil, em cinco províncias da Argentina e na região oriental do Paraguai. No Brasil, houve uma grande redução do número do T. infestans, porém, ainda existem pequenos focos residuais na região Norte e nos estados do Rio Grande do Sul e Bahia (COURA, 2015).
Uma das mudanças mais consideráveis na epidemiologia da doença de Chagas nas últimas décadas foi o seu aparecimento em países fora das áreas endêmicas tornando-se uma preocupação de saúde global devido ao grande número de pessoas da América Latina que migram clandestinamente para os Estados Unidos, Canadá, Japão e Europa (REQUENA-MÉNDEZ et al., 2015). Na Europa, a maioria dos imigrantes de áreas endêmicas da doença de Chagas está concentrada na Espanha, Itália, França, Reino Unido e Suíça que consideravelmente podem estar cronicamente infectados com T. cruzi. Além disso, embora a transmissão vetorial não possa ocorrer nesses países (não compreende o habitat do vetor), a doença de Chagas pode ser transmitida através da via congênita, transfusão de sangue e transplante de órgãos. Estima-se que existam mais de 300.000 pessoas
portadoras desta doença nos Estados Unidos, no Canadá mais de 5.500 e na Europa e na região do pacifico ocidental mais de 80.000 (ANTINORI et al., 2017).
Em 2013 foi desenvolvido um modelo computacional para estimar a carga econômica global da doença de Chagas a partir de uma perspectiva social, uma vez que problemas clínicos característicos da doença de Chagas como cardiomiopatia, insuficiência cardíaca, megacólon e megaesôfago são crônicos e progressivos, acumulando custos ao longo de muitos anos e resultando em um altíssimo custo social em relação ao tratamento, redução da produtividade do trabalhador, incapacidade prematura e morte. As probabilidades e estimativas dos casos da doença de Chagas geradas por este modelo incluem dados da Organização Mundial de Saúde e outros relatórios epidemiológicos. Os resultados mostraram que ao longo de sua vida, um indivíduo chagásico acumula um valor médio de US$ 27.684 e os custos mundiais médios são de US$ 7 bilhões por ano (LEE et al., 2013). Estes fatos mostram a grande negligência em torno da doença de Chagas que tem como principal determinante para a transmissão do T. cruzi ao homem as condições socioeconômicas da população como habitação, educação, saneamento, renda familiar, entre outras (DIAS et al., 2016).
I.7 O T. cruzi e sua organização genômica
O T. cruzi, como os demais eucariotos, apresenta duas fontes de DNA: o DNA mitocondrial representado pelo DNA do cinetoplasto (kDNA) e o DNA genômico presente no núcleo celular (MYLER et al., 1993).
O kDNA apresenta duas classes de moléculas de DNA circulares chamadas de maxicírculos e minicírculos, representando cerca de 23% a 30% de todo o DNA celular (DEGRAVE et al., 1988). Os minicírculos estão presentes em torno de 10.000 a 20.000 cópias por célula, sendo constituído de quatro regiões conservadas intercaladas por quatro regiões variáveis. As regiões conservadas contêm a origem de replicação do DNA, enquanto as regiões variáveis estão envolvidas com a produção de pequenos RNAs guias (gRNAs) que participam do processo de editoração dos mRNAs das enzimas mitocondriais (JUNQUEIRA; DEGRAVE; BRANDÃO, 2005).
Os maxicírculos, por sua vez, estão presentes em cerca de 20 a 50 cópias por célula e contém os genes de proteínas relacionadas com a respiração celular, bem
como, de RNAs ribossomais e transportadores. As sequências de DNA dos maxicírculos dos clones do T. cruzi CL Brener e Esmeraldo foram publicadas e foi demonstrado que as regiões codificantes dos maxicírculos das duas cepas apresentam pouca ou nenhuma variação de nucleotídeos, apesar de apresentar algumas inserções ou deleções específicas para cada uma das cepas. Além das regiões codificantes, os maxicírculos do T. cruzi também apresentam regiões não codificantes variando de tamanho entre 4 a 6kb, bem como, a presença de sequências conservadas que podem servir como origem de replicação (WESTENBERGER et al., 2006).
O DNA nuclear do T. cruzi está aparentemente organizado em 41 pares de cromossomos (WEATHERLY; BOEHLKE; TARLETON, 2009) e o conteúdo total de DNA por célula pode variar de 125 a 280 fentogramas (HENRIKSSON; ÅSLUND; PETTERSSON, 1996).
Cinco clones do T. cruzi já tiveram seus genomas sequenciados e publicados: CL Brener, Esmeraldo cl3, Silvio X10 cl1, Dm28c e 231. O primeiro genoma a ser sequenciado em T. cruzi foi o do clone híbrido CL Brener (T. cruzi VI), um organismo que tem sido amplamente utilizado como modelo para estudos de bioquímica, biologia celular, imunologia, expressão gênica e desenvolvimento de drogas. O tamanho haplóide do genoma para CL Brener foi estimado entre 53 a 55Mb (megabases), contendo cerca de 22.570 genes e que cerca de 50% do genoma é composto por sequências repetitivas (DNA satélite). A comparação dos contigs de CL Brener com as reads oriundas do sequenciamento do genoma do clone Esmeraldo (T. cruzi II), possibilitou diferenciar dois haplótipos diferentes em CL Brener: haplótipos Esmeraldo like e non Esmeraldo like. Esses dois haplótipos mostraram altos níveis de sintenia gênica, uma vez que a maior parte das diferenças foi devida às inserções e deleções em regiões intergênicas e subteloméricas e/ou amplificação de sequências repetitivas (EL-SAYED et al., 2005).
Já o clone Silvio X10 cl1 (T. cruzi I) apresenta um genoma não-híbrido, com baixos níveis de heterozigose e apresenta uma menor quantidade de DNA repetitivo do que o genoma de CL Brener. Uma montagem parcial do genoma foi realizada e o tamanho do genoma haplóide de Silvio X10 cl1 foi estimado em 44Mb (FRANZEN et al., 2011).
O clone Dm28c (T. cruzi I) foi sequenciado gerando um total de 5.287 contigs com um tamanho do genoma haplóide estimado em 27Mb. Foram identificadas
4.144 proteínas com homologia a outras proteínas conhecidas de outros organismos, bem como, 7.254 proteínas hipotéticas. O clone Dm28c é mais semelhante, como esperado, a Silvio X10 cl1 (98,71%) do que a CL Brener (90,20%) (GRISARD et al., 2014).
Por sua vez, no sequenciamento do clone 231 (T. cruzi III) foi observado um tamanho aproximado do genoma diplóide do parasito de 67,71 Mb com um total de 10.592 sequências codificantes e em 32% deste genoma foram encontradas regiões repetitivas. Também foram realizadas análises comparativas entre o genoma da cepa 231 montado e os demais disponíveis em bancos de dados para análises filogenéticas e foi proposto a hipótese de que a linhagem de T. cruzi III, diferentemente do que foi proposto por diversos trabalhos, não é uma linhagem híbrida (BAPTISTA, 2014).
I.8 Variabilidade intraespecífica do T. cruzi
O T. cruzi é constituído por um conjunto de populações heterogêneas contendo um grande número de clones naturais, que circulam nos ambientes doméstico e silvestre, entre seres humanos, reservatórios e vetores. Tais populações são complexas e apresentam variações intraespecíficas demonstradas em níveis biológico, bioquímico, imunológico e genético, com base na análise do DNA e expressão de proteínas (MILES et al., 2009; ZINGALES et al., 2012).
De acordo com Tibayrenc e Ayala (1991) essa grande variabilidade biológica e genética encontrada nessa espécie pode ser explicada pelos múltiplos contatos entre os vetores e reservatórios nas áreas endêmicas, propiciando infecções em humanos com populações do T. cruzi apresentando distintas propriedades biológicas e constituindo as populações monoclonais (formada por apenas uma população) ou multiclonais (formada por mais de uma população) do T. cruzi.
Estudos baseados em análises de microssatélites corroboraram para essa grande diversidade populacional do parasito. Esses marcadores de DNA são extremamente polimórficos, encontram-se dispersos pelo genoma nuclear do parasito e constituem numa ferramenta prática para determinar se uma cepa do T. cruzi é uma população monoclonal ou multiclonal. Em análises utilizando esses marcadores foi demonstrado claramente que algumas cepas do T. cruzi são multiclonais e, de modo consequente, os pacientes chagásicos podem ser
infectados por diferentes clones do T. cruzi (MACEDO et al., 2001; OLIVEIRA et al., 1998; VALADARES et al., 2008, 2012).
O T. cruzi apresenta estrutura e evolução predominantemente clonal. Isto implica que a reprodução sexual ou recombinação genética é um fenômeno extremamente raro nesta espécie, tão raro que não é capaz de impedir a existência de clones naturais estáveis no tempo. Desse modo, a grande variabilidade biológica do T. cruzi é resultado de um longo tempo de evolução separada dos múltiplos clones do parasito que acumularam mutações gerando características próprias (TIBAYRENC; AYALA, 2002).
Um estudo realizado por Baptista et al. (2014) baseado em marcadores nucleares (microssatélites) e mitocondriais (COII) empregando parâmetros de genética populacional comparou dois grupos de isolados do T. cruzi II: um proveniente de diferentes regiões da América Latina e outros obtidos somente de pacientes de Minas Gerais. Neste estudo, foi observado através da análise de alguns parâmetros de genética de populações, que as distâncias geográficas e/ou barreiras físicas podem influenciar na redução de oportunidades para a reprodução sexual entre as cepas do T. cruzi, logo, afetando as taxas de recombinação entre elas. Os isolados de Minas Gerais mostraram estar em equilíbrio de ligação de Hardy-Weinberg e os níveis de recombinação entre eles foram substancialmente elevados. Sendo assim, ao se comparar cepas do T. cruzi isoladas de diferentes regiões geográficas uma reprodução predominante clonal pode ser indicada erroneamente (BAPTISTA et al., 2014).
Os primeiros estudos que demonstraram a grande diversidade do T. cruzi foram realizados por Miles e colaboradores no final da década de 1970. Esses autores analisaram o polimorfismo dos perfis eletroforéticos de seis isoenzimas e sugeriram uma classificação do T. cruzi em três grupos distintos, os quais foram denominados de Zimodemas Z1, Z2 e Z3 (MILES et al., 1978).
Com o advento da biologia molecular, diversos trabalhos foram realizados com a utilização da técnica da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) amplificando diferentes alvos tanto no genoma nuclear como no mitocondrial, a fim de classificar as populações do T. cruzi de acordo com sua identidade genética (OLIVEIRA, 2012).
Atualmente a espécie T. cruzi encontra-se subdivida em seis Discretas Unidades Taxonômicas (DTUs), que foram denominadas de T. cruzi I a T. cruzi VI,
uma divisão apoiada num consenso entre diversos pesquisadores durante a XXXVI Reunião Anual de Pesquisa Básica em doença de Chagas (ZINGALES et al., 2009). Assim cada DTU é composta por cepas geneticamente similares que são identificadas por apresentarem marcadores moleculares ou imunológicos comuns. Esta variabilidade genética também se relaciona com diferenças morfológicas, biológicas, antigênicas, além de distintas preferências por hospedeiros e tropismo tecidual (DUZ et al., 2014).
O T. cruzi I é geograficamente abundante e disperso, sendo associado aos ciclos silvestre e doméstico de transmissão. Esta DTU tem como vetor várias espécies de triatomíneos e, geograficamente, é encontrada desde o sul dos Estados Unidos até o norte da América do Sul, com maior presença na Colômbia, Venezuela, Equador e Peru e, ocasionalmente, no Cone Sul (ZINGALES et al., 2012). Esta DTU tem como característica alta patogenicidade no modelo murino, baixa sensibilidade a fármacos antitripanosomatídeos e alta transmissibilidade. Sob o ponto de vista clínico, o T. cruzi I está associado a cardiomiopatia chagásica crônica e meningoencefalite grave em pacientes imunocomprometidos (ZINGALES et al., 2014) e a casos de graves de infeções agudas em surtos de transmissão oral na Amazônia brasileira (MACEDO; SEGATTO, 2010).
O T. cruzi II é encontrado principalmente na região centro-sul da América do Sul, como na região central do Brasil, na Argentina e no Chile. Esta DTU tem como característica, alta sensibilidade a fármacos antitripanosomatídeos e é principalmente relacionada ao ciclo doméstico, ocasionando formas crônicas severas com manifestações cardíacas e, às vezes, concomitantemente, o megacólon e megaesôfago (ZINGALES et al., 2012; 2014).
O T. cruzi III é primariamente associada ao ciclo silvestre no Brasil e em países adjacentes, com raros casos de infecção humana documentados, exceto em relatos de casos agudos na região Amazônica brasileira. O T. cruzi III está associado ao nicho terrestre e ao Dasypus novemcinctus (tatu-de-folha) em uma vasta faixa compreendida do oeste da Venezuela até o Chaco argentino e também é isolado ocasionalmente de cães domésticos (ZINGALES et al., 2012; 2014).
O T. cruzi IV apresenta predominante associação ao ciclo silvestre e mostra um padrão similar de distribuição na América do Sul ao T. cruzi III. Ao contrário do T. cruzi III, o T. cruzi IV apresenta infeções mais frequentes em humanos, é a causa secundária da doença de Chagas na Venezuela e está associado a surtos de
transmissão oral na Amazônia brasileira. Cinco novas amostras de T. cruzi IV foram isoladas de primatas e oito de Rhodnius brethesi (triatomíneo) na bacia amazônica confirmando indicações anteriores de que T. cruzi IV pode ter um ecótopo arbóreo (MACEDO; SEGATTO, 2010; ZINGALES et al., 2012; 2014).
O T. cruzi V e T. cruzi VI representam as duas DTUs híbridas do T. cruzi e são derivadas de eventos de hibridação entre T. cruzi II e T. cruzi III (FREITAS et al., 2006; WESTENBERGER et al., 2005), raramente são relacionadas ao ciclo silvestre, sendo o principal agente etiológico da doença de Chagas no cone sul, na Bolívia, Argentina, Paraguai e na região do Chaco argentino (MACEDO; SEGATTO, 2010; ZINGALES et al., 2012). O T. cruzi V está relacionado com severos casos da doença de Chagas aguda e crônica, ao megaesôfago na Bolívia e está associado a casos de transmissão congênita na Bolívia, Argentina e região sul do Brasil. Já o T. cruzi VI está associado a graves casos da doença de Chagas aguda e crônica na região do Cone Sul americano (MACEDO; SEGATTO, 2010).
I.9 Marcadores Moleculares do T. cruzi
O T. cruzi exibe elevado grau de polimorfismo genético tanto no DNA nuclear quanto no kDNA e as técnicas de Biologia Molecular utilizadas para o estudo desta variabilidade genética permitiram a identificação de marcadores genotípicos polimórficos com a capacidade de confirmar a homogeneidade ou heterogeneidade do parasito (MACEDO et al., 2004; MILES et al., 2009).
Ao longo de décadas de pesquisa foram descritas na literatura várias metodologias baseadas na PCR utilizando diferentes combinações de alvos moleculares para corroborar a variabilidade genética do T. cruzi. Entre estas metodologias destacam-se a análise dos esquizodemas (MOREL et al.,1980), a Impressão digital de DNA (MACEDO et al., 1992), o RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA) (TIBAYRENC et al., 1993), o SSR – PCR (Simple Sequence Repeat – PCR) (OLIVEIRA et al., 1997), o LSSP-PCR (Low-stringency Single Specific primer PCR) (VAGO et al., 1996), a análise de perfis de microssatélites (OLIVEIRA et al., 1998; RAMOS, 2017; VALADARES et al., 2008), o DNA satélite (MARTINS, 2007), o rDNA 24Sα (SOUTO et al., 1996), os genes de mini-éxon (BURGOS et al., 2007; ZINGALES et al., 2012) e o gene para a subunidade II da enzima mitocondrial Citocromo Oxidase (FREITAS et al., 2006).
Diante dos vários marcadores moleculares descritos em T. cruzi, a seguir, tem-se uma descrição mais detalhada sobre os marcadores rDNA 24Sα, mini-éxon e Citocromo Oxidase II, os quais são alvos de estudo neste trabalho.
I.9.1 rDNA 24Sα
Dentre os eucariotos, os tripanosomatídeos tem uma característica distinta em relação à organização dos rRNA, as subunidades maior e menor dos ribossomos são notavelmente maiores (HERNANDEZ et al., 1990). Na subunidade maior encontram-se dois RNAs de alto peso molecular 24Sα e 24Sβ e seis RNAs de baixo peso molecular (S1 a S6) (WHITE; RUDENKO; BORST, 1986).
Em um estudo comparativo sobre as sequências do gene para a subunidade 24Sα do rRNA do T. cruzi e outros tripanosomatídeos foi observado uma alta similaridade entre as espécies avaliadas, exceto para uma região com cerca de 100pb na extremidade 3’ do gene do T. cruzi, a qual foi denominada de região divergente D7 (SOUTO; ZINGALES, 1993).
Os iniciadores desenhados para esta região mostraram um polimorfismo de tamanho no produto de amplificação por PCR entre as cepas do T. cruzi gerando fragmentos de 110pb para T. cruzi I e III, de 125 T. cruzi II e VI, de 119 para T. cruzi IV e de 110 e 125, simultaneamente, para T. cruzi V (AUGUSTO-PINTO et al., 2003; PIMENTA, 2002; SOUTO et al., 1996; ZINGALES et al., 2009; 2012).
I.9.2 Mini-éxon
Os genes de mini-éxon, presentes no DNA nuclear, existem em centenas de cópias in tandem no genoma do T. cruzi e são responsáveis por codificar uma sequência idêntica de 39pb chamada de splice leader que é adicionada na extremidade 5’ de todos os mRNAs produzidos por tripanosomatídeos através de um mecanismo de trans-splicing. A função específica da splice leader não é conhecida, mas existem evidências de que ela confere estabilidade ao mRNA, auxiliando também a interação do mRNA com os ribossomos (TOMASINI et al., 2011). Através de um alinhamento comparativo dos genes de mini-éxon de diferentes cepas do T. cruzi foi observado para esse gene a presença de regiões de sequência altamente conservadas de 39pb (exons), regiões semelhantes de 73pb com mais de 98% de
similaridade (introns) e regiões intergênicas divergentes com menos de 59% de similaridade (MACEDO; SEGATTO, 2010; SOUTO et al., 1996).
Inicialmente, estudos da região intergênica do gene mini-éxon mostraram a presença de dois produtos nos ensaios de PCR com tamanho de 300 (atualmente característico de T. cruzi II) e 350pb (característico de T. cruzi I) (SOUTO et al., 1996). Anos mais tarde, em ensaios de PCR realizados por Burgos e colaboradores (2007) empregando iniciadores para a unidade repetitiva do mini-éxon do T. cruzi foram detectados fragmentos de aproximadamente 150pb, correspondente, na atual classificação do T. cruzi, para as DTUs T. cruzi I, II, V e VI ou de aproximadamente 200pb para as DTUs T. cruzi III e IV.
I.9.3 Citocromo Oxidase II (COII)
O gene para a subunidade II da citocromo oxidase está presente nos maxicírculos do kDNA. A sequencia de DNA dos maxicírculos corresponde ao DNA mitocondrial em outros organismos eucarióticos e codifica várias subunidades de complexos de proteínas que catalisam a fosforilação oxidativa (WESTENBERGER et al., 2006).
Freitas e colaboradores (2006) desenvolveram um método de PCR-RFLP para realizar a tipagem do genoma mitocondrial das populações do T. cruzi. Após a amplificação por PCR de um fragmento de 375pb correspondente à extremidade 3' do gene para a enzima Citocromo Oxidase II e digestão com a enzima de restrição AluI para várias cepas e clones do T. cruzi foram encontrados três haplogrupos mitocondriais com diferentes perfis de restrição: A (constituído de cepas pertencentes a DTU T. cruzi I), B (cepas T. cruzi III, IV, V e VI) e C (cepas T. cruzi II).
I.10 Diagnóstico molecular da doença de Chagas
Segundo Galvão et al. (2003) o uso de testes parasitológicos convencionais (xenodiagnóstico e hemocultura) para o diagnóstico da doença de Chagas é dificultado por sua baixa sensibilidade, uma vez que mais da metade dos indivíduos não tratados tem a possibilidade de um resultado negativo por esses testes. Além disso, esses testes são demorados e não estão comercialmente disponíveis. A introdução da PCR para o diagnóstico da doença de Chagas abriu perspectivas mais
amplas, pois demonstrou maior sensibilidade para detectar o T. cruzi, principalmente em pacientes chagásicos crônicos, onde são encontrados níveis baixos de parasitos circulantes no sangue.
Em um estudo que investigou se a PCR poderia facilitar a detecção precoce do T. cruzi em amostras de pacientes com doença de Chagas que realizaram transplante cardíaco, foram realizados ensaios de PCR direcionados para os marcadores rDNA 24Sα e kDNA e comparou-se a eficiência dessa técnica com outros testes convencionais (histopatológico, parasitológico e hemocultura). Nos resultados encontrados foi observado uma boa associação entre o diagnóstico por PCR e os sinais clínicos da doença, indicando que essa abordagem é adequada para o diagnóstico precoce da reativação da doença de Chagas, com alto potencial para auxiliar os médicos nas decisões de tratamento (DA COSTA et al., 2017).
O diagnóstico molecular da doença de Chagas é muito importante em vários casos como no diagnóstico precoce da transmissão congênita em recém-nascidos onde a presença de anticorpos anti T. cruzi maternos pode produzir resultados falso-positivos, em casos de infecções orais para um diagnóstico específico e mais rápido, na detecção precoce da doença de Chagas em receptores e doadores de órgãos, na monitorização da reativação da doença de Chagas em pacientes imunodeprimidos devido a transplante ou HIV positivo e na avaliação da resposta ao tratamento, pois a detecção de conversão sorológica negativa em pacientes tratados com um desfecho favorável pode levar muitos anos para ocorrer (SCHIJMAN, 2018).
Os ensaios de PCR mais amplamente utilizados para fins de diagnóstico molecular têm como alvo o DNA do cinetoplasto (kDNA) ou as regiões do DNA satélite. Ambos são alvos que estão presentes em múltiplas cópias no genoma do parasito, o que aumenta a sensibilidade da detecção (BALOUZ; AGÜERO; BUSCAGLIA, 2017). De acordo com Qvarnstrom et al. (2012) a sensibilidade para detecção do parasito através de ensaios de PCR em Tempo Real foi de 0,1fg/µL em uma amostra de T. cruzi I e de 1fg/µL T. cruzi IV utilizado esses marcadores. No entanto esses marcadores não são capazes de distinguir o T. cruzi em suas diferentes DTUs o que seria de grande importância para melhor compreensão da epidemiologia e patologia da doença de Chagas (IZETA-ALBERDI et al., 2016).
Os marcadores rDNA 24Sα, mini-éxon e Citocromo Oxidase II quando utilizados conjuntamente são capazes de distinguir o T. cruzi em suas diferentes DTUs e já foram utilizados em vários estudos para o diagnóstico e a genotipagem do
T. cruzi como, por exemplo, no monitoramento de crianças nascidas de mães com doença de Chagas na Argentina (BURGOS et al., 2009), em amostras de pacientes chagásicos agudos no estado do Pará (SILVA, 2016) e na Venezuela (DE NOYA et al., 2016) e em amostras de pacientes chagásicos crônicos na Amazônia brasileira (SANTANA et al., 2014), no estado da Bahia (SANTOS, 2014) e no estado do Rio Grande do Norte (MARTINS, 2014).
II JUSTIFICATIVA
O T. cruzi é um parasito complexo e heterogêneo em suas linhagens filogenéticas e tal complexidade gera efeitos relevantes na virulência, transmissão congênita e na severidade da doença de Chagas. Além disso, as DTUs propostas para o T. cruzi tem mostrado diferenças marcantes entre as cepas quanto à distribuição geográfica, propriedades biológicas e susceptibilidade às drogas utilizadas no tratamento da doença de Chagas (revisado por ZINGALES, 2017).
Em hospedeiros e reservatórios para o T. cruzi as infecções multiclonais não são excepcionais, mas, em muitos casos, inevitáveis. Em áreas endêmicas, os habitantes de longo prazo podem ser repetidamente infectados por múltiplos contatos com diferentes triatomíneos, que por sua vez podem ter se alimentado de vários outros humanos ou mamíferos infectados, favorecendo o surgimento de populações multiclonais do T. cruzi, as quais são geralmente compostas por duas subpopulações do parasito (MESSENGER; MILES; BERN, 2015). Tais infecções multiclonais podem levar a alterações nas propriedades biológicas do parasito e também no curso clínico e tratamento etiológico da doença de Chagas. Neste contexto, a identificação das subpopulações presentes numa cepa multiclonal do T. cruzi é de extrema importância, pois pode ter impacto direto no prognóstico e na morbidade da doença (revisado por ZINGALES, 2017).
Segundo Jansen et al. (2015) hospedeiros naturalmente infectados no ambiente silvestre raramente são parasitados por uma única população do parasito. Em seus estudos sobre a distribuição de infecções por T. cruzi em animais silvestres naturalmente infectados no Brasil foram detectados 16% de infecções mistas com diferentes DTUs nos mamíferos positivos para hemocultura e a combinação mais frequente foi de T. cruzi I com T. cruzi II. Em outro estudo, uma porcentagem de 48% de infecções mistas foi observada em amostras de humanos e cães na Argentina, sendo que as combinações mais frequentes encontradas foram de T. cruzi V com T. cruzi VI em humanos e T. cruzi I com T. cruzi VI em cães (MONJE-RUMI et al., 2015).
Embora tenham sido descritos na literatura vários trabalhos identificando populações multiclonais do T. cruzi em amostras coletadas de hospedeiros e vetores, não foram encontrados estudos que relatem sobre a sensibilidade dos marcadores moleculares nos ensaios de PCR para a detecção de cada uma das subpopulações presentes nestas cepas.
Assim, partindo destes pressupostos de que populações do T. cruzi de diferentes DTUs podem coexistir dentro de uma cepa multiclonal e devido à escassez de estudos na literatura referentes à sensibilidade dos marcadores moleculares nos ensaios de PCR para a caracterização dessas misturas populacionais, tem-se como meta deste trabalho investigar a sensibilidade dos ensaios de PCR para os marcadores moleculares rDNA 24Sα, mini-éxon e Citocromo Oxidase II, que conjuntamente são capazes de identificar as diferentes DTUs do T. cruzi, empregando misturas artificiais duplas de populações do T. cruzi pertencentes às diferentes DTUs e amostras de tecido cardíaco de pacientes chagásicos crônicos.
Além disso, em um estudo realizado por Valadares et al. (2012) foi demonstrado que as subpopulações nas cepas multiclonais estão presentes em diferentes proporções e, diante deste achado, tem-se também como meta, estabelecer a quantidade mínima de DNA do parasito necessária nos ensaios de PCR para a identificação precisa de cada uma das subpopulações.
Assim, com este estudo, os marcadores moleculares de maior sensibilidade serão identificados viabilizando o seu uso preferencial em estudos envolvendo a detecção das subpopulações presentes nas cepas multiclonais do T. cruzi e nas análises populacionais de amostras de pacientes chagásicos.
