Diagnóstico molecular

Um total de 69 amostras de fezes para deteção de Cryptosporidium spp. e 79 para deteção de G. duodenalis, positivas por microscopia e/ou ELISA, foram submetidas a deteção e caracterização molecular. Na figura 2.2 encontra-se esquematizado o fluxograma de processamento das amostras biológicas desde a recolha até à análise das sequências de ADN.

57 Figura 2.2. Fluxograma dos procedimentos executados desde a recolha das amostras fecais à análise das sequências de ADN dos isolados de Cryptosporidium spp. e Giardia duodenalis obtidos neste estudo.

2.6.1. Extração de ADN genómico de oocistos de Cryptosporidium spp. e quistos de Giardia duodenalis

Neste estudo, o ADN genómico de oocistos de Cryptosporidium spp. e quistos de G.

duodenalis foi extraído das amostras fecais previamente concentradas, usando o kit comercial da QIAgen FastDNA SPIN (QIAGEN, Alemanha), de acordo com as indicações do fabricante (201). Para o controlo de qualidade, para cada dez amostras de fezes submetidas ao processo de extração de ADN, foi incluído um controlo negativo (água). O procedimento encontra-se descrito abaixo:

69 79

Positivos:

27 - bg Positivos:

18 – ssu rRNA 27 - gp60

Excluídas 996 crianças por falta

de amostras

58 Em microtubos de 2 ml foram colocados 220 mg das amostras de fezes a testar e foram adicionados 1,4 ml do tampão ASL. Os tubos foram agitados num agitador por cerca de 1 min até que a mistura se tornasse homogénea.

A suspensão dos tubos foi de seguida aquecida a 70°C durante 5 min (com o objetivo de potenciar o rendimento do ADN total e também para ajudar na lise das bactérias e outros organismos). Esta suspensão, de seguida, foi brevemente agitada e centrifugada à velocidade máxima durante 1 min para separar as fases das partículas. Com as fases já separadas, foram recuperados cerca de 1,2 ml do sobrenadante para um novo microtubo de 2 ml onde foi adicionado um comprimido inibidor. Os tubos foram agitados até a completa dissolução do comprimido, seguindo-se uma curta incubação em repouso de 1 min à temperatura ambiente (para permitir que fossem adsorvidos todos os inibidores).

Uma centrifugação à velocidade máxima foi feita durante 3 min e o sobrenadante foi recolhido para um novo microtubo de 1,5 ml, seguindo-se nova centrifugação nas mesmas condições que a anterior. A um novo microtubo de 1,5 ml foram adicionados 15 µl proteinase K e 200 µl do sobrenadante do passo anterior. Ainda, foram adicionados 200 µl do tampão AL e misturados brevemente num agitador. Esta suspensão foi incubada a 70°C durante 10 min e de seguida feita uma breve centrifugação para remover as gotículas. Em seguida, 200 µl do etanol (96 –100%) foram adicionados ao lisado e misturados num agitador. Este lisado foi transferido para colunas QIAamp spin devidamente marcadas e depois centrifugadas à velocidade máxima por 1 min. O líquido resultante foi descartado e a coluna foi colocada em novo microtubo coletor de 2 ml onde foram adicionados 500 µl Buffer AW1 (para lavagem) e centrifugados à velocidade máxima por 1 min. O líquido que passou pela coluna foi descartado, a coluna foi uma vez mais transferida para um novo microtubo de 2 ml onde foram adicionados 500 µl do tampão AW2 (para uma segunda lavagem) e centrifugados à velocidade máxima durante 3 min. O líquido foi descartado, a coluna foi para um novo tubo coletor e uma nova centrifugação à velocidade máxima foi realizada durante 1 min (com o intuito de remover o excesso do tampão AW2 que pudesse interferir na amplificação do ADN). Por fim a coluna foi transferida para um novo microtubo de 1,5 ml, o qual foi marcado com o mesmo código correspondente ao da coluna e 200 µl do tampão AE foram adicionados.

A coluna foi deixada a incubar por 1 min à temperatura ambiente (para eluir o ADN e depois centrifugada à velocidade máxima durante1 min). Os tubos contendo o ADN

59 foram depois conservados a –20°C.

2.6.2. Deteção e caracterização dos isolados de Giardia duodenalis e Cryptosporidium spp. por métodos moleculares

As amostras fecais anteriormente processadas para o diagnóstico parasitológico e positivas para Cryptosporidium spp. e para G. duodenalis foram submetidas respetivamente, à amplificação sequencial de dois genes ssu rRNA e gp60, e da bg através de técnicas de nested-PCR. Este método compreende uma das muitas abordagens da técnica PCR e traduz-se, essencialmente na realização de duas reações de amplificação consecutivas, usando para o efeito dois pares de oligonucleótidos iniciadores (primers) distintos. A reação inicial de amplificação utiliza um primeiro par de primers, o qual amplifica um fragmento relativamente grande que contém a sequência-alvo.

Posteriormente a segunda reação de amplificação emprega um segundo par de primers, o qual se liga às extremidades do amplicão obtido da primeira reação, o que resulta na amplificação de um segundo fragmento de dimensões mais reduzidas. Esta metodologia apresenta como vantagem o aumento da especificidade e sensibilidade da técnica de PCR (202).

A técnica de PCR compreende três fases: uma fase de desnaturação, uma fase de ligação com primers e uma fase de alongamento. Os produtos de cada etapa de síntese servem como modelo para as etapas seguintes, portanto uma amplificação exponencial é assim alcançada.

A desnaturação consiste na separação da dupla hélice de ADN em fitas simples, através da elevação da temperatura (em torno dos 94-98°C) que origina a quebra das ligações de hidrogénio entre as fitas (não podem ser mantidas a uma temperatura superior a 80°C) de ADN.

A ligação é a segunda etapa de PCR, realizada geralmente a uma temperatura relativamente baixa (entre 40°C e 70°C). Esta diminuição da temperatura tem o propósito de permitir que as ligações de hidrogénio se reestabeleçam. Assim sendo, os primers, sequências de fita simples curtas complementares a regiões que flanqueiam o ADN a ser amplificado, ligam-se mais facilmente do que a fita longa do ADN da matriz. Quanto

60 mais alta for a temperatura, mais seletiva é a ligação e consequentemente mais específica será.

A extensão constitui a terceira etapa de PCR e é realizada a uma temperatura de 72°C.

Esta etapa tem como finalidade a síntese da fita complementar. A enzima, Taq polimerase, liga-se às cadeias simples de ADN e catalisa a replicação usando os trifosfatos de desoxirribonucleosídeo (dNTP) e as regiões do ADN molde complementar dos iniciadores são assim sintetizadas seletivamente (203).

A caracterização do gene ssu rRNA tem como objetivo a identificação das espécies e/ou genótipos de Cryptosporidium spp. responsáveis pela infeção nos diversos hospedeiros infetados, enquanto a caracterização do gene gp60 tem como finalidade principal a determinação das famílias de subtipos e respetivos subtipos nos isolados de C. parvum e/ou de C. hominis.

Neste estudo utilizou-se o gene que codifica a bg para deteção molecular de ADN de Giardia através da amplificação de um fragmento do gene-alvo, por nested-PCR (204).

A aplicação de um método de genotipagem baseado na análise da sequência de um único gene, como a bg, exclusivo deste parasita e com elevada heterogeneidade sequencial, possibilita obter uma elevada resolução semelhante à genotipagem de sequências com vários genes (205).

No quadro 2.1, encontram-se descritas as sequências dos primers utilizados na amplificação de um fragmento dos genes ssu rRNA, gp60 de Cryptosporidium spp. e bg de G. intestinalis, pela técnica de nested-PCR.

Todas as reações de PCR foram processadas sequencialmente no termociclador T1 Thermocycler (Biometra, Alemanha) segundo as condições descritas para cada um dos respetivos genes. Em cada reação de PCR processada foi utilizada uma amostra com ADN de Cryptosporidium spp. ou G. duodenalis em condições ótimas de concentração, a qual funcionou como controlo positivo da reação, e uma amostra contendo água desionizada estéril em vez de ADN, a qual funcionou como controlo negativo, permitindo, este último, verificar a existência de possíveis contaminações devido a ADN exógeno. Os procedimentos foram efetuados numa câmara de segurança biológica de classe II (FASTER UltraSafe) para minimizar ao máximo possíveis contaminações.

61 2.6.3. Amplificação do gene ssu rRNA por nested-PCR

A amplificação do gene ssurRNA foi realizada numa primeira fase com os primers CrySSUF1 e CrySSUR2, seguida de uma segunda reação com o par CrySSUF3/CrySSUR4, sendo o tamanho do amplificão esperado na primeira reação de 1325 pb e na segunda entre 831- 838 pb dependendo do isolado (140). As duas reações de PCR foram realizadas num volume final de 25 μl, contendo a primeira 6,5 μl de água, 2.5 μl do tampão 10X (Tris-HCl 100 mM-pH 8,8 e KCl 500 mM), 2,5 μl a 25mM de MgCl2, 2 μl de dNTP a 10 mM, 1 μl de cada iniciador a 10 ρmol/μl, 1 μl de BSA a 10mg/μl, 0.5 U de DNA polimerase (5U/ μl) (Thermo Scientific) e 8 μl do DNA da amostra. A segunda reação foi executada sob as mesmas condições com exceção de água 10,5 μl e 4 μl do produto da primeira reação.

As condições de amplificação para ambas as reações de PCR foram idênticas: um ciclo de desnaturação inicial a 95°C, 5 min; 34 ciclos a 95°C, 30s de (desnaturação), 55°C, 45s (ligação), e 72°C, 1 min (extensão); e a fase de extensão final a 72°C, 10 min.

2.6.4. Amplificação do gene gp60 por nested-PCR

Para o gene gp60, foram utilizados os primers Crygp60F1 e Crygp60R1 para reação primária, gp60F2 e gp60R2 para a reação secundária (quadro 2.1). Os tamanhos dos produtos esperados para a primeira e a segunda reação correspondem a 460 pb e 360 pb, respetivamente (148). A amplificação por PCR foi realizada em um volume total de 25 μl, contendo a primeira reação 4,5 μl de água, 2,5 μl de10X do tampão (Tris-HCl 100 mM-pH 8,8 e KCl 500 mM), 2,5 μl a 25mM de MgCl2, 2 μl de dNTP a 10 mM, 1 μl de cada iniciador a 10 ρmol/μl, 3 μl de BSA a 10mg/μl, 0,5 U de DNA polimerase (5U/ μl) (Thermo Scientific) e 8 μl do DNA da amostra. Para a segunda reação foram alteradas as quantidades de água 9,5 μl, 1,5 μl de cada iniciador, 1 μl de BSA e 4 μl do produto da primeira reação mantendo-se as quantidades dos restantes reagentes.

As condições de amplificação foram: 1 ciclo de desnaturação inicial a 95°C por 5 min;

34 ciclos de desnaturação a 94°C por 45s, ligação a 50° C por 45s, extensão a 72° C por 1 min; extensão final a 72°C por 10 min.

62 2.6.5. Amplificação do locus β-giardina por nested-PCR

Para a deteção de G. duodenalis, foi amplificado o gene da bg, por nested-PCR. Para este procedimento foram utilizados dois pares de primers que diferem no seu tamanho e sequência nucleotídica (quadro 2.1).

As reações de amplificação foram efetuadas num volume total de 25 μl contendo a primeira reação 7 μl de água, 2,0 μl de10X do tampão (Tris-HCl 100 mM-pH 8,8 e KCl 500 mM), 1,5 μl a 50mM de MgCl2, 2 μl de dNTP a 10 mM, 1 μl de cada iniciador a 10 ρmol/μl, 2 μl de BSA a 10mg/μl, 0,5 U de DNA polimerase (5U/ μl) (Thermo Scientific) e 10 μl do DNA da amostra. Na segunda reação foram adicionados 10 μl de água, 3 μl do tampão, 1,5 μl de cada iniciador, 1 μl de BSA e 5 μl do produto da primeira reação, tendo os outros reagentes as mesmas quantidades da primeira reação.

Os primers GiaFW1 e GiaRv1 foram utilizados para a primeira reação e o par GiaFW2/GiaRv2 para segunda reação sob as seguintes condições: 1 ciclo de desnaturação inicial 95ºC, 34 ciclos de: desnaturação por 5 min, 45 segundos de Ligação* 65ºC/55ºC, 1 min de extensão a 72ºC e 10 min de extensão final 72ºC. Para a primeira reação eram esperados fragmentos de 753 pb e para a segunda reação eram esperados fragmentos de 511 pb (204).

* As condições de amplificação na primeira e na segunda reação são iguais, à exceção da temperatura de ligação (1ª reação: 65ºC; 2ª reação: 55ºC).

63 Quadro 2.1. Genes e primers utilizados na deteção de Cryptosporidium spp. e Giardia duodenalis

Gene Primers Sequência 5’ → 3’ Tamanho do

fragmento (pb) Ref.

ssu rRNA

CrySSU1 CrySSU2

CrySSU3 CrySSU4

TTC TAG AGC TAA TAC ATG CG

CCC ATT TCC TTC GAA ACA GGA

GGA AGG GTT GTA TTT ATT AGA TAA AG

AAG GAG TAA GGA ACA ACC TCC A

≈ 1325

≈ 831-838

(140)

gp60

gp60F1 gp60R1

CrygP60F2 CrygP60R2

ATA GTC TCC GC T GTA TCC GAG ATA TAT CTT GGT GCG

TCC GCT GTA TTC TCA GCC CGA ACC ACA TTA CAA ATG AGG T

≈460

≈360

(148)

bg

GiaFW1

GiaRV1

GiaFW2 GiaRV2

AAG CCC GAC GAC CTC ACC CGC AGT GC

GAG GCC GCC CTG GAT CTT CGA GAC GAC

GAA CGA ACG AGA TCG AGG TCC G CTC GAC GAG CTT CGT GTT

≈753

≈511

(204)

64 2.6.6. Visualização dos produtos de PCR dos genes ssu rRNA, gp60 e bg Os produtos de PCR obtidos na segunda reação da nested-PCR para os diferentes genes amplificados foram posteriormente submetidos a uma electroforese em gel de agarose a 1,5% em tampão Tris-borato-EDTA (TBE) 1X (Tris 1 M, ácido bórico 0,9 M e EDTA 0,01 M) e ao qual se adicionou 1x SYBR Safe ADNgel Stain (Invitrogen, Waltham, Massachusetts, Estados Unidos). Uma vez polimerizado, o gel foi colocado numa tina de electroforese e mergulhado em tampão TBE 1X. Posteriormente, a 17 μl de produto de PCR foi adicionado 1,5 μl de 6 X DNA loading dye (0,03% azul de bromofenol, 0,03%

xileno cianol FF, 60,0% glicerol, 60 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl [pH 7.6]) (Fermentas, Reino Unido). A migração dos produtos de PCR no gel foi realizada simultaneamente com um marcador de massa molecular de 1 quilobase (kb) ou 100 pb, Sigma-Aldrich®, Alemanha. Após a aplicação dos produtos de PCR e do marcador de massa molecular no gel, foi aplicada uma corrente elétrica de 100 volts durante 40 min. Os fragmentos de DNA amplificados foram visualizados no transiluminador (Vilber Lourmat, França) sob luz ultravioleta (UV) devido à emissão de fluorescência do GelRed^TM intercalado na cadeia de DNA. Os géis foram seguidamente fotografados e as bandas de interesse excisadas do gel com a ajuda de um bisturi e conservados em microtubos a 4ºC.