Diagnóstico sorológico

Todas as amostras de soro foram submetidas à técnica de soroneutralização (SN) para a pesquisa de anticorpos específicos. Brevemente, diferentes diluições na base dois das amostras de soro (1:2 – 1: 256) foram testadas em microplacas de

poliestireno de 96 cavidades frente a uma dose constante (100-200 DICC50) de uma

cepa viral padrão previamente conhecida. Após um período de incubação de 1h em estufa de CO2 a 37 °C, foi adicionada uma suspensão de células da linhagem RK13.

As placas, contendo a mistura soro-vírus-células, foram então incubadas a 37ºC em atmosfera com 5% de CO2 por 48 a 96 h. Soros de coelhos experimentalmente

infectados com o EHV ou EAV foram gentilmente cedidos pelo professor Luiz Carlos Kreutz, UPF-RS e usados como controles positivos. O monitoramento foi realizado diariamente em um microscópio ótico invertido. O título de anticorpos presente na amostra é dado pela recíproca da diluição do soro capaz de prevenir a produção do efeito citopático (ECP) característico de cada um dos vírus na monocamada de células.

6. RESULTADOS

Os resultados dos testes de soroneutralização demonstraram que 29,6% (172/581) das amostras analisadas apresentaram resultado positivo para a presença de anticorpos específicos contra o herpesvírus equino e 0,79% (05/630) de animais soro-reagentes frente ao vírus da arterite equina (EAV) (Tabela 02).

Tabela 02. Total de animais não vacinados e reagentes no teste de soroneutralização frente ao herpesvírus equino (EHV) e vírus da arterite equina (EAV)

EHV-1 (%) EAV (%)

NEGATIVO 1 401 (69,01) 615 (97,63)

POSITIVO 2 172 (29,60) 5 (0,79)

TÓXICO 3 8 (1,39) 10 (1,58)

TOTAL 581 * 630

* Animais imunizados contra o EHV foram desconsiderados

1

título < 2

2

presença de anticorpos neutralizantes

3

efeito tóxico do soro impediu a interpretação do resultado final do teste

Animais reagentes ao EHV foram detectados em praticamente todas as propriedades analisadas, porém os maiores percentuais foram observados em rebanhos localizados nos municípios de São Sebastião do Alto (53%) e Seropédica (32%) (Tabela 03).

Tabela 03. Resultados dos testes de soroneutralização para o herpesvírus equino tipo-1 em amostras provenientes de animais não vacinados contra a rinopneumonite equina oriundos de diferentes municípios do estado do Rio de Janeiro

MUNICÍPIO REAGENTES NÃO REAGENTES TOTAL

Cachoeiras de Macacu 26 67 93 Nova Friburgo 0 02 02 Itaboraí 22 33 55 Japeri 05 02 07 Paracambi 07 39 46 Queimados 08 19 27

São Sebastião do Alto 53 66 119

Seropédica 32 83 115

Três Rios 19 90 109

TOTAL (%) 172 (30,02%) 401 (69,98%) 573*

*Soros tóxicos (n = 8) não foram considerados

Os títulos de anticorpos contra o EHV nos animais não vacinados variaram entre 2 e ≥ 256, como demonstrado na Figura 04.

Figura 04:Variação nos títulos de anticorpos neutralizantes contra o EHV-1 em animais não- vacinados contra a rinopneumonite equina e oriundos de diferentes municípios do Estado do Rio de Janeiro. O título de anticorpos (eixo Y) é dado pela recíproca da diluição (base 2) do soro capaz de prevenir a produção de ECP na monocamada de células.

46 ₄₆ 38 6 10 9 8 9 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 2 4 8 16 32 64 128 >256 N ú mer o d e an imais

Das 172 amostras reagentes ao EHV, foi observada uma predominância de títulos mais baixos correspondendo a 79,07% do total das amostras analisadas. Outros 15,70 % foram pertencentes a títulos medianos e 5,23 % foram classificados como títulos superiores ou iguais a 256 (recíproca da maior diluição do soro utilizada no presente estudo).

Na avaliação da resposta vacinal dos 44 animais analisados no presente estudo, foi observado que os títulos de anticorpos neutralizantes específicos contra o EHV variaram de 4 até ≥ 256 (Figura 05).

Figura 05: Número de animais soropositivos com o respectivo título de anticorpos neutralizantes específicos contra o EHV-1 provenientes de um grupo de 44 éguas vacinadas contra a rinopneumonite equina. Foram considerados soronegativos todos as amostras com títulos de anticorpos inferiores a 2.* Soros tóxicos (n=3) foram desconsiderados

Os resultados desta avaliação demonstraram ainda que 53,65% das amostras (22/41) foram consideradas negativas no teste de SN, ou seja, os títulos de anticorpos foram inferiores a 2 (limite de detecção da prova sorológica).

Os animais soro-reagentes ao EAV foram pertencentes ao município de Teresópolis (duas amostras do plantel de éguas vacinadas para o EHV-1), Três Rios, Japeri e Cachoeiras de Macacu (Tabela 04).

22 0 2 3 8 2 1 2 1 0 5 10 15 20 25 < 2 2 4 8 16 32 64 128 >256 N ú m ero d e an im ais

Tabela 04: Resultados dos testes de soroneutralização para o vírus da arterite equina (EAV) em amostras provenientes de animais não vacinados oriundos de diferentes municípios do estado do Rio de Janeiro.

Município Reagentes Não reagentes Total

Cachoeiras de Macacu 1 91 92 Nova Friburgo 0 02 02 Itaboraí 0 55 55 Japeri 1 06 07 Paracambi 0 46 46 Queimados 0 27 27

São Sebastião do Alto 0 121 121

Seropédica 0 115 115

Teresópolis 2 44 46

Três Rios 1 108 109

TOTAL (%) 05 (0,79) 617 (98) 620

*Soros tóxicos (n = 10) não foram considerados.

Títulos altos de anticorpos neutralizantes (1.024 e 4.096) específicos contra o EAV foram detectados em dois animais provenientes de um rebanho equino do município de Teresópolis (Tabela 05).

TABELA 05: Procedência das amostras de soro equino consideradas positivas no teste de soroneutralização com os respectivos títulos de anticorpos contra o EAV.

Identificação Título neutralizante Município - RJ

Animal n°1 2 Cachoeiras de Macacu

Animal n°2 4 Três Rios

Animaln°3 4 Japeri

Animaln°4 1024 Teresópolis

7. DISCUSSÃO

Os testes de soroneutralização demonstraram que 29,6% (172/581) das amostras analisadas apresentaram resultado positivo para a presença de anticorpos específicos contra o herpesvírus equino (EHV). Por outro lado, apenas 0,79% (5/630) apresentaram resultado positivo no teste de SN frente ao vírus da arterite equina (EAV). Neste caso, é importante ressaltar que os resultados positivos observados indicam uma exposição prévia destes animais aos vírus em questão, tendo em vista que todas as amostras foram provenientes de animais sem histórico de vacinação contra estes agentes. Entretanto, a simples presença de anticorpos neutralizantes específicos em uma amostra clínica não pode ser relacionada com infecção recente ou sinais clínicos compatíveis com a infecção (FLORES, 2012). O diagnóstico confirmatório poderia, eventualmente, ser realizado por sorologia pareada seguida da observação de um aumento de pelo menos quatro vezes nos títulos de anticorpos neutralizantes.

Estudos sorológicos prévios já demonstraram a ampla distribuição do herpesvírus equino no Brasil, com percentuais de soropositividade variando desde 4,5% (67/1.506) no Rio Grande do Sul (DIEL et al, 2006) até 45,45% (230/506) no Pará (PENA et al, 2006). O percentual de animais soropositivos para o EHV neste estudo (29,6%) foi semelhante aos resultados observados em São Paulo de 26 e 27,2% (CUNHA et al, 2009; 2002) e 33,4% (LARA et al, 2003).

A presença de anticorpos específicos contra o herpesvírus equino em animais vacinados tem importância epidemiológica tendo em vista o estabelecimento de infecções latentes após infecção primária. Apesar de a doença aguda se resolver em poucas semanas após a infecção primária, é comum haver uma infecção persistente caracterizada pela latência seguida de episódios de reativações com recrudescência clínica e excreção viral. Animais latentemente infectados são portadores assintomáticos capazes de eliminar o vírus em grandes concentrações após situações de estresse, caracterizando um importante mecanismo de disseminação da infecção dentro dos rebanhos (PATEL & HELDENS, 2005; PENA et al, 2006). A infecção primária com o EHV-1 normalmente resulta numa resposta imunológica

capaz de proteger o animal contra reinfecções por quatro a oito meses, embora alguns relatos tenham demonstrado períodos inferiores a três meses (PAILLOT et al, 2008).

Apesar de quase todos os rebanhos apresentarem animais reagentes ao EHV-1, somente em quatro deles havia histórico prévio de abortamentos (totalizando 12 animais). O baixo índice de abortamentos nestes rebanhos pode ser atribuído à ocorrência de infecções subclínicas ou com sinais clínicos leves. Reações cruzadas com o EHV-4, que não possui característica abortigênica são muito comuns e devem ainda ser consideradas. Nenhuma dessas 12 éguas apresentou sorologia positiva contra o EAV; porém em duas éguas receptoras pertencentes ao mesmo rebanho foi detectada a presença de anticorpos específicos contra o EHV (título de 8). A presença de sorologia positiva nesses animais poderia sugerir uma possível associação do EHV-1 com os episódios de abortamentos. Entretanto, o diagnóstico definitivo somente seria possível após a realização da sorologia pareada para avaliar o aumento dos títulos de anticorpos específicos contra o EHV, ou ainda pelo isolamento viral a partir de secreções ou do aborto.

Outro aspecto investigado no presente trabalho foi a avaliação de 44 amostras de soro provenientes de éguas vacinadas contra a rinopneumonite equina durante a prenhez. O protocolo vacinal utilizado pelo veterinário responsável consistiu na administração de uma vacina inativada comercialmente disponível no mercado nacional (Pneumabort K® _{- Fort Dodge) pela via intramuscular no 5º, 7º e 9º} mês de gestação, conforme recomendações do fabricante.

A análise crítica destes dados é de fundamental importância, pois fornece aos veterinários informações relevantes em relação às taxas de soro-conversão no rebanho e dos níveis de anticorpos induzidos após imunização sendo, deste modo, um bom indicativo da eficácia vacinal. Níveis moderados ou até mesmo relativamente altos de anticorpos neutralizantes são geralmente induzidos pelas vacinas inativadas disponíveis no mercado para proteção contra o aborto equino. Isto pode ser atribuído, embora que parcialmente, a uma maior carga antigênica nas preparações vacinais além da associação dos antígenos com potentes adjuvantes. Porém, as vacinas inativadas estão geralmente associadas a indução de uma resposta imune celular pouco efetiva e que é de fundamental importância na proteção clínica contra o EHV-1 (ROSAS et al, 2006).

As vacinas utilizadas na profilaxia e controle das infecções pelo EHV devem proteger os animais da infecção viral, do desenvolvimento de doença respiratória e da subsequente disseminação viral pela nasofaringe. A vacinação deve ainda prevenir a disseminação sistêmica pela viremia associada a células, e limitar a reativação viral, evitando quadros neurológicos e de abortamentos (PAILLOT et al, 2008). Considerando estes aspectos, é evidente que se faz necessário uma resposta imune efetiva com estimulação tanto da resposta celular e humoral. Altos títulos de anticorpos neutralizantes reduzem a infecção epitelial e a disseminação viral através da neutralização de partículas virais extracelulares. Porém, a resposta imune celular é essencial na estimulação de células e moléculas que possuem a capacidade de interferir com etapas intracelulares do ciclo de replicação viral (PAILLOT et al, 2008).

Anticorpos neutralizantes têm sido correlacionados com proteção contra alguns sinais clínicos da doença e do tempo de viremia em infecções experimentais ou testes de eficácia vacinal (GOODMAN et al, 2012; GOEHRING et al, 2010). Tais anticorpos são direcionados contra as glicoproteínas do envelope viral, reduzindo a disseminação viral quando os vírions são liberados de células infectadas. Estudos recentes indicam ainda que os anticorpos neutralizantes parecem ser mais eficientes na fase inicial da infecção onde ocorre intensa replicação viral no epitélio respiratório (GOODMAN et al, 2012).

Neste estudo foi observado que 53,65% das amostras oriundas de animais vacinados (22/41) foram consideradas negativas no teste de SN, ou seja, os títulos de anticorpos foram inferiores a 2 (limite de detecção da prova sorológica). Estes dados são relevantes e devem ser analisados criteriosamente, pois demonstram, inicialmente, uma incapacidade dos imunógenos em induzir anticorpos específicos nos animais após o protocolo de vacinação recomendado pelo fabricante. Esta parcela significativa de equinos vacinados contra a rinopneumonite equina e com títulos baixos ou indetectáveis de anticorpos neutralizantes, mesmo após três imunizações consecutivas, tem sido frequentemente observada na rotina do diagnóstico laboratorial (Dr. Marcelo de Lima, comunicação pessoal).

Embora já tenha sido demonstrada a importância da imunidade celular na proteção contra herpesvírus, a indução de anticorpos específicos tem sido considerada um bom parâmetro para avaliação da resposta vacinal (ALLEN, 1995).

Segundo Goehring et al (2010), apenas a detecção de um aumento na frequência do precursor de LTC MHC I poderia predizer uma proteção contra as consequências mais graves da infecção pelo EHV-1, como a EHM e o abortamento. Porém, a quantificação desse precursor é extremamente laboriosa e possui um custo impraticável para uso em grandes experimentos. Por este motivo, as comparações entre imunógenos e avaliações de eficácia vacinal são frequentemente dependentes da mensuração de anticorpos.

Resultados similares aos observados no presente estudo foram descritos em um estudo de campo na Austrália onde foi avaliada a soroconversão de 159 éguas e 101 potros após imunização com uma vacina contendo antígenos inativados do EHV-1 (Duvaxyn®, Fort Dodge). Mesmo seguindo criteriosamente as orientações do fabricante, os autores demonstraram que menos de 30% das éguas e menos de 50% dos potros responderam à vacinação (FOOTE et al, 2002).

Considerando que somente a resposta humoral possui correlação limitada com proteção clínica contra o EHV aliado ao fato de que 50% dos animais imunizados não possuíam títulos detectáveis de anticorpos neutralizantes, os dados do presente estudo sugerem que, pelo menos neste caso específico, a vacinação pode resultar em uma falsa sensação de proteção para o rebanho. Estudos envolvendo um número maior de animais e diferentes imunógenos contendo antígenos do EHV devem ser conduzidos no sentido de comprovar tais observações. Em relação ao vírus da arterite viral equina (EAV), o percentual de animais soropositivos nesse estudo (0,79%) foi muito similar ao encontrado por Bello et al (2007) em MG (0,85%), e inferior aos 2,2% detectados no RS por Diel et al (2006) e dos 18,2% e 5,7% em São Paulo (LARA et al, 2002; BRAGA et al, 2012). Esses índices superiores de animais soropositivos encontrados em SP pode ser um reflexo da grande movimentação de animais importados nesse estado, que é o maior criador e importador da raça Quarto de Milha no Brasil, além da importação de animais de salto e provas hípicas. No Rio Grande do Sul, a proximidade da fronteira com outros países, particularmente com a Argentina, poderia facilitar a entrada e/ou trânsito de animais infectados sem um maior controle da fiscalização. Minas Gerais e Rio de Janeiro têm como maioria no seu plantel de equinos as raças nacionais Mangalarga Marchador e o Campolina, diminuindo as possibilidades de entrada do EAV nos rebanhos pela importação de sêmen ou de animais vivos.

As éguas eliminam o vírus naturalmente após uma infecção aguda e desenvolvem uma resposta imune efetiva na proteção contra reinfecções (HOSTNIK et al, 2011). No presente estudo, foram observados títulos de anticorpos neutralizantes relativamente baixos (entre 2 e 4) em três das cinco amostras positivas de soro testadas (Tabela 05) sugerindo uma provável infecção prévia pelo EAV antes do ingresso destes animais nas respectivas propriedades. No estudo realizado por Lara et al. (2002), os títulos de anticorpos detectados em animais não vacinados variaram entre 4 e 256.

No caso do animal de número 2, que apresentou títulos neutralizantes igual a 4, trata-sede uma égua doadora de embriões, e o contato com o EAV pode ter ocorrido por transmissão venérea através de inseminação artificial com sêmen contaminado.

Como normalmente éguas dessa categoria são criadas em baias separadas e dificilmente têm contato direto com o garanhão, é possível a ocorrência de uma infecção subclínica que normalmente é observada na grande maioria dos casos. Os animais de número 1 e de número 3 são éguas receptoras de embrião, e que não apresentaram histórico de abortamentos ou sinais clínicos compatíveis com arterite viral equina. Destes três animais, somente a égua de número 3 apresentou sorologia positiva também para o herpesvírus equino (titulo de 8).

Títulos relativamente altos de anticorpos neutralizantes (≥ 512) são geralmente induzidos em animais experimentalmente infectados com cepas do EAV (MACLACHLAN et al, 1998) ou imunizados com vacinas atenuadas (SUMMERS- LAWYER et al, 2011). Neste sentido, os resultados observados referentes às duas éguas soropositivas da região de Teresópolis merecem atenção especial pelos títulos elevados de anticorpos detectados (1024 e 4096). Estes altos níveis de anticorpos são sugestivos de uma infecção recente pela estimulação imunológica devido a replicação viral.

A égua nº 04 não pertencia à propriedade onde foi coletada a amostra, estando hospedada no local durante a estação reprodutiva até a confirmação de sua prenhez, o que levou cerca de três meses, quando a mesma retornou à sua propriedade de origem, próximo ao local de coleta. Não se obteve maiores informações acerca do histórico dessa égua ou de outros animais dessa

propriedade, sendo interessante uma avaliação sorológica do plantel para maiores esclarecimentos acerca da circulação do EAV neste local.

A égua n°05 foi importada da Europa para o estado de São Paulo e posteriormente transferida para o RJ cerca de três meses antes da coleta da amostra de soro utilizada neste estudo. Há a possibilidade de que a referida égua tenha sido vacinada em seu país de origem na Europa, porém é pouco provável a manutenção destes títulos elevados por um período prolongado de tempo. Por outro lado, infecções prévias (e não recentes) não podem ser descartadas pelo fato de que animais infectados naturalmente pelo EAV desenvolvem anticorpos específicos que permanecem detectáveis por vários anos. Infecções persistentes são bem documentadas em garanhões (TIMONEY, 2002) e poderiam justificar, embora que parcialmente, a indução de títulos altos de anticorpos pela re-estimulação constante do sistema imunológico devido a replicação viral.

Ambas as éguas com títulos altos de anticorpos contra o EAV conviveram com outros animais da propriedade, e não houve relatos de quadros clínicos respiratórios ou abortivos desde a época da coleta até o presente momento. Estes dados são consistentes com o fato de que o estado de portador ainda não foi identificado em fêmeas equinas (TIMONEY, 2002).

A égua nº 05 foi inseminada com sêmen congelado e importado de um garanhão de alto valor zootécnico, negativo para EAV, e que tem seu sêmen monitorado constantemente. Outra égua da propriedade também foi inseminada com o mesmo sêmen e não apresentou títulos anti-EAV no teste de SN (dados não mostrados). O Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA) tem como uma das exigências para a importação de sêmen um atestado sorológico negativo contra o EAV.

É importante salientar que as éguas n°04 e n°05 foram inseminadas com sêmens distintos, não tiveram contato direto e foram separadas em lotes diferentes. Diante dos dados disponíveis, não foi possível identificar a causa precisa desses altos títulos encontrados nessas éguas. Cabe ainda destacar que não foi possível uma avaliação do histórico das éguas antes de seu ingresso nas propriedades, dificultando uma investigação epidemiológica mais detalhada em relação a provável origem da infecção destes animais pelo EAV.

Apesar do baixo percentual de animais positivos no teste de SN contra o EAV, fica demonstrada a ocorrência do agente no estado do Rio de Janeiro, já que a presença de anticorpos específicos em animais não vacinados é um indicativo de exposição prévia ao agente. Considerando que a apresentação assintomática da infecção pelo EAV é relativamente comum, medidas de profilaxia e controle devem ser tomadas a fim de se evitar a disseminação viral e o surgimento de surtos da enfermidade no estado do Rio de Janeiro e em nível nacional.

O presente trabalho representa a primeira investigação da ocorrência de soro- reatividade perante o herpesvírus equino (EHV) e o vírus da arterite equina (EAV) pela detecção de anticorpos neutralizantes em tropas de equinos não vacinados distribuídos em diferentes regiões do estado do Rio de Janeiro.

8. CONCLUSÕES

- Animais reagentes ao EHV foram detectados em grande escala, e em praticamente todos os rebanhos analisados, porém os maiores percentuais foram observados em rebanhos localizados nos municípios de São Sebastião do Alto (53%) e Seropédica (32%);

- A presença de anticorpos específicos em animais não imunizados indica exposição prévia ao EHV e EAV demonstrando a possibilidade da circulação destes agentes em rebanhos equinos do estado do RJ;

- É baixa a ocorrência da sororreatividade perante o vírus da arterite equina, no entanto foram verificados pela primeira vez no estado do RJ;

- Após imunização com vacina comercial de vírus inativado verificou-se baixa soroconversão, indicando possíveis limitações no uso desta vacina.