V.5.1 PCR convencional
A Figura 18 apresenta a sensibilidade de detecção para os marcadores moleculares empregando a técnica de PCR convencional para as diluições seriadas da mistura JG e 231. Foi possível detectar de forma satisfatória e simultânea o DNA das duas cepas até no nível de 10, 1 e 10 picogramas para os rDNA 24Sα, mini- éxon e Citocromo Oxidase II, respectivamente.
Os resultados também mostram que foi possível detectar somente o DNA da cepa 231 no nível de 200fg para o marcador mini-éxon e o DNA da cepa JG no nível de 1pg para o marcador Citocromo oxidase II.
V.5.2 Full Nested PCR
A Figura 19 apresenta a sensibilidade de detecção para os marcadores moleculares empregando a técnica de Full Nested PCR para as diluições seriadas da mistura JG e 231. Foi possível detectar de forma satisfatória e simultânea o DNA das duas cepas até no nível de 200 fg para os três marcadores analisados.
Entretanto, para o marcador rDNA 24Sα foi verificado a amplificação do fragmento de 110pb no nível de 100fg para a cepa 231 e para o marcador mini-éxon teve-se a amplificação do fragmento ~150pb no nível de 100fg para a cepa JG e apenas uma amplificação residual do fragmento de ~200pb da cepa 231.
Figura 18 – Ensaios de PCR convencional para os marcadores rDNA 24Sα, mini- éxon e Citocromo Oxidase II empregando diluições seriadas da mistura artificial dupla 231 e JG. Géis de poliacrilamida 6% corados com nitrato de prata mostrando em (A) amplificação do gene rDNA 24Sα, em (B) mini-éxon e em (C) COII para as diluições seriadas de 1ng/µL até 10fg/µL. É possível observar os fragmentos de 110 e 125pb, ~200 e ~150pb, 294 e 212pb para as cepas 231 e JG nas amplificações para os marcadores rDNA 24Sα, mini-éxon e Citocromo Oxidase II, respectivamente. PM: Peso Molecular de 50pb (Invitrogen). Branco: controle negativo da PCR (sem DNA).
A
B
Figura 19 – Ensaios de PCR através do protocolo de Full Nested PCR dos marcadores rDNA 24Sα, mini-éxon e Citocromo Oxidase II empregando diluições seriadas da mistura artificial dupla 231 e JG. Géis de poliacrilamida 6% corados com nitrato de prata mostrando em (A) amplificação do gene rDNA 24Sα, em (B) mini- éxon e em (C) COII para as diluições seriadas de 1ng/µL até 10fg/µL. É possível observar fragmentos de 110 e 125pb, ~200 e ~150pb, 294 e 212pb para as cepas 231 e JG nas amplificações para os marcadores rDNA 24Sα, mini-éxon e Citocromo Oxidase II, respectivamente. PM: Peso Molecular de 50pb (A e C) e 1Kb (B) (Invitrogen). Branco 1 e 2: controle negativo da PCR (sem DNA) para a primeira e segunda amplificação.
B
C
A
V.6 Ensaios de PCR para avaliar a sensibilidade dos marcadores moleculares empregando amostras de tecido cardíaco de pacientes chagásicos e determinação da DTU
V.6.1 PCR convencional
Através desta estratégia foi possível detectar amplificações dos fragmentos específicos para os três marcadores rDNA 24Sα, mini-éxon e COII em 3 (20%), 7 (47%) e 2 (13%) dos 15 pacientes analisados, respectivamente. Não houve a amplificação simultânea de dois fragmentos de DNA específicos para os marcadores em nenhum dos pacientes, podendo isso inferir que os pacientes possam estar infectados com apenas uma população do T. cruzi ou por uma população multiclonal com subpopulações pertencentes a uma mesma DTU. Pode-se inferir também que haja uma população multiclonal com diferentes DTU’s, porém não houve uma quantidade mínima de DNA para detecção de todas as subpopulações (Figura 20).
V.6.2 Full Nested PCR
A Figura 21 mostra as amplificações obtidas para os marcadores rDNA 24Sα, mini-éxon e COII e, através dela, foi possível detectar apenas um fragmento de DNA específico para os três marcadores em 10 (67%), 15 (100%) e 8 (53%) dos 15 pacientes analisados, respectivamente. Para o marcador mini-éxon foi observada em 5 pacientes analisados uma fraca, porém visualmente detectável, amplificação do fragmento de ~150pb. Novamente, não houve a amplificação simultânea de dois fragmentos de DNA específicos para os marcadores em nenhum dos pacientes analisados, corroborando o achado anterior.
V.6.3 Determinação da DTU
Os resultados dessa análise podem ser observados na Tabela 9. Entretanto, somente para as amostras que tiveram amplificações positivas para os três marcadores foi possível determinar com segurança a sua respectiva DTU e para as outras apenas as possibilidades de acordo com os fragmentos de DNA amplificados nos ensaios de PCR.
Figura 20 – Ensaios de PCR convencional para os marcadores rDNA 24Sα, mini- éxon e Citocromo Oxidase II empregando o DNA extraído de tecido cardíaco de pacientes chagásicos crônicos. Géis de poliacrilamida 6% corados com nitrato de prata mostrando em (A) amplificação do gene rDNA 24Sα, em (B) mini-éxon e em (C) COII. É possível observar a amplificação dos fragmentos de 110, ~150 e 212pb para os marcadores rDNA 24Sα, mini-éxon e Citocromo Oxidase II, respectivamente. PM: Peso Molecular de 50pb (A) e 1Kb (B e C) (Invitrogen). Controle Positivo: DNA das cepas 231 e JG (100pg/μL). C.N.: DNA humano de paciente não chagásico (5ng/μL) como controle negativo. Branco: controle negativo da PCR (sem DNA).
B
A
85
Figura 21 – Ensaios de PCR através da estratégia de Full Nested PCR para os marcadores rDNA 24Sα, mini-éxon e Citocromo Oxidase II empregando o DNA extraído de tecido cardíaco de pacientes chagásicos crônicos. Géis de poliacrilamida 6% corados com nitrato de prata mostrando em (A) amplificação do gene rDNA 24Sα, em (B) mini-éxon e em (C) COII. É possível observar a amplificação dos fragmentos de 110, ~150 e 212pb para os marcadores rDNA 24Sα, mini-éxon e Citocromo Oxidase II, respectivamente. PM: Peso Molecular de 50pb (A) e 1Kb (B e C) (Invitrogen). Controle Positivo: DNA das cepas 231 e JG (100pg/μL). CN: DNA humano de paciente não chagásico (5ng/μL) como controle negativo. Branco 1 e 2: controle negativo da PCR (sem DNA) para a primeira e segunda amplificação.
A
B
Tabela 9 – Determinação da DTU para as populações do T. cruzi identificadas nas análises de amostras de tecidos cardíacos de pacientes chagásicos crônicos.
*: Amostras de pacientes que tiveram a DTU do T. cruzi determinada com segurança. -: Não houve amplificação.
Pacientes
Marcadores
DTUs
(ZINGALES et al., 2009) rDNA 24Sα Mini-éxon Citocromo
Oxidase II *ACP 125pb ~150pb 212pb II CJM - ~150pb - I, II, V ou VI CASM 125pb ~150pb - II ou VI *FMC 125pb ~150pb 212pb II *GMS - ~150pb 212pb II JC P 125pb ~150pb - II ou VI *JCS 125pb ~150pb 212pb II *JFS 125pb ~150pb 212pb II *JLJ 125pb ~150pb 212pb II *MASS 125pb ~150pb 212pb II MGRS - ~150pb - I, II, V ou VI MJM - ~150pb - I, II, V ou VI *MLFM 125pb ~150pb 212pb II TBO 125pb ~150pb - II ou VI RVS - ~150pb - I, II, V ou VI
Embora o genoma de algumas cepas ou clones do T. cruzi tenham sido publicados nos últimos anos (EL-SAYED et al., 2005; FRANZEN et al., 2011; GRISARD et al., 2014), muitos aspectos da estrutura populacional e evolução deste parasito permanecem ainda não elucidados (TIBAYRENC; AYALA, 2002). Dentro destes aspectos, diversos estudos biológicos e moleculares têm sido realizados e revelaram uma grande variabilidade genética e fenotípica entre as cepas do T. cruzi que circulam entre insetos vetores e hospedeiros mamíferos (revisado por ZINGALES, 2017). Essa grande diversidade intraespecífica, despertou o interesse de vários estudiosos que baseados em análises de características biológicas, bioquímicas e moleculares do parasito estabeleceram um novo consenso para a divisão da espécie T. cruzi em seis Discretas Unidades Taxonômicas (DTUs) chamadas de T. cruzi I a T. cruzi VI (ZINGALES et al., 2009).
Estudos sobre os polimorfismos intraespecíficos do T. cruzi sugerem que a reprodução sexual é rara e que a estrutura da população é predominantemente clonal. Além disso, as populações do parasito podem apresentar propriedades biológicas distintas entre si e coexistir dentro de um mesmo hospedeiro sem recombinações, formando as populações monoclonais ou multiclonais do parasito (TIBAYRENC; AYALA, 2002).
Usualmente, as cepas do T. cruzi são obtidas pela cultura em laboratório dos parasitos isolados de vetores triatomíneos ou de hospedeiros mamíferos. Os seres humanos em áreas endêmicas podem ser infectados por múltiplos contatos com diferentes triatomíneos e estes, por sua vez, podem se alimentar de diferentes indivíduos infectados proporcionando a formação de populações multiclonais em hospedeiros e vetores, levando ocasionalmente ao isolamento de populações multiclonais quando crescidas em meio de cultura nos laboratórios (JANSEN et al., 2015; MACEDO; PENA, 1998; MESSENGER; MILES; BERN, 2015).
Fundamentados em análises de microssatélites Oliveira et al. (1998) e Valadares et al. (2008, 2012) demonstraram que algumas cepas do T. cruzi possuíam mais de dois alelos para um determinado loco de microssatélite indicando que estas cepas potencialmente seriam multiclonais. Estas cepas multiclonais foram predominantemente isoladas de reservatórios e vetores silvestres e também de alguns pacientes na fase aguda da doença de Chagas. Essas análises de microssatélites também demonstraram que a porcentagem de populações multiclonais diminui gradativamente quando comparadas as cepas do T. cruzi
isoladas do ciclo silvestre com aquelas isoladas de hospedeiros humanos na fase aguda e crônica da doença de Chagas, apontando que o sistema imune funciona como um seletor dos clones mais adaptados à infecção humana (MACEDO; PENA, 1998).
Assim, as cepas do T. cruzi dentro de uma determinada DTU devem ser consideradas como um conjunto de clones estreitamente relacionados que podem ser semelhantes ou diferentes geneticamente, constituindo as populações mono ou multiclonais do parasito. Uma metodologia que demonstrou ser capaz de identificar indubitavelmente os diferentes clones presentes em uma população multiclonal foi a adoção do FACS Cell Sorter. Esta estratégia separa as células por fluorescência em placas de 96 poços, uma vez que o T. cruzi é um eucarioto unicelular. As análises de microssatélites em células únicas do parasito separadas por FACS Cell Sorter mostraram ser muito úteis, principalmente no que diz respeito ao estudo da composição e da proporção de cada clone presente nas cepas multiclonais do parasito isoladas naturalmente (VALADARES et al., 2012).
Além dos microssatélites, outros marcadores moleculares descritos para o T.
cruzi, como o rDNA 24Sα (SOUTO et al., 1996), a região espaçadora dos genes de
mini-éxon (BURGOS et al., 2007) e o gene para a subunidade II da enzima mitocondrial Citocromo Oxidase (FREITAS et al., 2006) também já foram empregados para avaliar se uma determinada população do parasito apresenta uma constituição monoclonal ou multiclonal. Entretanto, como estes marcadores são menos polimórficos que os microssatélites, eles podem ser empregados apenas quando se tem uma mistura de populações pertencentes às diferentes DTUs, as quais podem ser rapidamente identificadas pelos perfis específicos gerados para estes marcadores (D’ÁVILA et al., 2009).
Uma vez que parte considerável de pacientes chagásicos em regiões endêmicas ou vetores em ambiente silvestre podem estar infectados com diferentes populações do T. cruzi formando as cepas multiclonais, as quais geralmente são compostas por duas subpopulações do parasito e, aliado ao fato destas populações estarem presentes em diferentes proporções nestes hospedeiros, tornam-se relevantes estudos que permitam a identificação precisa destas populações empregando marcadores moleculares que exibam um alto grau de sensibilidade nos ensaios de PCR. Assim, a identificação de populações multiclonais nos hospedeiros
depende primariamente da sensibilidade dos ensaios de PCR e do marcador molecular empregado (VALADARES et al., 2012).
Baseados nestes fatos e devido à escassez de dados referentes à sensibilidade dos marcadores moleculares nos ensaios de PCR para caracterização genética das subpopulações em cepas multiclonais do T. cruzi, foram empregadas neste trabalho misturas artificiais duplas de diferentes populações do T. cruzi para avaliar a sensibilidade dos marcadores rDNA 24Sα, mini-éxon e Citocromo Oxidase II, os quais são empregados rotineiramente nos laboratórios de pesquisa para a identificação segura das respectivas DTUs do parasito e amostras de tecido cardíaco de pacientes chagásicos.
Inicialmente foi isolado o DNA genômico das cepas e clones do T. cruzi: Sílvio X10 cl1 (T. cruzi I), JG (T. cruzi II), 231 (T. cruzi III), AM 64 (T. cruzi IV), CanIII cl1 (T. cruzi IV) e CL Brener (T. cruzi VI) e a concentração destes DNAs foi estimada por espectrofotometria a 260nm, cujos valores variaram de 45 a 319ng/µL. Essa diferença de concentrações foi devida principalmente a uma diferença do número de células do parasito contida no meio de cultura utilizado para a extração.
Para avaliar a pureza das amostras de DNA genômico recém-isoladas foram analisadas as medidas das relações A260/280 e A260/A230. A relação A260/280 é utilizada
para avaliar o grau de contaminação do DNA por proteínas, onde os valores estimados de indicação de pureza do DNA devem estar entre 1,6 a 2,0. As amostras apresentaram valores entre 1,87 e 2,0 indicando que as soluções de DNA estavam isentas de contaminação por proteínas. Já relação A260/A230 reflete a contaminação
por substâncias, tais como, carboidratos, peptídeos, fenóis e compostos aromáticos e, no caso de amostras puras, a razão deve ter valores próximos a 2. Nas amostras analisadas foi observado valores entre 2,08 e 2,34 indicando a pureza das soluções de DNA (VOOLSTRA et al., 2006).
Após a estimativa da concentração e pureza para as soluções de DNA, estas foram submetidas a uma eletroforese em gel de agarose 1% corado com brometo de etídeo para avaliar a integridade do DNA genômico. Foi observado que o DNA genômico em todas as amostras apresentou uma excelente qualidade, uma vez que foi detectada apenas uma única banda no gel de agarose de alto peso molecular sem indícios de degradação de material genético (ausência de “rastros”). Essa análise de integridade do DNA genômico foi importante no estudo pois permitiu que as diluições percentuais fossem realizadas com maior confiabilidade, uma vez que o
uso de material genético com sinais de degradação poderia afetar drasticamente a detecção de uma determinada subpopulação nos ensaios de PCR.
Anteriormente à realização das diluições percentuais, foram realizados ensaios de PCR para avaliar a equivalência da concentração dos DNA de 1ng/µL para as cepas ou clones que, posteriormente, iriam compor as misturas artificiais duplas. Para estes ensaios foi empregado o rDNA 24Sα, pois este marcador apresenta um maior polimorfismo de tamanho entre as diferentes DTUs comparado aos outros marcadores: (110pb para T. cruzi I e III, 125pb para T. cruzi II e VI, 119pb para T. cruzi IV e 110pb e 125pb, simultaneamente, para T. cruzi V). O Citocromo Oxidase II necessita de enzima restrição para sua análise e isso não seria financeiramente viável uma vez seria necessário realizar os ensaios de PCR diversas vezes até se obter amplificações semelhantes para as duas cepas das misturas artificiais e o mini-éxon, por sua vez, apresenta apenas um dimorfismo de tamanho (~150pb para T. cruzi I, II, V, VI e ~200pb T. cruzi III e IV) o que levaria a uma limitação na análise das misturas artificiais realizadas.
Os procedimentos de dosagem, diluição dos DNAs e amplificação do gene rDNA 24Sα, foram realizados repetidas vezes até se obter nos 10 ensaios de PCR bandas de mesma intensidade para cada uma das cepas ou clones das duplas, indicando qualitativamente que as concentrações das duas soluções de DNA estariam com equivalente concentração, uma característica de extrema importância para a produção das misturas artificiais para que não ocorressem amplificações preferenciais de uma cepa em relação a outra devido a diferença de concentração das soluções de DNA.
Além do ensaio de PCR para o marcador rDNA 24Sα para avaliar a equivalência das concentrações de DNA, um outro resultado que serve como dado confirmatório de que as diluições percentuais foram realizadas de maneira uniforme, foi a obtenção de perfis de amplificação duplos de mesma intensidade que aparecem para todas as diluições de 50%/50% das misturas para todos os marcadores empregados indicando a reprodutibilidade dos ensaios de PCR realizados e que as soluções de DNA foram dosadas corretamente. Além disso, é verificada nos perfis gerados pelas diluições uma diminuição gradual e progressiva do perfil de uma cepa e o aumento gradual e progressivo do perfil da outra cepa, confirmando novamente a uniformidade das diluições.
Uma análise mais precisa poderia ter sido realizada em paralelo para avaliar quantitativamente o DNA das cepas ou clones diluídos para 1ng/L, através da técnica de PCR em Tempo Real com a definição do CT (Cycle Threshold) na fase exponencial dos ensaios de PCR. Entretanto, em nosso Campus não se tem uma plataforma de PCR em Tempo Real em funcionamento e, além disso, este ensaio aumentaria os custos financeiros, uma vez que seria necessário repetir a análise até obter reações com o valor de CT iguais. Por estes motivos, optou-se em adotar o PCR convencional com a detecção dos produtos amplificados na fase de plateau, associado à eletroforese em gel de poliacrilamida corado com nitrato de prata, por ser um método mais simples, sensível, economicamente viável e que apresenta resultados confiáveis.
Nas amplificações do rDNA 24Sα das misturas artificiais duplas de T. cruzi I e T. cruzi IV (Sílvio X10 cl1/AM64 e Sílvio X10 cl1/CanIII cl1) para se avaliar a equivalência das concentrações dos DNAs foi observado, além das bandas esperadas para essas DTUs, a presença de duas bandas adicionais de tamanho entre 150 e 200pb. Essas bandas provavelmente são resultantes da formação de DNA heteroduplex, que são estruturas formadas quando se tem a renaturação de fitas de DNA originadas de alelos heterozigotos que apresentam diferenças em suas sequências, ocasionando a formação de alças devido à presença de bases mal pareadas dentro dos fragmentos amplificados. Assim, em uma eletroforese em gel de poliacrilamida não-desnaturante, o DNA heteroduplex difere em sua migração em relação aos fragmentos principais amplificados (FARRELL, 2017).
De fato, ao se analisar soluções de DNA de AM64 e CanIII cl1 (T. cruzi IV) juntamente com outras diferentes cepas do T. cruzi pertencentes a DTU T. cruzi I (D11, Colombiana e G) as mesmas duas bandas aparecem, mas quando se amplifica somente T. cruzi I ou T. cruzi IV para o rDNA 24Sα são observadas apenas as bandas esperadas para essas DTUs de 110 e 119pb, respectivamente (dados não mostrados). Este achado reforça o fato de que as duas bandas detectadas nos géis de poliacrilamida são provavelmente resultado da interação entre os produtos amplificados (heteroduplex) para estas duas DTUs e não de amplificações inespecíficas. Podendo-se sugerir também que a presença das duas bandas de heteroduplex pode ser uma forma de identificar populações multiclonais de T. cruzi I e IV, pois são bandas bem evidentes e foram verificadas em todas as amplificações onde ouve a mistura dessas duas DTU’s.
A seguir, foram realizadas 27 diluições percentuais para as sete misturas artificiais duplas utilizando 6 diferentes cepas ou clones do T. cruzi pertencentes às diferentes DTU´s: DTU I (Sílvio X10 cl1), II (JG), III (231), IV (AM 64 e CanIII cl1) e VI (CL Brener). Não foram produzidas misturas artificiais contendo cepas da DTU V, pois seus representantes apresentam características híbridas entre as DTUs T. cruzi T. cruzi II e III (FREITAS et al., 2006; WESTENBERGER et al., 2005). Assim, a cepas pertencentes a DTU V apresentam um perfil duplo de amplificação com os fragmentos de 110 e 125pb para o rDNA 24Sα e, também em alguns casos, para o mini-éxon de ~150 e ~200pb (ZINGALES et. al., 2012), dificultando a sua identificação nas misturas artificiais duplas. Para a identificação da DTU V seria necessário empregar outros marcadores moleculares como, por exemplo, os microssatélites que por apresentarem altos níveis de polimorfismo conseguem discriminar as cepas do T. cruzi de forma individual e não por grupos filogenéticos como os marcadores usados neste trabalho (OLIVEIRA et al., 1998; RAMOS, 2017; VALADARES et al., 2008).
As vinte e sete diluições percentuais foram realizadas variando a concentração de uma cepa em relação à outra partindo de um nível máximo de 1000pg/L até um valor mínimo de 1pg/L, devido às limitações de pipetagem. As pequenas variações do percentual nos extremos das diluições foram realizadas com o intuito de identificar com precisão o nível de sensibilidade dos marcadores moleculares nos ensaios de PCR a partir de amostras de DNA genômico obtidas de culturas do T. cruzi mantidas em laboratório. Além disso, com a pequena escala de variação entre as quantidades de DNA de uma diluição em comparação a outra, foi possível determinar a quantidade mínima de DNA necessária para a detecção de cada um dos componentes nas misturas duplas.
Comparando os limites de detecção para cada DTU com os três marcadores nas diluições percentuais o marcador mini-éxon foi o que apresentou maior sensibilidade na detecção do DNA do T. cruzi. Então, em análises onde não se sabe quais DTUs estão presentes nas amostras, o mini-éxon seria o marcador que possivelmente necessitaria de uma menor quantidade de DNA, pois, em um panorama geral, apresentou os menores limites de detecção comparado aos marcadores rDNA 24Sα e Citocromo oxidase II. A sensibilidade do marcador mini- éxon chegou a ser aproximadamente 10 vezes superior em comparação com o gene rDNA 24Sα e 16 vezes em comparação com Citocromo Oxidase II. Este resultado
pode estar relacionado com a diferença do número de cópias presentes de cada marcador no genoma do parasito: os genes de rDNA 24Sα apresentam um número de cópias em torno de 110 cópias (BRISSE et al., 2003) e o Citocromo Oxidase II em torno de 20 a 50 cópias, pois estão presentes nos maxicírculos do kDNA (MESSENGER et al, 2012). Já os genes de mini-éxon podem apresentar centenas de cópias distribuídas no genoma nuclear (TOMASINI, et al., 2011). Com base nesta