Universidade Nova de Lisboa
Instituto de Higiene e Medicina Tropical
Deteção de enteroparasitas e caracterização genética de Cryptosporidium spp. e Giardia duodenalis em crianças até aos 14 anos, com diarreia, em Moçambique
Ofélia Luís Nhambirre
TESE PARA A OBTENÇÃO DO GRAU DE DOUTOR. EM CIÊNCIAS BIOMÉDICAS ESPECIALIDADE DE PARASITOLOGIA
(Junho, 2022)
Universidade Nova de Lisboa
Instituto de Higiene e Medicina Tropical
Deteção de enteroparasitas e caracterização genética de Cryptosporidium spp. e Giardia duodenalis em crianças até aos 14 anos, com diarreia, em Moçambique
Autor: Ofélia Luís Nhambirre
Orientador: Doutora Nilsa Olívia Razão de Deus
Coorientador: Professora Doutora Olga Maria Guerreiro de Matos e Doutora Maria Luísa Lobo Ferreira da Costa
Tese apresentada para cumprimento dos requisitos necessários à obtenção do grau de Doutor em Ciências Biomédicas, especialidade de Parasitologia
Apoio financeiro do Instituto Camões - Instituto da Cooperação e da Língua, I.P.).
O fé li a L uí s N ha mb irr e D et eção d e e nt ero para si ta s e cara ct eri za ção g en ét ica de C ryp to sp or id iu m s pp . e G ia rd ia d uo de na li s em cri an ças a té a os 14 a no s, co m d iarr ei a, em Moç amb iq ue
i Artigo publicado relacionado ao doutoramento
Intestinal Parasites in Children up to 14 Years Old Hospitalized with Diarrhea in Mozambique, 2014–2019.
Ofélia Luís Nhambirre 1, Idalécia Cossa-Moiane, Adilson Fernando Loforte Bauhofer, Assucênio Chissaque, Maria Luisa Lobo, Olga Matos and Nilsa de Deus. Pathogens 2022, 11, 353. https://doi.org/10.3390/pathogens11030353.
Apresentações e participações em conferências
Detection of enteroparasites, namely Cryptosporidium spp. and Giardia duodenalis in children up to 14 years old, with diarrhea, in Mozambique.
Ofélia Luís Nhambirre, Idalécia Cossa-Moiane, Adilson Buhofer, Assucênio Chissaque, Maria Luisa Lobo, Olga Matos, Nilsa de Deus
The 15 International Workshop on Opportunistic Protists realizado de 15 a 17 Junho, 2021, České Budějovice, República Checa.
Intestinal parasites in children up to 14 years old, hospitalized with diarrhea in Mozambique, 2014-2019.
Ofélia Luís Nhambirre, Idalécia Cossa-Moiane, Adilson Buhofer, Assucênio Chissaque, Maria Luisa Lobo, Olga Matos, Nilsa de Deus
XII Jornadas Científicas do Instituto de Higiene e Medicina Tropical, 10 Dezember 2021.
Lisboa, Portugal. Apresentação oral.
Parasitas intestinais em crianças até 14 anos hospitalizadas com diarreia entre 2014-2019.
Ofélia Nhambirre, Idalécia Cossa-Moiane, Adilson Bauhofer, Assucênio Chissaque, Maria Lobo, Olga Matos, Nilsa de Deus.
XVII Jornadas Nacionais de Saúde, 8, 9 e 10 de setembro 2021. Maputo, Moçambique.
Poster.
Deteção de enteroparasitas e caracterização genética de Cryptosporidium spp. e Giardia duodenalis em crianças até aos 14 anos, com diarreia, em moçambique.
Ofélia Luís Nhambirre, Idalécia Cossa-Moiane, Adilson Buhofer, Assucênio Chissaque, Maria Luisa Lobo, Olga Matos, Nilsa de Deus.
XI Jornadas Científicas do Instituto de Higiene e Medicina Tropical, 10 Dezember 2020.
Lisboa, Portugal. Poster oral.
ii A única vez que você falha é quando você cai e permanece no chão.
Stephen Richards
iii À minha humilde família (Cosme de Jesus e Lara de Jesus), por compreenderem as várias horas em que estive ausente por causa do desenvolvimento deste trabalho
Aos meus pais (Luís Nhambirre e Maria Kambina), meus pilares
iv Agradecimentos
A Deus pelos dons que me deu nesta existência e por colocar em minha vida as pessoas que fizeram parte dessa trajetória.
Às minhas orientadoras Nilsa de Deus, Olga Matos e Maria Luísa Lobo que apesar da intensa rotina de suas vidas profissionais receberam-me e aceitaram orientar-me. As vossas valiosas lições académicas e de vida, fizeram de mim um nova pessoa. Hoje, sinto em mim uma grande evolução a nível pessoal e profissional. Obrigada por acreditarem em mim e me manterem motivada durante todo este processo.
Ao INS e aos colaboradores da ViNaDia, em particular o Adilson Bauhofer pela sua pronta disponibilidade e toda a ajuda e esclarecimentos na análise estatística deste estudo e a Idalécia Moiane por me ter aberto as portas do seu laboratório, pelo apoio material prestado, pelas trocas de ideias e apoio moral.
Às direções dos hospitais, aos enfermeiros e aos pais das crianças que consentiram participar do estudo, sem vocês, este estudo seria impossível.
Ao Valter Nuaila e Denise Brito pela ajuda nas análises filogenéticas Ao Instituto Camões e Língua, pela bolsa de formação.
À minha família, pela atenção prestada quando sempre precisei
Aos colegas do curso que juntos compartilhámos inúmeros desafios e sempre com o espírito colaborativo.
A todos os que direta ou indiretamente contribuíram para a minha formação académica e profissional.
v RESUMO
Palavras chaves: Diarreia; parasitas intestinais; Crianças; Moçambique.
As infeções parasitárias causadas por helmintas intestinais, estão entre as mais prevalentes infeções lentas em humanos no mundo, principalmente nos países em desenvolvimento, incluindo Moçambique e, com as infeções causadas por protozoários intestinais, contribuem significativamente para grande carga de doenças gastrointestinais nestes países, sobretudo nas crianças. Giardia duodenalis e Cryptosporidium spp. são dois organismos protozoários que infetam os humanos e diversas espécies animais e são conhecidos por apresentar um elevado potencial em causar diarreia. Existem em Moçambique alguns estudos sobre a epidemiologia das infeções provocadas por parasitas intestinais, contudo, esta informação é muito fragmentada e escassa sobretudo no que diz respeito à epidemiologia molecular de G. duodenalis e Cryptosporidium spp.
Este estudo teve como objetivo geral, determinar a frequência e os fatores relacionados com a infeção por parasitas intestinais (IPI) e caracterizar geneticamente G. duodenalis e Cryptosporidium spp. circulantes em crianças até aos 14 anos de idade com doença diarreica, nas regiões sul, centro e norte de Moçambique.
Para o estudo foram analisadas 1424 amostras de fezes diarreicas (do projeto ViNaDia, Moçambique) recrutadas em crianças até 14 anos em seis hospitais públicos das regiões sul, centro e norte de Moçambique. Uma única amostra de fezes foi colhida por criança e examinada por Microscopia Óptica (M.O.) usando a concentração de formol-éter e a técnica de coloração de Ziehl-Neelsen modificada para identificar parasitas intestinais, nomeadamente coccídeos e Cryptosporidium. As características sociodemográficas foram obtidas por meio de questionários. Para caracterização molecular foram utilisadas amostras positivas por M.O. assim como por imunoensaio enzimático (ELISA) (de outro subestudo do projeto ViNaDia). A caracterização genética foi realizada por nested-PCR com alvos nos genes β-giardina de G. duodenlais e ssu rRNA e gp60 de Cryptosporidium spp. Análises uni e bivariadas e regressão logística binária foram realizadas para descrever a população e determinar os fatores de risco. Níveis de significância de 5%
foram considerados significativos.
Pelo menos uma IPI foi detetada em 19,2% (273/1424) das crianças. Cryptosporidium spp. foi o parasita mais comum (8,1%; 115/1424). Poliparasitismo foi observado em 26,0% (71/273) das crianças estudadas, sendo a coinfeção Ascaris lumbricoides e Trichuris trichiura (26,8%; 19/71) a mais comum. A idade e província foram relacionadas com a presença de IPI (p-valor < 0,05). A maior ocorrência de IPI foi observada na estação das chuvas (outubro a março) com 23,1% (191/828) em relação aos períodos secos (abril a setembro) com 13,6% (80/588) (p-valor < 0,001 ). O subtipo IaA9G3 de C.
hominis foi o dominante nas crianças infetadas por Cryptosporidium e o subgenótipo AII de G. duodenalis foi o mais observado (56,6%; 13/23) na população pediátrica moçambicana.
Cryptosporidium spp. e a combinação A. lumbricoides/T. trichiura foram os principais parasitas intestinais observados em crianças hospitalizadas com diarreia em Moçambique.
Os dados de genotipagem sugerem que as principais vias de transmissão de G. duodenalis e Cryptosporidium em Moçambique são antroponóticas.
vi ABSTRACT
Key words: Diarrhea; intestinal parasites; Children; Mozambique.
Parasitic infections caused by intestinal helminths are among the most prevalent sluggish infections in humans in the world, mainly in developing countries, including Mozambique, and with infections caused by intestinal protozoa, they contribute significantly to large burdens of gastrointestinal diseases in these countries, especially in children. Giardia duodenalis and Cryptosporidium spp. are two protozoan organisms that infect humans and several animal species and are known to have a high potential to cause diarrhea. There are some studies in Mozambique on the epidemiology of diseases caused by intestinal parasites; however, this information is very fragmented and scarce regarding the molecular epidemiology of G. duodenalis and Cryptosporidium spp.
This study aimed to determine the frequency and factors related to intestinal parasites infection and to characterize genetically G. duodenalis and Cryptosporidium spp.
circulating in children up to 14 years of age with diarrheal disease in southern, central and northern Mozambique.
For this purpose, 1424 diarrheal stool samples (included in the ViNaDia project, Mozambique) were collected from children up to 14 years old in six public hospitals in the southern, central and northern regions of Mozambique. A single stool sample was collected per child and examined by light microscopy using formalin-ether concentration and modified Ziehl-Neelsen techniques to identify intestinal parasites, namely coccidia and Cryptosporidium. Sociodemographic characteristics were obtained through questionnaires. For molecular characterization positive samples from light microscopy as well as by ELISA (from another ViNaDia sub study) were used. Genetic characterization was performed by nested-PCR targeting β-giardin gene for G. duodenlais and SSUrRNA and gp60 genes for Cryptosporidium spp. Univariate and bivariate analysis and binary logistic regression were performed to describe the population and determine risk factors.
Significance levels of 5% were considered significant.
A single IPI was detected in 19.2% (273/1424) of children. Cryptosporidium spp. was the most common parasite (8.1%; 115/1424). Polyparasitism was observed in 26.0% (71/273) of the children, with Ascaris lumbricoides and Trichuris trichiura (26.8%; 19/71) being the most common co-infection. Age and province were related to IPI (p-value < 0.05).
The highest occurrence of IPI was observed in the wet season (October to March) with 23.1% (191/828) compared to the dry season (April to September) with 13.6% (80/588) (p-value < 0.001). The IbA9G3 subtype of C. hominis was the most dominant in children infected with Cryptosporidium and sub assemblage AII 56.6% (13/23) more frequently observed in children infected with G. duodenalis in the Mozambican pediatric population.
Cryptosporidium spp. and the combination A. lumbricoides/T. trichiura were the main intestinal parasites observed in children hospitalized with diarrhea in Mozambique.
Genotyping data suggest that the main routes of transmission of G. duodenalis and Cryptosporidium in Mozambique are anthroponotic.
vii
viii ÍNDICE GERAL
INTRODUÇÃO ... 1
1. INTRODUÇÃO GERAL ... 2
1.1. GIARDIA DUODENALIS: biologia ... 8
1.1.1. História da descoberta e designação de espécies ... 8
1.1.2. Taxonomia ... 8
1.1.3. Morfologia ... 9
1.1.4. Ciclo de vida ... 12
1.1.5. Giardíase: fisiopatologia e manifestações clínicas ... 13
1.1.6. Epidemiologia e distribuição geográfica da infeção por Giardia ... 15
1.1.7. Fatores e grupos de alto risco ... 16
1.1.8. Sazonalidade ... 17
1.1.9. Caracterização molecular: diversidade genética ... 18
1.1.10. Giardíase como zoonose ... 21
1.1.11. Diagnóstico da giardíase ... 23
1.1.12. Tratamento da giardíase ... 24
1.2. CRYPTOSPORIDIUM SPP.: biologia... 25
1.2.1. História da descoberta e biologia de Cryptosporidium ... 25
1.2.2. Taxonomia ... 25
1.2.3. Morfologia ... 26
1.2.4. Ciclo de vida ... 28
1.2.5. Espécies válidas de Cryptosporidium ... 30
1.2.6. Criptosporidiose: fisiopatologia e apresentação clínica ... 31
1.2.7. Diversidade genética ... 35
1.2.8. Epidemiologia da infeção por Cryptosporidium ... 38
1.2.9. Fatores e grupos de alto risco ... 39
1.2.10. Sazonalidade e distribuição de Cryptosporidium spp. por idade e género ... 40
1.2.11. Surtos transmitidos pela água e por alimentos ... 41
1.2.12. Transmissão zoonótica de Cryptosporidium ... 42
1.2.13. Transmissão antroponótica de Cryptosporidium ... 43
1.2.14. Antigénios de Cryptosporidium ... 44
ix
1.2.15. Diagnóstico ... 45
1.2.1.6. Tratamento ... 48
1.3. RELEVÂNCIA DO ESTUDO ... 50
MATERIAL E MÉTODOS ... 51
2. MATERIAL E MÉTODOS ... 52
2.1. Desenho e caracterização dos locais de estudo ... 52
2.2. População do estudo ... 54
2.3. Recolha de dados clínicos e epidemiológicos ... 54
2.4. Diagnóstico parasitológico ... 55
2.5. Diagnóstico por ensaio imunoenzimático (ELISA) ... 56
2.6. Diagnóstico molecular ... 56
2.6.1. Extração de ADN genómico de oocistos de Cryptosporidium spp. e quistos de Giardia duodenalis ... 57
2.6.2. Deteção e caracterização dos isolados de Giardia duodenalis e Cryptosporidium spp. por métodos moleculares ... 59
2.6.3. Amplificação do gene ssu rRNA por nested-PCR ... 61
2.6.4. Amplificação do gene gp60 por nested-PCR ... 61
2.6.5. Amplificação do locus β-giardina por nested-PCR ... 62
2.6.6. Visualização dos produtos de PCR dos genes ssu rRNA, gp60 e bg ... 64
2.7. Análise filogenética ... 64
2.8. Análise estatística ... 65
2.9. Considerações éticas ... 66
RESULTADOS ... 67
3. RESULTADOS ... 68
3.1. Caracterização sociodemográfica das crianças incluídas na análise ... 68
3.1.1. Fontes de captação da água e tipo de alimento consumido pelas crianças ... 68
3.1.2. Caracterização sociodemográfica dos pais e ou cuidadores das crianças ... 69
3.1.3. Caracterização clínica das crianças: ocorrência de diarreia, vómitos, febre e seropositividade para VIH da criança e da mãe ... 73
3.2. Diagnóstico parasitológico ... 74
3.2.1. Infeções parasitárias intestinais simples observadas ... 74
3.2.2. Poliparasitismo ... 74
3.2.3. Protozarios e helmintas intestinais patogénicos identificados nas crianças recrutadas ... 75
3.2.4. Diversidade parasitária nas crianças recrutadas por províncias ... 76
x
3.2.5. Distribuição das espécies de parasitas intestinais por faixa etária ... 77
3.3. Avaliação da distribuição dos parasitas intestinais nas duas épocas do ano: verão e inverno ... 78
3.4. Fatores associados à infeção parasitária intestinal em crianças ... 79
3.5. Análise de regressão logística ... 86
3.6. Caracterização molecular de Giardia duodenalis ... 90
3.6.1. Identificação dos genótipos por sequenciação ... 90
3.6.2. Alinhamento local por BLAST e identificação de sequências ... 91
3.6.3. Comparação entre as sequências dos isolados do estudo por alinhamento múltiplo 92 3.6.4. Análise filogenética das sequências nucleotídicas do gene β-giardina ... 97
3.6.5. Análise de associação entre os genótipos A e B de Giardia duodenalis com variáveis socioepidemiológicas e clínicas ... 98
3.7. Caracterização molecular de Cryptosporidium spp. ... 101
3.7.1. Alinhamento múltiplo e análise filogenética ... 103
3.7.2. Identificação das famílias dos subtipos por sequenciação... 109
3.7.3. Alinhamento múltiplo e variabilidade intragenotípica ... 109
3.7.4. Análise filogenética das sequências nucleotídicas do gene gp60 ... 114
3.7.5. Análise de associação entre as famílias de subtipos de Cryptosporidium spp. com variáveis sociodemográficas e clínicas ... 114
DISCUSSÃO E CONCLUSÕES... 118
4. DISCUSSÃO E CONCLUSÕES ... 119
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 147
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 148
ANEXOS ... 178
Anexo I: Consentimento informado ... 179
Anexo II: sequências nucleotídicas de G. duodenais e Cryptosporidium spp. ... 183
xi ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1.1.1. Representação morfológica do trofozoíto (A) e do quisto (B) de G.
duodenalis.. ... 10
Figura 1.1.2. Secção transversal de trofozoítos de Giardia.. ... 11
Figura 1.1.3. Ciclo de vida de G. duodenalis. ... 13
Figura 1.2.1 Estrutura do oocisto de Cryptosporidium spp. ... 27
Figura 1.2.2. Estrutura de esporozoíto de um apicomplexa 28
Figura 1.2.3. Ciclo de vida de Cryptosporidium spp. ... 29
Figura 1.2.4. Fatores que conduzem à infeção por Cryptosporidium. ... 40
Figura 2.1. Divisão administrativa e população moçambicana ... 53
Figura 2.2. Fluxograma dos procedimentos executados desde a recolha das amostras fecais à análise das sequências de ADN dos isolados de Cryptosporidium spp. e Giardia duodenalis obtidos neste estudo ... 57
Figura 3.1. Frequência relativa dos parasitas identificados nas amostras fecais das crianças recrutadas ... 74
Figura 3.2. Infeções parasitárias intestinais múltiplas mais comuns identificadas nas crianças recrutadas ... 75
Figura 3.3. Distribuição das espécies de parasitas intestinais nas crianças, por província. Frequências relativas (%) ... 77
Figura 3.4. Distribuição das espécies parasitárias por grupos etários 0-11, 12-23, 24-59 e 60-168 meses ... 78
Figura 3.5. Distribuição das espécies de parasitas mais frequentes observados no verão e inverno, durante o período de estudo ... 79
Figura 3.6. Separação electroforética em gel de agarose 1,5% e coloração com GelRedTM dos produtos da amplificação por nested-PCR do gene da β-giardina. . 90
Figura 3.7 Alinhamento múltiplo das sequências nucleotídicas entre os diferentes isolados identificados em crianças até 14 anos com G. duodenalis recrutadas em Maputo, Sofala, Zambézia e Nampula, durante os anos 2015–2019 ... 97
Figura 3.8. Relações filogenéticas entre os diferentes genótipos identificados em crianças até 14 anos com G. duodenalis recrutadas em Maputo, Sofala, Zambézia e Nampula, durante os anos 2015 – 2019 ... 99
Figura 3.9. Separação electroforética em gel de agarose 1,5% e coloração com GelRedTM dos produtos do nested-PCR do gene ssu rRNA ... 101
Figura 3.10. Separação electroforética em gel de agarose 1,5% e coloração com GelRedTM dos produtos do nested-PCR do gene gp60. ... 102
Figura 3.11 Alinhamento múltiplo das sequências nucleotídicas do gene ssu rRNA entre os diferentes isolados identificados em crianças até 14 anos com Cryptosporidium spp. recrutadas em Maputo, Sofala, Zambézia e Nampula, durante os anos 2015– 2019 ... 107
Figura 3.12. Relações filogenéticas entre as espécies de Cryptopridium spp. identificados em crianças até 14 anos com Cryptosporidium spp. recrutadas em Maputo, Sofala, Zambézia e Nampula, durante os anos 2015 – 2019.. ... 108
xii Figura 3.13. Alinhamento múltiplo das sequências nucleotídicas do gene gp60 entre os
diferentes isolados identificados em crianças até 14 anos com Cryptosporidium spp.
recrutadas em Maputo, Sofala, Zambézia e Nampula, durante os anos 2015 – 2019 ... 114 Figura 3.14. Relações filogenéticas entre os diferentes genótipos identificados em
crianças até 14 anos com Cryptosporidium spp. recrutadas em Maputo, Sofala, Zambézia e Nampula, durante os anos 2015 – 2019. ... 116
xiii ÍNDICE DE QUADROS
Quadro 1.1.1. Espécies de Giardia ... 12
Quadro 1.1.2. Genes utilizados para caracterização molecular de espécies de Giardia ... 21
Quadro 1.2.1. Classificação taxonómica de Cryptosporidium spp. ... 26
Quadro 1.2.2. Espécies de Cryptosporidium patogénicas para os humanos ... 33
Quadro 2.1. Genes e primers utilizados na deteção de Cryptosporidium spp. e Giardia duodenalis ... 63
Quadro 3.1 Características demográficas (género, faixa etária, província e hospital) das crianças recrutadas. Frequências relativas (%) e absolutas (n) ... 70
Quadro 3.2. Fonte e tipo de tratamento da água e alimento consumidos pelas crianças recrutadas. Frequência relativa (%) e absoluta (n) ... 71
Quadro 3.3 Características das casas, nível de escolaridade dos pais, estado marital, cuidador da criança e prática da agricultura. Frequências relativas (%) e absolutas (n) ... 72
Quadro 3.4. Ocorrência de diarreia nos últimos sete dias, febre e vómitos nas crianças e serologia para VIH da criança e da mãe. Frequências relativas (%) e absolutas (n). ... 73
Quadro 3.5. Categorias de infeção observadas e de parasitas intestinais diagnosticados. Frequências relativas (%); frequências absolutas (n) ... 76
Quadro 3.6. Análises de associação entre infeção intestinal simples e múltiplas, em relação às variáveis género, idade e proveniência ... 80
Quadro 3.7 Análises de associação entre infeção por G. duodenalis e Cryptosporidium spp., em relação às variáveis género, idade e proveniência ... 81
Quadro 3.8. Associação entre infeções parasitárias intestinais (IPI) no global e G. duodenalis e Cryptosporidim spp. em relação às variáveis fonte de água, tratamento de água e tipo de alimento 82 Quadro 3.9. Análise de associação entre infeções parasitárias intestinais (IPI) e G. duodenalis e Cryptosporidium spp., em relação ao tipo de habitação, escolaridade dos encarregados, estado marital ... 83
Quadro 3.10. Análise de associação entre infeções parasitárias intestinais (IPI) e G. duodenalis e Cryptosporidium spp., em relação ao cuidador da criança, prática de agricultura e contacto animal 84 Quadro 3.11 Análise de associação entre infeções parasitárias intestinais (IPI) e G. duodenalis e Cryptosporidium spp. em relação à diarreia, vómitos, febre, seropositividade para VIH da criança e da mãe ... 85
Quadro 3.12. variáveis usadas no modelo de regressão logística ... 86
Quadro 3.13. Análise de regressão logística para infeção parasitária intestinal em relação às variáveis independentes género, idade, província e fonte de água ... 88
Quadro 3.14. Análise de regressão logística para a infeção por parasitas intestinais em relação às variáveis independentes tipo de alimento, tipo de casa, escolaridade da mãe, estado marital e cuidador da criança ... 89
Quadro 3.15. Análise de regressão logística para a infeção por Cryptosporidium spp. em relação às variáveis independentes idade, província e escolaridade da mãe ... 89
Quadro 3.16. Número de mostras positivas por M.O e ELISA, incluídas na caraterização molecular de G. duodenalis e Cryptosporidium spp. ... 90
Quadro 3.17. Diversidade genética do gene da β-giardina dos isolados de G. duodenalis identificados no estudo ... 92
Quadro 3.18. Análise de associação entre os genótipos de G. duodenalis identificados e as variáveis género, idade categorizada, província, contacto animal, diarreia nos últimos 7 dias, vómitos, febre e seropositividade para VIH ... 100
Quadro 3.19. Espécies de Cryptosporidium spp. detetadas no estudo ... 103
Quadro 3.20. Variabilidade intragenotípica do locus gp60 dos isolados de Cryptosporidium spp. identificados no estudo ... 110
Quadro 3.21. Análise de associação entre as famílias de Cryptosporidium spp. identificadas e as variáveis género, idade categorizada, província, contacto com animal, diarreia nos últimos 7 dias, vómitos, febre e seropositividade para VIH. Número de positivos na categoria (n) e frequência (%) ... 117
xiv
xv LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E ACRÓNIMOS
A – adenina, G – guanina, C – Citosina, T - timina AcM - anticorpos monoclonais
ADN – ácido deoxiribonucléico AE – tampão de eluição
AL - tampão de lise e desnaturação de macromoléculas ASL – tampão de lise
AW1 e AW2 – tampões de lavagem bg - ß-giardina
C4 CD4+ - sigla anglo-saxónica para cluster of differentiation 4
CDC – abreviatura anglo-saxónica para Centers for Disease Control and Prevention Csl - sigla anglo-saxónica para circumsporozoite-like glycoprotein
CWP1, CWP2 e CWP3 - sigla anglo-saxónica para cyst wall protein 1 Dntp - sigla anglo-saxónica para deoxyribonucleoside triphosphate ef-1α - sigla anglo-saxónica elongation factor 1
EIA - sigla anglo-saxónica para enzime-linked immunosorbent assay ELISA sigla anglo-saxónica para Enzyme-Linked Immunosorbent Assay FDA - sigla anglo-saxónica para Food and Drug Administration
GalNAc - Galactosamina na forma de N acetilgalactosamina Gdh - sigla anglo-saxónica para glutamato desidrogenase
GEMS - sigla anglo-saxónica para Global Enteric Multicenter Study gp60 – glicoproteina 60
HCB – Hospital Central da Beira HCJM – Hospital Geral José Macamo HCM – Hospital Central de Maputo HCN – Hospital Central de Nampula HGM – Hospital Geral de Mavalane HGQ – Hospital Geral de Quelimane
hsp70 - sigla anglo-saxónica para heat shock protein 70-kDa IC - imunocromatográfico
xvi IMC - sigla anglo-saxónica para inner membrane complex
INS - Instituto Nacional de Saúde
INSIDA - inquérito nacional sobre HIV/sida,
LAMP - sigla anglo-saxónica para loop-mediated isothermal amplification M.O. – microscopia otica
MLST- sigla anglo-saxónica para multilocus sequence typing MTOCs - sigla anglo-saxónica para microtubule-organizing center
NADPH - sigla anglo-saxónica reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate NO - óxido nítrico
O.D. - sigla anglo-saxónica para optical density OMS – Organização Mundial de Saúde
orfC4 - sigla anglo-saxónica open reading frame Pb - pares de base
PCR - sigla anglo-saxónica para polymerase chain reaction ph - sigla anglo-saxónica para "potential of hydrogen"
rDNA – sigla anglo-saxónica para ribossomal DNA RE - retículo endoplasmático
RFLP - sigla anglo-saxónica para Restriction fragment length polymorphism SAAP - sigla anglo-saxónica para single amino acid polymorphism
Sida - síndroma de imunodeficiência adquirida
SNP, sigla anglo-saxónica para single nucleotide polymorphism ssu rRNA – do inglês small subunit ribosomal RNA
TARV – terapia antirretroviral
tim ou tpi - sigla anglo-saxónica para triose-phosphate isomerase
Trap C1 - sigla anglo-saxónica para thrombospondin related adhesive protein of Cryptosporidium-1
USD - sigla anglo-saxónica para United States dollar VIH - Vírus da Imunodeficiência Humana
ViNaDia - Vigilância Nacional da Diarreia VSP - proteínas variáveis de superfície ZNM - Ziehl-Neelsen modificada
xvii MgCl2 – cloreto de magnésio
EDTA- sigla anglo-saxónica para Ethylenediaminetetraacetic acid TBE – Tris-borate EDTA-
UV – ultravioleta Kb – quilobase
IPI – infeção parasitária intetinal IC – Intervalo de confiança
OR – sigla anglo-saxónica para Odds Ratio
UNICEF – sigla anglo-saxónica para United Nations Children's Fund WASH - sigla anglo-saxónica para water, sanitation and hygiene
1
INTRODUÇÃO
2 1. INTRODUÇÃO GERAL
Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS), as patologias gastrointestinais ainda constituem a segunda causa de morte, mais comum, entre crianças menores de cinco anos de idade (1). Em 2019, cerca de meio milhão das 5.050.000 mortes infantis foram devidas a doenças diarreicas e 53,0% das mortes ocorrem na África Subsariana com uma contribuição de 7.573 de Moçambique (2).
Esta maior suscetibilidade às doenças intestinais poderá estar associada a poucos recursos financeiros, clima tropical húmido, alta densidade populacional, saneamento deficiente do meio ambiente, presença de vetores ou portadores mecânicos de parasitas, alguns hábitos socioculturais, para além de desnutrição e altas taxas de seropositividade para o vírus da imunodeficiência humana (VIH) nestas regiões (3).
Vários são os agentes etiológicos causadores da patologia gastrointestinal, destacando-se bactérias, vírus, fungos e parasitas. Relativamente aos parasitas intestinais, estes incluem um amplo grupo de organismos, dos quais os protozoários, que são organismos unicelulares (Entamoeba histolytica, Giardia duodenalis, Cryptosporidium spp.), e os helmintas, que são organismos multicelulares (Ascaris lumbricoides, Ancylostoma/Necator spp. e Trichuris trichiura), são dos que mais se destacam (4).
Cryptosporidium spp. e G. duodenalis, mais conhecidos pelo elevado potencial em causar grandes surtos de diarreia, são transmitidos principalmente pela água e alimentos contaminados (5).
Numa perspectiva geral, em Moçambique, a mortalidade em menores de cinco anos é superior a 100 por cada 1.000 nados vivos em seis das províncias do Centro e do Norte (Zambézia, Tete, Cabo Delgado, Manica, Sofala e Niassa), bem como em Gaza, uma província do Sul do país. A província nortenha de Nampula tem uma das taxas mais baixas de mortalidade em menores de cinco anos (6). A diarreia e consequente desidratação constituem ainda uma das principais causas de mortalidade na infância mesmo com as estratégias implementadas desde 1990, incluindo a introdução da vacina do rotavírus, semana nacional da saúde onde as crianças são vacinadas, desparasitadas e suplementadas com vitamina A, melhoria da água, saneamento e higiene (7). Para além disso, episódios repetidos de diarreia são uma das causas subjacentes mais importante da malnutrição calórico-proteica grave (8). Esta, tem um grande peso em crianças com idade
3 entre seis a 23 meses (19,0%) em comparação com crianças com menos de seis meses (5,0%) e crianças com 48 a 59 meses (6,0%) (8).
A prevalência da desnutrição (43,0%) preocupa Moçambique, que detém um dos níveis mais elevados do mundo e o nono em África. A desnutrição crónica, de natureza irreversível, tem impactos negativos tanto no desenvolvimento cognitivo na primeira infância quanto no desenvolvimento em geral e, na pior das hipóteses, pode culminar na mortalidade infantil (6). Nampula, Cabo Delgado e Niassa registam as taxas mais elevadas de desnutrição crónica (47,0% a 55,0%), seguidas pelas províncias do Centro (36,0% a 45,0%) e do Sul (23,0% a 36,0%) do país (8).
Relativamente ao VIH, Moçambique continua a ter uma alta prevalência, com a oitava mais elevada do mundo e há mais de um em cada dez cidadãos infetados (9). Dados do inquérito nacional sobre HIV/Síndroma de Imunodeficiência Adquirida (SIDA), (INSIDA), indicaram que crianças até 11 anos tem 1,4% de taxa de positividade, sendo que no grupo de crianças menores de um ano de idade, cuja infeção se atribui à transmissão vertical (de mãe para filho), a prevalência observada era de 2,3% (9).
O mapeamento de parasitas intestinais, realizado em todo país entre agosto de 2005 e junho de 2007, em alunos do ensino primário, identificou Ascaris lumbricoides (65,8%), Trichuris trichiura (54,0%) e Ancylostoma duodenalis (38,7%) como sendo os parasitas mais comuns (10). Mais recentemente, na Vigilância Nacional da Diarreia (ViNaDia) (11), três principais parasitas: Cryptosporidium spp., G. duodenalis e E. histolytica foram diagnosticados em crianças admitidas com diarreia em hospitais públicos nas três regiões do país, ficando patente a ideia de que houve uma alteração do perfil epidemiológico dos parasitas em crianças moçambicanas.
Relativamente a epidemiologia molecular, a maioria dos estudos em crianças foi realizada na região sul, concretamente no distrito da Manhiça, província de Maputo (12,13) e na cidade de Maputo (14) para caraterização genética de Cryptosporidium e, para G.
duodenalis, foi realizado um estudo também em Manhiça (15). Adicionalmente, em Chókwè, na província de Gaza numa população mista (crianças e adultos), com VIH e tuberculose, foi feita a caraterização molecular dos dois parasitas (16). Na região centro, província de Zambézia, foi realizada a caracterização genética de G. duodenalis e
4 finalmente na zona norte do país, um outro estudo para caracterização molecular de G.
duodenalis, em Nampula (17).
Como é óbvio, estas limitações geográficas assim como o facto destes estudos terem sido restritos a determinadas faixas etárias (menores de cinco anos), limitados à crianças com determinadas comorbidades (HIV, desnutrição e tuberculose) e em alguns casos terem sido realizados em crianças sem sintomas sugestivos, limitam a extrapolação dos resultados para o resto da população pediátrica, na medida em que os agentes etiológicos e a carga de doença podem variar entre as diferentes regiões do país consoante fatores ambientais, culturais e prevalência de VIH. Nesta perspectiva, utilizou-se os dados da Vigilância Nacional de Diarréia (ViNaDia) implantada em 2014 em quatro das onze províncias de Moçambique, representativas da três regiões, com o objetivo de determinar a carga e a etiologia da diarréia em crianças internadas com diarréia, para descrever a epidemiologia actualizada das parasitoses em crianças de até 14 anos de idade recorrendo a um método simples e barato a microscopia óptica. Além disso, nossos dados fornecem informações sobre a variação na distribuição de parasitas intestinais entre 2014 e 2019 e também novos dados sobre dois dos principais protozoários patogénicos causadores de diarreia, Cryptosporidium spp. e Giardia duodenalis, do ponto de vista da epidemiologia e caracterização genética dos isolados circulantes em Moçambique.
5 As infeções parasitárias intestinais ainda representam um dos principais problemas de saúde pública devido à sua elevada prevalência, distribuição global, impacto no estado nutricional e vice-versa e grau de eficiência do sistema imunitário, principalmte nas populações mais desfavorecidas (18).
Apesar do desenvolvimento e disponibilidade de antiparasitários eficazes para o controlo das doenças parasitárias, a sua maior carga continua concentrada nos países em desenvolvimento (África subsaariana seguida pela Ásia, América Latina e Caribe), nos quais a pobreza está enraizada e a água potável, saneamento, assistência à saúde e conscientização sobre a saúde são inadequados. A agricultura de subsistência e pecuária é o estilo de vida das comunidades rurais ligadas a um ambiente contaminado por agentes infeciosos. O baixo nível sócio-económico e o uso indiscriminado de medicamentos caracteriza a vida destas comunidades (19,20).
Parasitas como A. lumbricoides, Necator americanus e Ancylostoma duodenale, T.
trichiura, G. duodenalis, E. histolytica e Cryptosporidium spp. são os parasitas intestinais mais comuns (21), estando na origem de mais de 10,5 milhões de novos casos anualmente.
Os parasitas A. lumbricoides, T. trichuria e ancilostomídeos figuram na lista dos helmintas mais comuns a nível mundial e estão associados a atraso de crescimento e comprometimento do desenvolvimento cognitivo, anemia e deficiência de vitamina A (22).
A alta prevalência insistente destes parasitas deve-se em grande parte à cronicidade das infeções. As características físicas dos helmintas, a sua capacidade geral de induzir uma resposta imunitária reparadora dos tecidos e, em alguns casos, a co-evolução com o hospedeiro durante milénios parecem indicar que os mamíferos desenvolveram mecanismos de tolerância a estes parasitas (23).
Anualmente, milhões de pessoas infetadas com G. duodenalis, Cryptosporidium hominis e Cryptosporidium parvum manifestam diarreia, desnutrição e atraso do desenvolvimento físico ou cognitivo. E. histolytica causa amebíase intestinal e extra-intestinal, resultando em muitas mortes, principalmente de crianças em comparação com os adultos (24).
Em África, mais de 173 milhões de pessoas estão infetadas com A. lumbricoides, 198 milhões estão infectadas com ancilostomídeos e 162 milhões de pessoas estão infectadas
6 por T. trichiura (25). Em Moçambique, Cryptosporidium spp. é o protozoário mais comum com 12,0% de frequência, seguido por G.duodenalis 9,7% e E. histolytica 2,0%
(11).
As infeções parasitárias intestinais são transmitidas pela via fecal-oral. Os parasitas intestinais depois de uma fase de desenvolvimento no intestino humano eliminam ovos, quistos ou oocistos ou parasitas junto com as fezes para o ambiente (22). Uma vez no exterior, qualquer destas formas de desenvolvimento podem contaminar alimentos ou água de consumo e ao serem ingeridas reiniciam o seu ciclo de vida.
Relativamente aos fatores sócio-económicos, o papel de alguns determinantes sociais como género, idade, pobreza e riqueza, contexto urbano ou rural e ocupação, na frequência das infeções parasitárias, já foram abundantemente explorados. As crianças são o grupo populacional mais exposto às infeções devido aos seus padrões comportamentais e à sua maior suscetibilidade imunológica. As doenças transmitidas por parasitas do solo são mais comuns em meio rural, devido às práticas agrícolas e pecuárias, em comparação com o contexto urbano (20).
Por sua vez, a água, embora indispensável à vida, constitui uma das principais formas de veiculação das formas infetantes dos parasitas principalmente em regiões desfavorecidas onde o risco de ocorrência de surtos é elevado devido a falta de fontes hídricas seguras (5). Nestas regiões a água chega a ser captada em poços abertos, em rios partilhados com os animais e onde é feita a higienização das pessoas, vulnerabilizando as populações a várias doenças incluindo as diarreicas. Também, o desordenamento urbano fortemente influenciado pelo êxodo rural, impulsiona grandes aglomerados e consequente degradação ambiental e alta prevalência de parasitas intestinais.
O poliparasitismo é um problema comum em países africanos, e pode ser usado como indicador de contaminação ambiental assim como dos hábitos de higiene praticados numa determinada região. Vários estudos epidemiológicos apontam que indivíduos poliparasitados geralmente abrigam infeções mais intensas do que indivíduos monoparasitados e uma consequência é a anemia grave e a incapacidade de resposta do sistema imunitário do indivíduo (26). Em Moçambique 2,1% das crianças apresentaram coinfeção por vários parasitas, sendo as mais comuns G. duodenalis e Cryptosporidium
7 spp. 1,1% (11/985), Cryptosporidium spp. e E. histolytica 0,9% (9/981) e G. duodenalis e E. histolytica 0,1% (1/1002) (11).
Por sua vez, a coinfeção VIH/parasitas alterou significativamente o perfil epidemiológico das doenças causadas por parasitas oportunistas. Embora o efeito de VIH em indivíduos com infeções parasitárias não seja esclarecedor, de uma forma geral, estas continuam sendo a principal causa de morbimortalidade, fundamentalmente para os indivíduos sem a terapia antirretroviral (27).
8
1.1. GIARDIA DUODENALIS: biologia
1.1.1. História da descoberta e designação de espécies
O organismo Giardia foi descrito pela primeira vez em 1681 por van Leeuwenhoek ao observar as suas fezes diarreicas ao microscópio (28). Em 1859, foram descritos mais detalhes acerca deste organismo por Lambl, que chegou a classificar Giardia como pertencente ao género Cercomonas e deu-lhe a designação Cercomonas intestinalis (29).
Em 1882 e 1883, pela primeira vez Kunstler descreveu Giardia como um género, em girinos (Giardia agilis) e em 1888, Blanchard propôs o nome Lamblia intestinalis (30) e Stiles mudou para Giardia duodenalis em 1902. Posteriormente, Kofoid, em 1915, propôs o nome Giardia lamblia (31).
Filice em 1952, propôs uma nova avaliação taxonômica do género Giardia, baseada nas características morfológicas para validar as espécies tendo descrito três espécies: G.
duodenalis, G. muris e G. agilis (32).
O consenso de espécie foi polémico, durante vários anos, chegando a mais de 40 nomes propostos com base no hospedeiro por alguns e com base na morfologia por outros pesquisadores. Apesar dos diversos indícios, apenas no final da década de 1970 Giardia foi reconhecido como organismo patogénico importante para o ser humano e mais tarde, o surgimento da sua forma grave em pacientes com deficiências de globulinas e a ocorrência de surtos de diarreia de veiculação hídrica confirmaram-no definitivamente como patogénico humano (33).
1.1.2. Taxonomia
A mais recente classificação sistemática, baseada em dados genéticos, estruturais e bioquímicos, agrupa o género Giardia no filo Metamoda, sub-filo Trichozoa, super classe Eopharyngia, classe Trepomonadea, sub-classe Diplozoa, Ordem Giardiida e família Giardiidae (34).
As relações filogenéticas de Giardia são discutidas há anos. Giardia tem uma organização intracelular simples, tendo sido descrito como um fóssil biológico, pelo facto de ser um verdadeiro eucariota que no entanto reteve peculiaridades dos ancestrais
9 procariotas. Como tal, foi proposto representar uma linhagem eucariótica ramificada precoce, que divergiu antes da aquisição de mitocôndrias (34).
1.1.3. Morfologia
O ciclo de vida de Giardia é caracterizado por dois estádios morfologicamente distintos:
o quisto (forma infetante, encontrada no ambiente e responsáveis pela propagação da infeção) e o trofozoíto (forma vegetativa, encontrada no intestino do hospedeiro e responsáveis pelas manifestações clínicas) (35).
O quisto tem a forma elíptica ou oval (figura 1.1.1B), com aproximadamente 8–12 µm de comprimento por 7–10 µm de largura e é coberto por uma parede (com 0,3 a 0,5 mm de espessura) composta por uma camada filamentosa externa e uma camada membranosa interna com duas membranas. A parede externa do quisto é composta por quatro proteínas principais. Galactosamina na forma de N acetilgalactosamina (GalNAc) que é o açúcar predominante da porção externa do quisto e três proteínas da parede do quisto diferentes (CWP1, sigla anglo-saxónica para cyst wall protein 1, CWP2 e CWP3). Como forma ambientalmente estável do ciclo de vida, os quistos têm uma taxa metabólica inferior comparada aos trofozoítos (35).
10 Figura 1.1.1.Representação morfológica do trofozoíto (A) e do quisto (B) de G. duodenalis. FA: flagelo anterior, VF: flagelo ventral, FLP: flagelo lateral ou posterior e CF: flagelo caudal. Adaptado de Ankarklev et al., 2010 (35).
O trofozoíto (figura 1.1.1 A), mede 12-15µm por 5-9µm (consoante a espécie), tem formato de pêra, com simetria bilateral. A sua face dorsal é convexa e a face ventral é côncava. Estruturas celulares como mitocôndria, peroxissomos e complexo de Golgi, comuns em outros eucariotos, não são encontrados nos trofozoítos de Giardia spp.
Apresenta um citoesqueleto complexo que lhe confere o formato característico e que sustenta os quatro pares de flagelos (anterior, posterior, caudal e ventral), o corpo mediano e o disco ventral. O trofozoíto apresenta dois núcleos que estão localizados anteriormente e são simétricos em relação ao eixo longo (figura 1.1.2). Vacúolos lisossómicos, bem como grânulos ribossómicos e de glicogénio, são encontrados no citoplasma. Os complexos de Golgi tornam-se visíveis nos quistos (35).
11 Figura 1.1.2. Secção transversal de trofozoítos de Giardia. Uma vista em corte transversal de um trofozoíto demonstra os núcleos (N), flagelos (F), vacúolos (V) e (RE) retículo endoplasmático. Adaptado de Adam, 2001 (36).
O corpo mediano, em número de dois, consiste em um grupo de microtúbulos dispostos em feixe apertado, exclusivo de Giardia spp. (36). A sua morfologia ajuda a definir as características morfológicas das diferentes espécies de Giardia, quadro 1.1.1.
Para a mobilidade, o trofozoito possui quatro pares de flagelos, os quais começam em dois conjuntos de corpos basais que estão próximos do núcleo, emergindo das regiões anterior, posterior, caudal e ventral do trofozoíto (36).
Os trofozoítos de G. duodenalis têm dois núcleos com aparência quase idêntica, número aproximadamente igual de genes de rDNA (sigla anglo-saxónica ribossomal DNA) e são transcripcionalmente ativos (37).
Para fixarem-se ao intestino delgado do hospedeiro e obterem nutrientes, os trofozoítos usam as suas superfícies ventrais côncavas (disco adesivo ventral). O disco ventral contém proteínas contráteis (actinina, a-actinina, miosina e tropomiosina) como base bioquímica para a sua contração e as giardinas, que possibilitam a adesão do parasita à mucosa intestinal (36).
12 Quadro 1.1.1. Espécies de Giardia
Espécies Hospedeiros Características Morfológicas
Dimensões do trofozoíto Comprimento/ largura G. agilis Anfíbios Trofozoíto alongado e estreito,
com corpos medianos em forma de lágrima
20 - 30 µm 4 - 5 µm
G. muris Roedores Trofozoíto arredondado, com pequenos corpos medianos redondo
9 - 12 µm 5 - 7 µm
G.
duodenalis
Mamíferos domésticos, silváticos, incluindo o Homem
Trofozoíto piriforme, com corpos medianos em forma de garra
12 - 15µm 6 - 8 µm
G. ardae Aves Trofozoíto semelhante ao de G. duodenalis
~10 µm ~6,5 µm
G. psittaci Aves Trofozoíto semelhante ao de G. duodenalis
~14 µm ~6 µm
G. microti Roedores Trofozoíto semelhante ao de G. duodenalis
12- 15 µm 6 - 8 µm
Adaptado de Thompson et al., 2002 (38).
1.1.4. Ciclo de vida
G. duodenalis possui um ciclo de vida simples, com dois estádios principais, o trofozoíto que é a forma vegetativa, e o quisto que é a forma infetante (figura 1.1.3). A infeção inicia-se quando o hospedeiro ingere quistos infeciosos através de água ou alimentos contaminados ou diretamente pela via fecal-oral. Quando estes quistos são expostos aos ácidos do estômago e à tripsina no duodeno desencadeia-se o desenquistamento. Esta etapa é caracterizada por uma sequência complexa e coordenada de eventos que dão origem a dois trofozoítos. A transformação de trofozoítos em quistos ocorre no trato intestinal do hospedeiro, à medida que os trofozoítos, juntamente com a massa fecal, se movem em direção ao cólon (39).
13 Figura 1.1.3. Ciclo de vida de G. duodenalis. Adaptado de Yukiko Miyamoto e Lars Eckmann, 2015 (39).
1.1.5. Giardíase: fisiopatologia e manifestações clínicas
A patogénese da infeção por Giardia não é totalmente conhecida. Sabe-se que o parasita não é invasivo, vive e reproduz-se por multiplicação assexuada na superfície luminal do intestino delgado do seu hospedeiro vertebrado. A patogénese é resultante da interação entre produtos parasitários, proteínas que quebram a barreira epitelial e as respostas inflamatória e imunológica do hospedeiro (40).
Os trofozoítos competem por nutrientes com o microbioma comensal e nichos ecológicos no microambiente duodenal. De seguida aqueles atravessam a camada de muco e atingem a superfície epitelial onde devem se proteger das proteases e metabolitos. Por fim, aderem às microvilosidades epiteliais, usando o disco adesivo ventral, por sucção, movimentos flagelares e uma variedade de ligações químicas envolvendo proteínas, como giardinas, lectinas e proteínas variáveis de superfície (VSP), de forma a resistir ao fluxo luminal enquanto acedem a nutrientes no lúmen (35).
Em consequência da adesão, ocorre elevada morte programada de enterócitos (apoptose), disfunção da barreira intestinal, encurtamento da borda em escova das microvilosidades, acompanhados ou não de atrofia das vilosidades, deficiências de dissacaridases, ativação
Eliminação de quistos nas fezes
14 de linfócitos do hospedeiro, hipersecreção de água e electrólitos que culmina no aumento do trânsito intestinal (40).
A l-arginina é um precursor do óxido nítrico (NO), que atua como um composto antimicrobiano e um neurotransmissor e mediador dos movimentos peristáltico e esfincteriano no intestino de mamíferos. Este aminoácido é produzido nos enterócitos e libertado no ambiente luminal, tendo um efeito anti-giardia (impede a formação de quistos) (41). Durante as infeções, Giardia consome arginina do hospedeiro, esgotando- o dos enterócitos e promovendo a morte celular programada. A arginina é uma das principais fontes de energia dos trofozoítos de Giardia, para os quais é auxotrófica, provavelmente porque esse aminoácido requer energia para a sua síntese (42).
Por outro lado, enzimas intra e extracelulares são sintetizadas por Giardia após o contacto com as células intestinais do hospedeiro. As proteases do tipo catepsina B de Giardia são reguladas positivamente durante a interação com as células epiteliais intestinais e estão implicadas na excistação e parecem também regular a virulência do parasita (43). Estas proteases também induzem a redução das vilosidades e contribuem para a toxicidade da microbiota induzida por Giardia (44).
Não são claras as circusntâncias em que Giardia se torna ou não patogénica. Alguns estudos relatam que em infeções por vírus ou bactérias causadoras de diarreia, Giardia pode atenuar a gravidade da doença diarreica (45). Outros mostram que as crianças infetadas por G. duodenalis têm probabilidade reduzida de desenvolver doença diarreica e febre em comparação com crianças negativas para Giardia (46). Uma possível explicação é que Giardia spp. inibe diretamente o crescimento de bactérias patogénicas através das suas proteases de cisteína.
Uma das anomalias significativas observadas na giardíase é o encurtamento difuso das microvilosidades na borda da escova, o que reduz a área disponível para absorção de água, nutrientes, minerais (ferro e zinco) e vitaminas (ex. A e B12), transporte de eletrólitos e digestão (47). A atrofia das vilosidades e hiperplasia da cripta também foram relatadas, embora não pareçam estar associadas com a má absorção induzida por Giardia (48).
15 A hipersecreção de cloreto também pode contribuir para a diarreia na giardíase (49). Em alguns casos, a infeção por Giardia pode induzir a hipersecreção biliar, que, quando associada à má absorção lipídica, pode levar à esteatorreia (50).
As manifestações clínicas variam entre infeções assintomáticas e diarreia aguda ou crónica. A maioria dos casos de infeção por Giardia não apresentam sintomas, dificultando a erradicação e o controlo deste parasita. A infeção sintomática (giardíase) tende a ser uma doença autolimitada em indivíduos imunocompetentes. Entretanto, em crianças, a infeção aguda pode ocasionar anorexia, deficiente crescimento físico e cognitivo e deficiente estado nutricional. Em caso de reinfeção, os sintomas tendem a ser mais brandos, partindo-se do pressuposto que uma exposição prévia, apesar de não proteger de futuras infeções, reduzirá a severidade da doença (47,51). Sequelas crónicas, incluindo síndrome do intestino irritável pós-infecioso, fadiga crónica, desnutrição, comprometimento cognitivo e manifestações extraintestinais, como alergia alimentar, urticária, artrite reativa e manifestações oculares inflamatórias, podem desenvolver-se (51).
Em humanos, a infeção sintomática pode não ser clarividente em 20,0 a 80,0% dos indivíduos (52). Os sintomas são altamente variáveis, incluindo manifestações contínuas, geralmente de curto prazo, de diarreia, dor epigástrica, náusea, vómito, mal-estar e perda de peso (47,49,53). A febre está ocasionalmente presente, especialmente no início da infeção. Os sintomas normalmente manifestam-se seis a quinze dias após a infeção e duram dois a sete dias. Assim sendo, presume-se que a infeção se resolva espontaneamente em mais de 85,0% dos casos, indicando a presença de defesas eficazes no hospedeiro, embora casos crónicos ocasionalmente apareçam na ausência de imunodeficiências evidentes (52).
1.1.6. Epidemiologia e distribuição geográfica da infeção por Giardia
Uma das dificuldades enfrentadas ao descrever a epidemiologia da giardíase tem a ver com a proveniência da informação, dado que são reportados casos sintomáticos, ocultando muitos casos assintomáticos que funcionam como reservatórios e fontes de propagação das formas infetantes (54).
16 Dados de vigilância epidemiológica mostraram que a giardíase infeta populações de todas as idades, atingindo o pico entre até nove anos e entre os 45 e os 49 anos, sem preferências de género mas relacionadas com as atividades e ocupações destes indivíduos (55).
G. duodenalis tem distribuição global. Anualmente, são estimadas cerca de 280 milhões de infeções, sendo as regiões com baixos recursos higiossanitários as que apresentam índices mais elevados (38). As taxas de prevalência de infeção variam entre <1,0% e 50,0%, dependendo da população amostrada. Vários estudos, no mundo e em África em particular, têm sido desenvolvidos principalmente em crianças, nas escolas primárias, com ou sem sintomas gastrointestinais e em estudos de base comunitária. Outros têm envolvido grupos como indivíduos VIH-positivos e -negativos, indivíduos em contacto permanente com animais e ainda estudos sobre manipuladores de alimentos (56).
Os resultados destes estudos tendem, quase sempre, a apresentar taxas de infeção por Giardia mais baixas nos países industrializados e mais altas nos países em desenvolvimento, contudo mesmo dentro dos países, as taxas de incidência e prevalência variam amplamente de região para região. Taxas entre 8,0 e 40,0% ou mais são relatadas na América do Sul, no Caribe, no Médio Oriente, no Sudeste Asiático e África subsaariana. Por outro lado, na maioria dos países da Europa Ocidental, Austrália, Nova Zelândia e América do Norte, taxas entre 2,0 e 7,0% são mais comuns tal como comprovam os estudos a seguir mencionados: Alemanha 1,5%, 0,4% a 6,2% em Itália, 3,7% em Portugal, 5,4% em Espanha, 1,3% no Reino Unido, 1,4% nos Estados Unidos da América, 2,5% na Coreia do Sul e 1,6% a 7,6% na Austrália (57). Em alguns países africanos têm sido reportadas taxas variadas de infeção: Angola com 0.1 a 21,6%, Etiópia 4.6 a 55,0%, Guiné Bissau 33,9%, Madagáscar 11,7%, África do Sul 9,9%, Tanzânia 19 a 62,2%, Zâmbia 29,0% e Moçambique 23,9% (58,59).
1.1.7. Fatores e grupos de alto risco
Os fatores de risco para a giardíase envolvem claramente os fatores ambientais e do hospedeiro, bem como a estirpe, genótipo e inóculo parasitário (60). Existe um entendimento comum sobre as populações com alto risco de giardíase, que incluem crianças, adultos cuidadores de crianças em creches, malnutrição, homossexuais masculinos, indivíduos imunocomprometidos (hipogamaglobulinemia, VIH, indivíduos
17 VIH-negativos com outras imunodeficiências), refugiados e viajantes internacionais (caminhantes, campistas) que bebem água não tratada de lagos, córregos e piscinas (61).
Uma explicação possível pode estar relacionada com a idade da exposição inicial e com a frequência da re-exposição subsequente. Nas populações de países em desenvolvimento, G. duodenalis é um protozoário ubíquo, a infeção inicial é adquirida na primeira infância e a imunidade é rapidamente adquirida, conferindo proteção contra infeções sintomáticas quando expostas posteriormente (62). Nestes países, a prevalência atinge mais de 60% em crianças do ensino primário (58).
Na giardíase crónica, vários fatores levam a acreditar que se trata de um sistema cíclico.
A desnutrição e as infeções por Giardia em humanos contribuem provavelmente para o enfraquecimento da imunidade e má absorção de nutrientes devido a lesão do epitélio intestinal (48). No modelo de desnutrição murina, foi demonstrado que as citoquinas protetoras de Giardia e o recrutamento de eosinófilos foram reduzidos quando foi administrada uma dieta pobre em proteínas antes da infeção (63). Micronutrientes como vitamina A e zinco parecem ser importantes na proteção de crianças contra Giardia (64).
Embora a giardíase não seja uma das principais causas de diarreia associada à sida, pacientes imunocomprometidos são um dos grupos de alto risco para infeção. Vários estudos relataram que indivíduos com deficiências imunológicas, como VIH/sida, eram mais propensos a ter infeção por Giardia principalmente nos países em desenvolvimento.
No entanto, indivíduos imunocomprometidos podem não sofrer infeções prolongadas por G. duodenalis, uma vez que a terapia disponível é eficaz contra o parasita, independentemente do grau de imunidade do hospedeiro (58).
1.1.8. Sazonalidade
Em áreas endémicas, a giardíase geralmente mostra um padrão sazonal, com a maioria dos casos a ocorrer nos meses de verão devido ao consumo de água superficial não tratada e diversão em águas recreacionais (65).
Este parasita é transmitido, com mais frequência, por via hídrica. Os quistos são relativamente tolerantes às condições adversas do exterior podendo sobreviver por períodos prolongados no ambiente e Giardia tem uma dose infeciosa baixa. Uma pessoa infetada pode excretar cerca de 1 a 10 milhões de quistos diariamente pelas fezes e durante
18 alguns meses, entretanto para ficar infetada basta ingerir entre 25 e 100 quistos, embora apenas 10 quistos tenham iniciado a infeção em dois de dois voluntários (66).
A transmissão de G. duodenalis por alimentos é muito menos comum que a transmissão pela água, contudo existem muitas maneiras pelas quais os alimentos podem ser contaminados pelas fezes. As más práticas de higiene por parte dos manipuladores de alimentos. Existem diversos pontos críticos na cadeia de produção relacionados a qualidade da água, saneamento ou higiene que incluem a contaminação da água de irrigação, a água usada no processamento de alimentos ou até as mãos não lavadas durante as colheitas (67,68).
1.1.9. Caracterização molecular: diversidade genética
Morfologicamente, os genótipos da espécie G. duodenalis têm sido considerados indistinguíveis, no entanto olhando para as suas características genéticas, pode ser considerada um complexo de espécies (57).
Os primeiros trabalhos de caraterização genética envolveram a técnica de mobilidade eletroforética das enzimas que delinearam duas subpopulações distintas de G. duodenalis, designadas genótipo A e B (69). A análise de ADN de G. duodenalis por reação em cadeia da polimerase (PCR), o polimorfismo do comprimento de fragmentos de restrição (RFLP) e sequenciação dos seus produtos, agregaram mais informações sobre a heterogeneidade do organismo e confirmaram a existência dos genótipos A e B, mais seis genótipos (C- H) (57,70).
As ferramentas moleculares têm sido amplamente utilizadas para avaliar a variabilidade genética de G. duodenalis. Estas ferramentas podem ser aplicadas para o rastreio das fontes de infeção em isolados de humanos, de animais e do ambiente e, ainda, para a ligação entre casos e a identificação de subtipos virulentos. Estes estudos podem ser alcançados através da subgenotipagem convencional, que se baseia na análise da sequência de genes polimórficos individualmente, tipagem multilocus (é uma técnica em biologia molecular, que como o nome indica, se baseia na tipagem de múltiplos genes) e análise genómica comparativa, a qual consiste na comparação entre si do genoma de espécies/genótipos diferentes, usando uma variedade de ferramentas, entre elas, a análise
19 computacional, para compreender as diferenças e semelhanças evolutivas e moleculares entre as estruturas em análise (71). Para estas análises têm sido utilizados loci de genes conservados, como a subunidade pequena do ARN ribossómico (ssu rRNA) e uma variedade de genes de referência: β-giardina (bg), fator de alongamento 1 alfa (ef-1α), quadro de leitura aberto C4 (orfC4), glutamato desidrogenase dependente de NADPH (gdh) e fosfato triose isomerase (tim ou tpi) (72). A utilização destes genes varia de acordo com o objetivo de cada estudo, uma vez que diferem amplamente em termos de variabilidade genética e sensibilidade (quadro 1.1.2). Os genes ssu rRNA e ef-1α são conservados e geralmente usados para distinguir espécies e genótipos de Giardia, contudo são pouco aplicáveis para estudos de variação intra-genotípica. O ssu rRNA é um gene multicópia, e portanto apresenta alta sensibilidade (71,73).
Os genes tpi e gdh são os mais variáveis, seguidos pelos genes bg e orfC4, portanto, com melhor poder discriminativo. São usados para distinguir genótipos e subgenótipos de G.
duodenalis e inferir a sua relação filogenética (71,73).
Giardinas constituem uma família de proteínas estruturais com aproximadamente 29-38 kDa de tamanho e uma estrutura em hélice alfa-espiralada, que são parte integrante do disco ventral do trofozoíto. A grande vantagem em usar genes giardina é que eles são considerados únicos para Giardia (74).
As proteínas Tpi e Gdh são enzimas metabolicamente importantes de G. duodenalis. A Tpi tem um papel catalisador eficiente que é absolutamente essencial para a produção de energia por meio da glicólise, catalisando uma conversão reversível entre o fosfato de di- hidroxiacetona e o gliceraldeído-3-fosfato (75), enquanto a Gdh desempenha um papel importante no metabolismo de hidratos de carbono e assimilação de amónia, síntese de aminoácidos e ou catabolismo (76).
Os fatores de alongamento da tradução estão entre as proteínas mais abundantes na célula e desempenham um papel essencial para garantir a descodificação adequada do mRNA para produzir proteínas celulares (77).
A proteína OrfC4 (“open reading frame C4”) é um gene específico de G. duodenalis que codifica uma proteína citoplasmática de 22 kDa associada à diferenciação de trofozoítos
20 e quistos. A ampla expressão de Orf-C4 em G. duodenalis e a presença de cópia única no genoma sugere um papel ativo (78).
Pesquisas usando quatro marcadores moleculares mais amplamente utilizados na genotipagem de isolados de G. duodenalis (ssur RNA, bg, gdh e tpi), levou à identificação de variações genéticas intra-específicas e foi proposto um sistema de nomenclatura de sub-genótipos, particularmente dentro de G. duodenalis (genótipo A) e Giardia enterica (genótipo B) (79). Assim sendo, utilizando os marcadores bg, tpi e gdh (o locus ssu rRNA não foi usado por demonstrar baixa intra-variabilidade dos genótipos A e B), 10 genótipos multilocus (MLG) diferentes podem ser identificados (AI-1 e 2, AII-1 a 7 e AIII-1) (79).
Para isolados do genótipo B, modelos heterogéneos foram frequentes nos genes bg, gdh e tpi o que tornou impossível propor uma nomenclatura precisa para os MLG dos isolados deste genótipo, com exceção para BIII-1 e BIV-1 (79).
Os determinantes patogénicos de G. duodenalis são pouco compreendidos, contudo envolvem fatores do hospedeiro e do parasita (40). Relativamente ao parasita, oito genótipos foram identificados A-H e os genótipos A e B são considerados patogénicos em seres humanos (80). Estes diferem especialmente nos repertórios de proteínas de superfície variáveis (VSP) (36). A associação destes genótipos aos sintomas tem sido controversa.
Consta que o genótipo B é mais prevalente nos países em desenvolvimento e o A nos países industrializados. As razões por trás das variações geográficas na distribuição das genótipos de G. duodenalis ainda não são claras, entretanto podem ser explicadas pela diferença de rotas de transmissão e fontes de infeção. É possível que o genótipo A, com uma grande variedade de animais como hospedeiros, seja responsável pela transmissão zoonótica (81).
