UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE FACULDADE DE VETERINÁRIA MESTRADO EM MEDICINA VETERINÁRIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CLÍNICA E REPRODUÇÃO ANIMAL
KATHRYN ANNE FORD DIAZ
OCORRÊNCIA DE ANTICORPOS CONTRA O HERPESVÍRUS EQUINO E VIRUS DA ARTERITE EQUINA EM TROPAS DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO
NITERÓI 2013
KATHRYN ANNE FORD DIAZ
OCORRÊNCIA DE ANTICORPOS CONTRA O HERPESVÍRUS EQUINO E VIRUS DA ARTERITE EQUINA EM TROPAS DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária da Universidade Federal Fluminense, como requisito parcial para obtenção do Grau de Mestre. Área de concentração: Clínica e Reprodução Animal.
Orientador: Prof. Dr. WALTER LILENBAUM Co-orientador: Prof. Dr. MARCELO DE LIMA
Niterói 2013
KATHRYN ANNE FORD DIAZ
OCORRÊNCIA DE ANTICORPOS CONTRA O HERPESVÍRUS EQUINO E VIRUS DA ARTERITE EQUINA EM TROPAS DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária da Universidade Federal Fluminense, como requisito parcial para obtenção do Grau de Mestre. Área de concentração: Clínica e Reprodução Animal.
Aprovada em 25 de fevereiro de 2013.
BANCA EXAMINADORA
_____________________________________________________ Prof. Dr. WALTER LILENBAUM – Orientador - UFF
_____________________________________________________ Profª. Drª. TATIANA XAVIER DE CASTRO - UFF
_____________________________________________________ Profª. Drª. MELISSA HANZEN PINNA – UFBA
Niterói 2013
EPÍGRAFE
“Há um tempo em que é preciso abandonar as roupas usadas, que já tem a forma do nosso corpo, e esquecer os nossos caminhos, que nos levam sempre aos mesmos lugares. É o tempo da travessia: e, se não ousarmos fazê-la, teremos ficado, para sempre, à margem de nós mesmos.”
AGRADECIMENTOS
À minha família, pelo apoio e paciência.
Ao meu orientador Walter Lilenbaum, por apostar na idéia, e pela oportunidade. Ao meu co-orientador Marcelo de Lima, que foi meu grande mestre nessa jornada, e cuja parceria imprescindível fez com que esse projeto desse certo. Obrigada por tudo!
À Renata Ferreira, o link para que esse projeto se tornasse meu.
À Ana Paula Loureiro, minha grande parceira, especialmente durante as coletas pelo Rio de Janeiro.
Aos colegas e professores do Departamento de Virologia da UFF, por todo seu apoio e ajuda. Em especial à professora Ana Maria Pinto, que praticamente me adotou durante as minhas aventuras com cultura de células.
Aos colegas do Departamento de Bacteriologia da UFF, pela força.
Aos colegas e professores do Departamento de Virologia e Imunologia da UFPel, que muito me ajudaram na execução da parte prática do experimento, e me aceitaram de braços abertos em seu convívio. Aos amigos de Pelotas, que amenizaram o frio julino do Sul com sua companhia.
Aos novos e velhos amigos do mestrado, fonte de diversão e desabafo ao longo desses dois anos.
RESUMO
A infecção pelo herpesvírus equino (EHV) e o vírus da arterite equina (EAV) tem sido associada a perdas econômicas importantes para a equideocultura em nível mundial. Alguns estudos sorológicos têm demonstrado a circulação destes agentes no Brasil. O presente trabalho teve como objetivo principal estudar a ocorrência de anticorpos específicos contra o EAV e EHV em cavalos oriundos de diferentes regiões do estado do Rio de Janeiro. Para este propósito, foram coletadas amostras de soro de 581 animais não vacinados e de 44 éguas provenientes de um plantel vacinado regularmente contra a rinopmeunonite equina. Todas as amostras foram submetidas ao teste de soroneutralização para a pesquisa de anticorpos específicos contra cada um dos vírus. Os resultados demonstraram 29,6% (172/581) de animais soropositivos para o EHV (títulos entre 2 e ≥ 256) e 0,79 % (05/630) para o EAV (títulos entre 2 e 4096). Considerando os animais não vacinados, os achados demonstram que os anticorpos específicos foram induzidos após exposição natural aos respectivos vírus indicando uma provável circulação destes agentes nos rebanhos analisados. Além disto, a avaliação da soroconversão contra o EHV em animais imunizados a campo com uma vacina comercialmente disponível contra o EHV-1 indicou que apenas 50% (22/44) dos animais soroconverteram (títulos entre 4 e ≥ 256). Estes resultados sugerem, nas condições de campo analisadas neste estudo, uma incapacidade da vacina contra o EHV-1 em induzir anticorpos específicos na grande maioria dos animais após o protocolo vacinal recomendado pelo fabricante.
ABSTRACT
Equine herpesvirus (EHV) and equine arteritis virus (EAV) infections have been associated with important economic losses for the equine industry worldwide. Some serological studies have demonstrated the presence of these agents in Brazil. The aim of this study was to evaluate the occurrence of specific antibodies against EAV and EHV in horses from different regions of Rio de Janeiro state. For this purpose, serum samples of 581 non-vaccinated animals and 44 breeding mares regularly vaccinated against equine rhinopneumonitis were collected. All samples were submitted to the virus neutralization test for the detection of specific antibodies to each virus. The results showed 29.6% (172/581) of seropositive animals for EHV (titers between 2 and ≥ 256) and 0.79% (05/630) for EAV (titers between 2 and 4096). Considering the non-vaccinated animals, the findings demonstrated that specific antibodies were induced after natural exposure to the respective viruses, indicating a probable circulation of these agents in the herds analyzed. In addition, the evaluation of seroconversion against EHV in the immunized animals using a commercially available vaccine against EHV-1 indicated that only 50% (22/44) of animals seroconverted (titers between 4 and ≥ 256). These results suggest, under field conditions analyzed in this study, the failure of the EHV-1 vaccine to induce specific antibodies responses in most animals following the vaccination protocol according to the manufacturer’s recommendations.
SUMÁRIO
Resumo p. 06
Abstract p. 07
Lista de ilustrações p. 10
Lista de tabelas p. 11
Lista de abreviaturas, siglas e símbolos p. 12
1. Introdução p. 13
2. Herpesvirus equino p. 15
2.1. O agente e a enfermidade p. 15
2.2. Situação da enfermidade em nível mundial e nacional p. 21
2.3. Diagnostico clínico e laboratorial p. 23
2.4. Profilaxia e controle p. 26
3. Vírus da arterite viral equina p. 29
3.1. O agente e a enfermidade p. 29
3.2. Situação da enfermidade em nível mundial e nacional p. 33
3.3. Diagnóstico clínico e laboratorial p. 37
3.4. Profilaxia e controle p. 40
4. Objetivo Geral p. 43
4.1. Objetivos específicos p. 43
5. Material e métodos p. 44
5.1. Animais p. 44
5.2. Amostras para sorologia p. 46
5.3. Células e vírus p. 47 5.4. Diagnóstico sorológico p. 47 6. Resultados p. 49 7. Discussão p. 53 8. Conclusões p. 60 9. Obras citadas p. 61 10. Apêndices e Anexos p. 71
10.1 Planilha de coleta de dados dos animais utilizados nas amostras
p. 72
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 01: Efeito citopático (ECP) característico de EHV-1 em células da linhagem
RK13. p. 25
Figura 02: Efeito citopático (ECP) característico de EAV em células da linhagem
RK13. p. 38
Figura 03: Mapa político do estado do Rio de Janeiro com a identificação dos respectivos municípios (área preenchida em cor preta) de onde foram coletadas as amostras de soro equino. p. 46
Figura 04: Variação nos títulos de anticorpos neutralizantes contra o EHV-1 em animais não-vacinados contra a rinopneumonite equina e oriundos de diferentes municípios do Estado do Rio de Janeiro. O título de anticorpos (eixo Y) é dado pela recíproca da diluição (base 2) do soro capaz de prevenir a produção de ECP na monocamada de células. p. 50
Figura 05: Número de animais soropositivos com o respectivo título de anticorpos neutralizantes específicos contra o EHV provenientes de um grupo de 44 éguas vacinadas contra a rinopneumonite equina. Foram consideradas soronegativas todas as amostras com títulos de anticorpos inferiores a 2. *Soros tóxicos (n=3) foram desconsiderados. p. 51
LISTA DE TABELAS
Tabela 01. Relação dos municípios e distribuição das propriedades com o respectivo número de animais utilizados no estudo. Todos os municípios são pertencentes ao
estado do Rio de Janeiro. p. 45
Tabela 02. Total de animais não vacinados e reagentes no teste de soroneutralização frente ao herpesvírus equino (EHV) e vírus da arterite equina (EAV) p. 49
Tabela 03. Resultados dos testes de soroneutralização para o herpesvírus equino tipo-1 em amostras provenientes de animais não vacinados contra a rinopneumonite equina oriundos de diferentes municípios do estado do Rio de Janeiro. p. 50
Tabela 04: Resultados dos testes de soroneutralização para o vírus da arterite equina (EAV) em amostras provenientes de animais não vacinados oriundos de diferentes municípios do estado do Rio de Janeiro. p. 52
Tabela 05: Procedência das amostras de soro equino consideradas positivas no teste de soroneutralização com os respectivos títulos de anticorpos contra o EAV.
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS
EHV: Equine herpesvirus (herpesvirus equino) EAV: Equine arteritis virus (Virus da arterite equina) RK-13 : Rabbit kidney cells (células de rim de coelho) VERO: sigla de células de rim de macaco verde nm: nanômetros
kDa: kilo Dáltons
DNA: ácido desoxirribonucleico RNA: ácido ribonucleico
ORF: open reading frame
EHM: encefalomielite causada pelo herpesvirus ECP: efeito citopático
SN: soroneutralização
PCR: reação em cadeia da polimerase IPX: imunoperoxidase
IFA: imunofluorescência
ELISA: enzyme -linked immunosorbent assay MEM: meio essencial mínimo
1. INTRODUÇÃO
O Brasil possui o quarto maior rebanho de equinos do mundo com estimados 5,5 milhões de animais (IBGE 2010, FAO 2010). Este número expressivo de animais representa a importância da equideocultura nacional do ponto de vista social e econômico. A movimentação financeira desta atividade é da ordem de R$ 7,3 bilhões anuais e a ocupação direta de cerca de 640 mil pessoas; número esse que pode chegar a 3,2 milhões de pessoas se contabilizados os empregos considerados indiretos (BARROS, 2006).
Também cresceu no país o interesse de criadores e associações de criadores de equinos em pesquisas voltadas à reprodução assistida e na aplicação de biotécnicas voltadas à reprodução equina, visando o melhoramento genético e seleção de animais mais adaptados ao perfil do criador. No cenário mundial, o Brasil ocupa a primeira posição na utilização da técnica de transferência de embriões em equinos, com 41% da atividade mundial, seguido por Argentina com 31% e Estados Unidos com 20% (STROUD, 2010).
Porém, apesar do grande investimento em tecnologia reprodutiva para potencializar a produtividade, ainda há falhas no manejo clínico e sanitário dos rebanhos, o que com frequência resulta em prejuízos econômicos significativos nos diversos setores da equideocultura. Adicionalmente, a ocorrência de doenças infecciosas com impacto na reprodução tem sido diversas vezes observada por técnicos e produtores, resultando em perdas embrionárias e a ocorrência de abortamentos. Nos haras, a aquisição de equinos do exterior ou de outros rebanhos associada à criação conjunta de animais de diversas faixas etárias podem facilitar a entrada ou difusão dos agentes infecciosos.
As enfermidades de etiologia viral estão entre as mais importantes na espécie equina, pois determinam importantes prejuízos econômicos decorrentes, essencialmente, de perdas reprodutivas e restrições no comércio e trânsito de equinos (AGUIAR et al, 2008). Dentre as doenças virais, a infecção pelo herpesvirus equino tipos 1 (EHV-1) e 4 (EHV-4) e pelo vírus da arterite equina (EAV) são
reconhecidamente importantes por causarem quadros clínicos respiratórios, reprodutivos e, com menos frequência, sinais neurológicos (OSTLUND, 1993). A detecção de anticorpos específicos em animais não vacinados é um indicativo de exposição prévia a estes agentes. No caso do EHV-1, o animal permanece latentemente infectado após a primo-infecção, sendo uma fonte importante de disseminação aos demais animais da mesma propriedade devido a reativações com excreção viral. No caso do EAV, o garanhão com infecção persistente torna-se um reservatório natural do vírus, disseminando o agente pelo sêmen.
No campo, têm sido comumente observado relatos de abortamentos em éguas, porém em muitos casos não se consegue chegar a um diagnóstico etiológico conclusivo. Por esta razão, é essencial o conhecimento regional da situação epidemiológica e da circulação dos principais agentes infecciosos associados com prejuízos econômicos à indústria equina. Alguns estudos sorológicos de caráter regional têm demonstrado a circulação do EHV-1 e do EAV no território nacional, enfatizando a importância da implementação de estratégias de controle e prevenção dessas enfermidades além de uma maior vigilância desses agentes. Particularmente, no estado do Rio de Janeiro, apesar do rebanho equino de 114.778 animais (IBGE, 2011), não existem dados acerca da circulação destes agentes virais nos rebanhos.
2. Herpesvírus equino
O herpesvirus equino (equine herpesvirus – EHV) é considerado um dos principais patógenos virais de equinos em nível mundial (OSTLUND, 1993). Atualmente, são reconhecidos quatro tipos de herpesvírus associados com enfermidades em equinos. Dentre eles, as infecções pelo EHV-1 e EHV-4 têm sido apontadas como as mais relevantes e estão associadas, essencialmente, com enfermidades respiratória e reprodutiva (SÁENZ & URCUQUI-INCHIMA, 2006).
2.1 O agente e a enfermidade
Os herpesvírus são vírus envelopados, com cerca de 150 nm de diâmetro, possuem um nucleocapsídeo icosaédrico e DNA linear de cadeia dupla (MURPHY et al, 1999). O sequenciamento genômico completo do EHV-1 indicou que o genoma viral possui 150.223 nucleotídeos, contendo cerca de 80 ORFs (open reading frames) (TELFORD et al, 1992). O genoma viral contém 76 genes com potencial para codificar 77 proteínas diferentes (PATEL et al, 2005). O vírus do herpes simplex (HSV) é o protótipo da família Herpesviridae, tendo todos os seus genes transcritos e traduzidos de forma sequencial (SÁENZ & URCUQUI-INCHIMA, 2006). A transcrição é dividida em três fases ou três grupos de genes: immediate early (IE), early (E) e late (L). O genoma viral possui um único gene IE, 55 genes E e 20 genes L. Foram ainda identificados seis genes com funções essencialmente regulatórias [IE (1), E (4) e L (1)], controlando a regulação da cascata de expressão gênica (SLATER et al, 2007).
Os genes IE são sintetizados inicialmente pela RNA polimerase II celular, e seus produtos são basicamente fatores de transcrição requeridos para iniciar a síntese dos RNAm early (RNAmE). Subsequentemente, as proteínas early atuam regulando negativamente a transcrição de RNAm IE, e estão envolvidas na síntese do DNA viral, usualmente como enzimas ou como proteínas ligadas ao DNA. Além disso, estas proteínas são requeridas para a transcrição dos genes late. As
proteínas late (L) são sintetizadas nas últimas fases do ciclo de replicação viral, e muitas delas são componentes estruturais dos vírions (SÁENZ & URCUQUI-INCHIMA, 2006).
As glicoproteínas do envelope viral possuem um importante papel no processo de infecção, mediando a entrada e difusão célula-célula dos vírions. No EHV já foram identificadas 10 glicoproteínas: gB, gC, gD, gE, gG, gH, gI, gK, gL e gM. Além dessas, também foram identificadas outras glicoproteínas como a gp2, gp 21/22a e gp10, uma proteína encontrada no tegumento – substância amorfa presente entre o envelope e o capsídeo (SÁENZ & URCUQUI-INCHIMA, 2006).
Nove tipos de herpesvirus já foram isolados a partir de amostras clínicas de equídeos. Entre estes vírus, as infecções pelo EHV-1 e EHV-4 parecem ter o impacto mais perceptível no desempenho e saúde dos cavalos. Sete dos nove tipos de herpesvirus equino já identificados (1, 3, 4, 6, 7, 8 e 9) foram classificados como membros da subfamília Alphaherpesvirinae enquanto que o EHV-2 e 5 são membros da subfamília Gammaherpesvirinae (OSTERRIEDER, 2009). O equino é o hospedeiro natural dos alfaherpesvirus EHV-1, EHV- 3 e EHV-4 e dos gamaherpesvirus EHV-2 e EHV-5, enquanto o asno é o hospedeiro dos alfaherpesvirus AHV-3 (homólogo ao EHV-1) e AHV-1 (homólogo ao EHV-3), e do gamaherpesvirus AHV-2. Há ainda o EHV-9, isolado de gazelas, muito similar geneticamente ao EHV-1 (PATEL et al., 2005).
As características principais dos alfaherpesvírus podem ser resumidas em um ciclo replicativo rápido causando lise de células infectadas e, principalmente, o estabelecimento de infecções latentes. A transmissão normalmente ocorre por contato direto, principalmente entre mucosas, ou a transmissão pode ocorrer via aerossóis, mais comum em locais com alta concentração de animais (MURPHY et al, 1999).
Os herpesvírus de equinos estão classificados em quatro tipos principais: EHV-1 – associado com surtos de abortamentos, quadros respiratórios e neurológicos; EHV-2 – menos patogênico, podendo causar faringite crônica e conjuntivite; EHV-3 – vírus do exantema coital equino; EHV-4 – associado com quadros clínicos respiratórios (DONALDSON, 2003).
O EHV-1 pertence à subfamília Alphaherpesvirinae, gênero Varicellovirus; possui distribuição mundial e se constitui em um importante agente causador de
abortamento em éguas. O EHV-1 está mais associado a abortamentos e a doença neurológica; entretanto também pode causar infecções respiratórias. O abortamento pode ocorrer entre 14 e 120 dias após a infecção, porém é mais frequentemente observado após o sétimo mês de gestação (CHRINSIDE et al, 2000). O quadro respiratório aparece sob a forma de surtos acometendo principalmente animais jovens (idade inferior aos dois anos), com sinais de febre alta (até 41 ºC), fluxo nasal seroso, congestão de mucosa nasal e das conjuntivas palpebrais. Pode ocorrer aumento de volume dos linfonodos submandibulares. Esses sinais clínicos são mais raros em equinos mais velhos, onde se observa infecções subclínicas. O quadro abortivo comumente se dá após um surto do quadro respiratório, onde a égua não apresenta qualquer sintoma, ocorrendo geralmente no terço final da gestação (LARA et al, 2003).
O EHV-1 tem sido associado a perdas econômicas importantes, tanto na esfera clínica (atrasos no treinamento e redução de desempenho além dos gastos com tratamento) como na esfera reprodutiva, com o óbito do potro (OSTLUND, 1993). Pelo fato de ser geneticamente e antigenicamente relacionado com o herpesvírus equino tipo 4 (EHV-4, agente da rinopneumonite equina), estes dois vírus eram antigamente considerados subtipos 1 e 2 do EHV-1, respectivamente. O sequenciamento genômico demonstrou uma homologia de 55 a 84% entre o EHV-1 e o EHV-4 (TELFORD et al, 1998).
Uma das características mais importantes dos herpesvirus é o estabelecimento de latência como uma estratégia de evasão do sistema imunológico do hospedeiro. Nas fases iniciais da infecção do trato respiratório, o EHV-1 infecta neurônios periféricos e alcança o gânglio trigêmeo em 48 h após a infecção, estabelecendo uma infecção latente com persistência do DNA viral de forma epissomal no núcleo neuronal. Além da latência neuronal, o DNA viral pode persistir de forma latente nos linfócitos T circulantes, e no sistema linforreticular após o término da fase virêmica. Durante a latência, a expressão do genoma viral é suprimida e somente um RNA viral transcrito do gene IE, conhecido como LAT (latent associated transcript) está presente. (SLATER, 2000; PAILLOT et al, 2008).
Durante o período de latência não há replicação e excreção viral; as células latentemente infectadas não expressam antígenos virais e, consequentemente não são detectadas e eliminadas pelo sistema imune. A reativação da latência parece
ser o fator mais importante na indução de surtos neurológicos causados pelo EHV-1 (PAILLOT et al, 2008).
Muitos aspectos relacionados com a reativação da infecção latente e a consequente recrudescência clínica ainda não foram completamente elucidados. Entretanto, é frequentemente observada a reativação viral após episódios de estresse, como desmame, castração, transporte, doenças, mudança de local, e em casos experimentais onde se induziu uma imunossupressão por meio da administração de corticosteróides (PATEL et al, 2005; SLATER, 2000).
A infecção pelo EHV-1 ocorre pela inalação de aerossóis ou por meio de fômites. Ocorre replicação primária em células epiteliais da nasofaringe, traquéia e brônquios, resultando em lise celular e no aparecimento de erosões na mucosa nasal (OSTLUND, 1993). Após a replicação inicial no epitélio da mucosa respiratória, o EHV-1 rapidamente alcança a membrana basal e lâmina própria permitindo disseminação sistêmica do vírus através dos sistemas linfático e circulatório. O vírus infecta então linfócitos T (CD5+ e CD8+) circulantes e células endoteliais, levando à viremia associada a células. Aparentemente, os linfócitos T se infectam inicialmente na lâmina própria do epitélio respiratório alcançando os linfonodos regionais em até 48 h pós-infecção (PAILLOT et al, 2008). A viremia é responsável pela disseminação viral pelo organismo, sendo um pré-requisito para a ocorrência de sequelas importantes como quadros abortivos e neurológicos (PATEL et al, 2005).
O vírus é geralmente transmitido de forma horizontal, por contato direto e indireto entre animais suscetíveis e animais que estão excretando o vírus durante a infecção aguda ou em episódios de reativação da infecção latente. Geralmente, a duração e magnitude de excreção viral são significativamente superiores durante a infecção aguda, porém, a excreção após a reativação é suficiente para permitir a transmissão do vírus. Os equinos são os únicos hospedeiros naturais conhecidos deste agente e animais de todas as idades são suscetíveis à infecção pelo EHV (FRANCO, 2012).
Surtos abortivos estão associados ao EHV-1, porém o EHV-4 já foi relacionado a casos esporádicos. As éguas que abortam normalmente não possuem nenhuma sintomatologia respiratória. Os abortamentos ocorrem de duas semanas a meses após a exposição ao vírus, e em sua maioria nos quatro meses finais de gestação. A viremia leva à vasculite no endométrio e ou à infecção do feto. Na
maioria dos casos o feto abortado contém grande quantidade de vírus sendo uma importante fonte de infecção nos rebanhos (OSTLUND, 1993).
Embora a patogenia da encefalomielite ou do abortamento pareça ser multifatorial, a fase virêmica da infecção pelo EHV-1 é crítica pelo transporte intracelular do vírus desde o trato respiratório e tecido linfoide associado até o SNC ou útero (GOEHRING et al, 2011). O abortamento é consequente à isquemia resultante da vasculite no endotélio vascular uterino. Essa inflamação leva a um quadro de necrose trombo-isquêmica dos microcotilédones e do estroma intercotiledonário. Se as lesões vasculares forem extensas, o feto será expulso antes de infecção viral transplacentária. Em outros casos, a interrupção na barreira uteroplacentária permite a entrada do vírus ou de células infectadas pelo EHV-1 na circulação fetal (SMITH & BORCHERS, 2001; SLATER, 2000).
Existem duas hipóteses diferentes quanto à patogenia dos abortamentos decorrentes da infecção pelo EHV-1. A primeira indica que o abortamento ocorre pela infecção placentária ou do feto, ou de ambos. A segunda hipótese surgiu de estudos onde não foram detectados antígenos virais em fetos abortados e placentas, após infecção experimental das mães. De acordo com essa teoria, o abortamento ocorre devido ao infarto placentário resultante de lesões endoteliais causadas pela infecção viral na vasculatura endometrial (MUKAIYA et al, 2000).
Edington et al (1991), em um estudo utilizando uma cepa virulenta do EHV-1 (Army 184), demonstraram a infecção inicial das células endometriais e tecidos placentários, seguido de trombose, hemorragia e isquemia endometrial secundária levando ao abortamento na fase final da gestação. A presença de RNAm do EHV-1 no citoplasma de trofoblastos e nas células epiteliais que recobrem os vilos alantocoriônicos placentários sugerem infecção direta célula a célula entre o endométrio e os trofoblastos (MUKAIYA et al, 2000). Szeredi et al (2003) detectaram, além do ácido nucleico viral, a presença de antígenos virais nos trofoblastos das membranas fetais, reforçando a hipótese de que o vírus pode infectar o tecido placentário através desse caminho.
A razão pela qual a grande maioria dos abortamentos causados pelo EHV-1 ocorre no terço final da gestação ainda não é totalmente esclarecida, porém, estudos indicam que fatores hormonais relacionados à gestação podem ter influência no quadro inflamatório decorrente da infecção pelo EHV-1. Foi observado
que as mudanças vasculares endometriais e a expressão de antígenos virais nas células endoteliais foi inferior nas éguas em inicio de gestação. A progesterona, cortisona e o estrógeno em alta concentração inibem a resposta linfocitária, e a progesterona tem um efeito imunossupressor nas concentrações encontradas na interface materno-fetal, tanto em humanos como em animais de laboratório. É provável que qualquer efeito direto da progesterona na facilitação da infecção viral no endométrio seja maior quando o hormônio é secretado na interface uteroplacentária na fase final gestacional do que quando liberado na circulação pelo corpo lúteo nos primeiros 4-5 meses de gestação (SMITH et al, 1996). Além disto, foi recentemente demonstrado que a regulação da expressão de moléculas de adesão na superfície endotelial pode ser dependente do ambiente hormonal na fase final da gestação (LUNN et al, 2009).
Em abortamentos decorrentes da infecção pelo EHV-1, a placenta encontra-se normal ou levemente edemaciada, e é expulsa juntamente com o feto ou em poucos minutos após, como ocorre em um parto normal. Lesões fetais macroscópicas incluem edema pulmonar, icterícia, edema subcutâneo, esplenomegalia e acúmulo de líquido peritoneal e pleural. Numerosos pontos necróticos branco-acinzentados medindo 1-5 mm de diâmetro estão presentes no fígado (DONALDSON, 2003).
A mieloencefalopatia causada pelo herpesvirus tipo 1 em equinos consiste em uma manifestação esporádica e incomum. Os sinais neurológicos incluem mieloencefalite difusa e multifocal, secundária a vasculite, hemorragia, trombose e injuria isquêmica neuronal. Normalmente se observa um inicio súbito e manifestação precoce de ataxia, paresia e incontinência urinária, podendo haver o envolvimento de diversos animais com um histórico recente de febre, abortamentos ou doença respiratória (PUSTERLA et al, 2009).
Tem sido sugerido que as diferenças de patogenicidade do EHV-1 sejam devido à circulação de linhagens distintas do vírus. Nugent et al. (2006) compararam geneticamente duas cepas de EHV-1 circulantes (cepa Ab4, conhecidamente neuropatogênica, isolada de um caso de paralisia, e a cepa V592, não-neuropatogênica, isolada de um surto abortivo, sem sinais neurológicos). As análises indicaram que a cepa neuropatogênica possuía uma mutação na ORF30, onde há uma troca da base de adenina para guanina na posição 2254 do gene que
codifica a subunidade catalítica da DNA polimerase. Esta mutação resulta em um aumento na duração e magnitude da viremia em animais infectados (LUNN et al, 2009).
2.2 Situação da enfermidade em nível mundial e nacional
O herpesvirus equino é considerado endêmico na população equina em todo o mundo (OSTLUND, 1993). Estudos sorológicos realizados no estado de Kentucky (EUA), na década de 1960, já indicavam que 85% dos potros entre 6-8 meses após desmame eram soropositivos para o vírus da rinopneumonite equina. Estudos subsequentes confirmaram a soroprevalência da infecção pelo EHV em potros no mesmo estado, porém com a observação que a grande maioria das infecções estava associada especificamente com o EHV-4 (GILKERSON et al, 1998). Estudos anteriores conduzidos pelo mesmo grupo de pesquisadores demonstraram que a infecção de potros lactentes pelo EHV-1 pode ocorrer antes dos 30 dias de vida, e que as éguas em lactação são as prováveis fontes primárias da infecção para outras éguas e potros no mesmo rebanho (GILKERSON et al, 1997).
A encefalomielite herpética (EHM – equine herpes myeloencephalopathy) tem apresentado um aumento de sua prevalência nos Estados Unidos e Europa, afetando inclusive outras espécies, com surtos neurológicos fatais causados pelo EHV-1 em ursos-negros, porquinhos da índia e gazelas e pelo EHV-9 em um urso-polar, gazelas e girafa (WOHLSEIN et al, 2011; SCHRENZEL et al, 2008). Em 2000 foi relatado um surto neurológico na Virgínia (EUA), onde 19 de 44 cavalos desenvolveram sintomatologia nervosa (FRIDAY et al, 2000). Outro surto ocorrido em 2003 onde 117 cavalos apresentaram sinais de infecção pelo EHV-1 e 44 destes apresentaram sinais de EHM (HENNINGER et al, 2007). Mais recentemente em Utah (EUA), foram 26 casos confirmados com EHM no ano de 2011 (KYDD et al, 2012). No Canadá, 20 de 104 cavalos apresentaram o quadro neurológico em um surto ocorrido em 2008 (BURGESS et al, 2012). No continente europeu têm sido reportados surtos neurológicos na Holanda, Bélgica, Croácia e França (GOEHRING et al, 2006; GRYSPPERDT et al, 2011; BARBIC et al, 2012; PRONOST et al, 2010b).
Recentemente, um surto abortivo em éguas não-vacinadas foi relatado na Inglaterra (IRWIN et al, 2007). Na Turquia, um estudo demonstrou a presença de anticorpos específicos para o EHV-1 e 4 em equídeos com 14,5% (42/290) dos equinos, 37,2% dos muares e 24,2% dos asininos reagentes ao EHV-1 (ATASEVEN et al, 2009). Na Polônia, uma análise de 452 amostras de tecidos provenientes de potros abortados ou natimortos no período compreendendo os anos de 1977 a 2010 detectou o EHV-1 em 106 (23,5%) das amostras analisadas por isolamento do vírus e detecção de antígenos virais por imunofluorescência direta (BAZANOW et al, 2012).
No Brasil, vários estudos sorológicos demonstraram que os herpesvirus encontram-se amplamente disseminados entre os equinos de nosso país. Em 2000, Moreira et al. detectaram 17,7% de soros positivos em 299 amostras de soro sanguíneo de animais não-vacinados contra rinopneumonite equina na região de Curitiba, Paraná. Neste mesmo estudo não foi observado relação entre a soropositividade e a raça, sexo ou procedência dos animais, porém houve relação direta do percentual de animais soropositivos com a evolução da idade dos animais. Esta mesma tendência de níveis altos de soropositividade observado em animais mais velhos foi também observada em estudos posteriores (LARA et al, 2003; 2010). No Rio Grande do Sul, Diel et al. (2006) observaram 4,5% de animais soropositivos para o herpesvirus equino em 1.506 amostras provenientes de 65 municípios do estado. Em São Paulo, um percentual de 27,2% de soropositividade para o herpesvirus equino em 1.341 equinos não vacinados contra o EHV foi detectado em rebanhos no noroeste do estado em 2002. Lara et al.(2003) detectaram também em São Paulo anticorpos anti-EHV-1 em 33,4% dos 659 animais não vacinados testados no período entre 1995-1996. Em 2009 foi detectado que 26% de 163 equídeos (143 equinos e 20 muares) na região sul de SP foram soropositivos para o EHV-1 (CUNHA et al, 2009).
Um inquérito sorológico realizado em Minas Gerais demonstrou um percentual de soropositividade para o EHV de 17,6% em 826 amostras de equídeos analisadas (LARA et al, 2010). Já na região norte do Brasil, no município de Monte Negro em Rondônia, Aguiar et al. (2008) detectaram em um total de 176 equídeos não-vacinados contra o EHV (15 muares e 161 equinos), 22,7% de animais reativos ao EHV-1. Heinemann et al., (2002) encontraram em equinos não-vacinados de
propriedades familiares rurais de Uruará, no Pará, 17,71% de animais soropositivos para o herpesvirus equino num total de 96 amostras de 32 propriedades. Também no Pará, Pena et al (2006) em um estudo para estimar a prevalência de anticorpos contra os vírus da influenza equina, arterite equina e herpesvirus equino, observaram 45,5% de soropositividade para o EHV em um total de 506 soros de equinos não-vacinados.
2.3 Diagnóstico clínico e laboratorial
De um modo geral, as manifestações clínicas decorrentes da infecção pelo herpesvirus equino tipo 1 e o vírus da arterite equina são semelhantes em muitos aspectos, podendo resultar desde infecções subclínicas até manifestações respiratórias seguidas de abortamento (HEINEMANN et al, 2002). A sintomatologia clínica da infecção pelo EHV-1 e EAV é semelhante à doença respiratória decorrente das infecções causadas por outros agentes infecciosos tais como o herpesvírus equino tipo 4 (EHV-4), rinovírus equino, vírus da influenza equina (EIV), vírus da anemia infeciosa equina (EIAV), Streptococcus spp e Rhodococcus equi (CHRINSIDE, 2000). Por este motivo, o diagnóstico diferencial das infecções pelo EAV e pelo EHV-1 deve obrigatoriamente ser confirmado por exames laboratoriais (TIMONEY, 2002; BELL et al, 2006; HOLYOAK et al, 2008; CHRINSIDE et al, 2000).
Em surtos ou episódios de abortamento em equinos, o diagnóstico presuntivo da infecção pelo EHV-1 pode ser realizado de acordo com algumas características clínicas e epidemiológicas tais como o período gestacional de ocorrência, sinais clínicos apresentados pelas fêmeas, histórico de enfermidade respiratória no local de criação ou histórico de estresse além do histórico de surtos abortivos (OSTLUND, 1993). Somado a estas informações, devem ser observadas as características macroscópicas do feto e da placenta além de achados de necropsia onde
frequentemente são observadas lesões vasculares graves com exsudato seroso ou sero-sanguinolento nas cavidades serosas; mucosas aparentes podem estar ictéricas, assim como o tecido subcutâneo; petéquias no baço, rins, pleura e ás vezes no epicárdio e endocárdio. O fígado geralmente se apresenta congesto e com necroses focais puntiformes (THOMASSIAN, 2005).
O diagnóstico laboratorial da infecção pelo EHV-1 pode ser realizado pelo isolamento e identificação viral a partir de amostras clínicas ou ainda pela sorologia pareada. As amostras clínicas a serem coletadas e enviadas ao laboratório incluem swabes naso-faríngeos, capa leucocitária do sangue coletado de animais na fase aguda da doença; amostras do pulmão, baço, fígado ou timo de fetos abortados ou natimortos além do soro dos animais suspeitos. O swabe contendo exsudato naso-faríngeo deve ser acondicionado em meio de transporte (meio de cultivo celular) refrigerado. As amostras fetais devem ser coletadas de forma asséptica e transportadas a 4 ºC preferencialmente em meio de cultivo celular. As amostras que não forem rapidamente processadas devem ser congeladas a -70 ºC (OIE, 2008).
O EHV-1 é capaz de se multiplicar em cultivos celulares de outras espécies além da equina, o que auxilia a diferenciá-lo do EHV-4, que só se multiplica em células de origem equina. Células das linhagens RK-13 (rabbit kidney cells) e VERO (African green monkey kidney cells) são rotineiramente utilizadas para o isolamento e multiplicação do EHV-1 em laboratórios de virologia (FRANCO, 2012). Em células suscetíveis in vitro, o EHV-1 produz efeito citopático (ECP) típico de herpesvírus: arredondamento celular, formação de aglomerados semelhantes a cachos de uva, produção de focos de destruição da monocamada de células (Figura 01).
Figura 01: Efeito citopático (ECP) característico de EHV-1 em células da linhagem RK13.
A identificação do vírus pode ser feita pelo uso de anticorpos monoclonais em testes de imunofluorescência (IFA) ou imunoperoxidase (IPX). Essas técnicas têm sido também utilizadas para demonstrar a presença de antígenos virais em cortes de tecidos congelados e/ou em células infectadas (FRANCO, 2012).
O diagnóstico direto da infecção pelo EHV-1 por técnicas moleculares, como a reação em cadeia pela polimerase (PCR), oferece uma boa alternativa ao isolamento viral em cultivo celular, sendo um método sensível de detecção do EHV-1 em secreções respiratórias, linfócitos circulantes e outros tecidos. Os resultados geralmente são obtidos em poucas horas após o processamento das amostras, permitindo a implementação precoce de medidas de controle e reduzindo a disseminação viral. Como a PCR tem como base a amplificação e detecção de um segmento do genoma viral, não há distinção entre vírus viável, latente ou inativado (VARASSO et al, 2001; HARLESS & PUSTERLA, 2006; LUNN et al, 2009).
A detecção de anticorpos no soro de animais com suspeita de infecção pelo EHV-1 pode ser realizada por soroneutralização (SN), fixação de complemento (FC) e ELISA (OIE, 2008). Um aumento de quatro vezes ou mais nos títulos de anticorpos
em amostras de soro coletadas na fase aguda e na fase convalescente da enfermidade (geralmente intervalo de 14-21 dias) fornece o diagnóstico definitivo da infecção pelo EHV-1 (LUNN et al, 2009). A imunidade humoral contra o EHV-1 é relativamente de curta duração. Anticorpos neutralizantes e fixadores de complemento aparecem cerca de duas semanas após a infecção e tanto IgG como IgM podem ser detectados. Anticorpos fixadores de complemento tem meia vida curta e desaparecem em cerca de três meses, enquanto que anticorpos neutralizantes podem persistir por mais de um ano (PAILLOT et al, 2008).
O teste de soroneutralização (SN) é utilizado para se detectar anticorpos específicos presentes no soro com capacidade de neutralizar a infectividade viral. O teste pode ser feito em amostras individuais ou em soros pareados. Basicamente, o soro suspeito é testado frente a uma cepa padrão de vírus previamente quantificada (BRUM, 2012).
Entretanto, a SN não permite a diferenciação entre os anticorpos induzidos após infecção pelo EHV-1 ou EHV- 4 pela reatividade sorológica cruzada entre esses dois agentes. Devido a sua similaridade antigênica, a interpretação dos dados de estudos sorológicos realizados até o inicio dos anos 1990 foi complicado pela falta de um teste especifico para cada subtipo viral. Além disto, os testes sorológicos convencionais não permitem a diferenciação dos anticorpos vacinais daqueles induzidos pela infecção natural (PATEL & HELDENS, 2005; FOOTE et al, 2006).
2.4 Profilaxia e Controle
A profilaxia e o controle das infecções por herpesvírus em equinos consistem, essencialmente, em medidas de higiene e manejo adequadas associadas à vacinação. Os programas de controle geralmente possuem três objetivos básicos: prevenir a entrada do agente no local de criação, limitar a extensão da disseminação e severidade dos sinais clínicos uma vez que o agente já atingiu a propriedade, e limitar a disseminação do EHV a outras propriedades durante um surto (SLATER, 2007).
Na década de 1960, logo após a descoberta do isolamento e adaptação do EHV-1 em cultura de células, foi desenvolvida uma vacina replicativa resultante da atenuação da cepa RacH por sucessivas passagens em células de rim suíno. Alterações genômicas com a deleção do gene IR6 durante passagens do vírus em células heterólogas in vitro, poderiam explicar a base genética da atenuação viral justificando sua segurança em relação à reversão da virulência (ROSAS et al, 2006).
As vacinas atualmente utilizadas para a profilaxia contra o EHV-1 são na sua maioria inativadas, apesar de diversos estudos demonstrarem a importância da imunidade celular para a proteção clínica (ALLEN et al, 1995). Apesar dos níveis de anticorpos neutralizantes não estarem correlacionados com o nível de proteção, a frequência de linfócitos T citotóxicos específicos para o EHV-1 parece ser maior em indivíduos protegidos contra a doença do que os não protegidos (BRESGEN et al, 2012).
A maioria das vacinas contendo antígenos do EHV-1 é comercializada como vacinas polivalentes, associadas com antígenos do EHV-4, EIV (vírus da influenza equina), tétano, e os vírus da encefalite equina venezuelana, leste e oeste (VEEV, EEEV, WEEV). Apenas três vacinas foram licenciadas para a proteção contra o abortamento induzido pelo EHV-1, uma na Europa (Prodigy®, Intervet) e duas nos EUA (Pneumabort K®, Duvaxyn®, Fort Dodge). Nenhuma das vacinas comercialmente disponíveis tem como foco principal a proteção contra a forma neurológica da infecção (ROSAS et al, 2006). No Brasil, todas as vacinas licenciadas e aprovadas pelo Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA) são inativadas.
Uma vacinação eficiente contra o EHV-1, com a indução de imunidade protetora de longa duração ainda não está disponível comercialmente. O aumento da ocorrência de surtos de EHV-1 em nível mundial, particularmente com a apresentação neurológica, tem resultado numa reavaliação dos imunógenos utilizados atualmente para o controle da infecção em rebanhos equinos (VAN DE WALLE et al, 2010). A ineficácia das atuais vacinas inativadas ou de vírus vivo modificado em promover completa proteção contra a infecção do EHV-1 estimulou a pesquisa e o desenvolvimento de diversas vacinas experimentais tais como vacinas de DNA, de subunidades e deleção de genes (FOOTE et al, 2006; SOBOLL et al, 2006, 2010; PATEL et al, 2003).
Como medidas profiláticas, podemos ainda citar a restrição da movimentação de equinos e o isolamento de animais com sintomas respiratórios; separação das éguas prenhes e com potros de outras categorias de animais, principalmente onde existam equinos jovens que são mais susceptíveis à infecção respiratória; evitar situações estressantes como desnutrição, transporte e superlotação, evitando assim possíveis reativações de infecções latentes (CHRINSIDE et al, 2000; FRANCO, 2012). Em casos de abortamentos em éguas, o vírus é excretado junto com o feto e a placenta, que podem conter altos títulos de vírus, e são importantes fontes de infecção. O contato direto ou indireto com esse material frequentemente resulta na disseminação do EHV-1 em uma propriedade (FRANCO, 2012; TIMONEY et al, 2006).
3. Vírus da arterite viral equina
A arterite viral equina (AVE) é uma doença infecciosa de equídeos, assim chamada pelas características das lesões inflamatórias nos pequenos vasos sanguíneos, especialmente nas arteríolas durante a fase aguda da infecção (TIMONEY, 2002). A enfermidade possui distribuição mundial e está associada a prejuízos econômicos importantes para a indústria equina. Embora a doença possa ser confundida com diversas outras enfermidades com características clínicas semelhantes, a infecção pelo vírus da arterite equina (EAV – equine arteritis virus) deve ser considerada em casos esporádicos ou epizoóticos de síndromes respiratórias e/ou abortivas, morte de potros associada a sinais respiratórios e/ou entéricos, ou morte súbita em potros (DEL PIERO, 2000a).
Identificado como o agente do “Complexo aborto-influenza equina” por muitos anos, o vírus da arterite equina finalmente foi classificado como um agente etiologicamente distinto após um surto de doença respiratória e abortamentos em uma criação de cavalos próximo a cidade de Bucyrus, Ohio (EUA) em 1953. Nesta ocasião o vírus foi isolado e posteriormente caracterizado a partir do pulmão de um feto abortado (TIMONEY, 2002).
3.1 O agente e a enfermidade
O vírus da arterite equina é o protótipo do gênero Arterivirus, Família Arteriviridae (SNIJDER & MEULENBERG, 1998). Baseado na estrutura genômica e estratégias de replicação, três outros vírus são classificados dentro do mesmo gênero: vírus elevador da lactato desidrogenase em camundongos (LDEV), vírus da febre hemorrágica dos símios (SHFV) e o vírus da síndrome respiratória e reprodutiva dos suínos (PRRSV) (LIMA & OSÓRIO, 2012).
O EAV é um vírus esférico com diâmetro variando entre 50-70 nm. Possui um nucleocapsídeo possivelmente icosaédrico envolto por um envelope lipoprotéico contendo projeções de glicoproteínas virais (DEL PIERO, 2000a). O genoma
consiste em uma molécula linear de RNA fita simples de sentido positivo de aproximadamente 12,7 kb e nove ORFs (open reading frames) que são traduzidas em proteínas estruturais e não-estruturais (METZ et al, 2008). As ORFs 1a e 1b estão localizadas na região proximal 5’, ocupando três quartos do genoma e são traduzidas em 12 polipeptídeos não estruturais com funções de proteases e complexo replicase. As demais ORFs (2a, 2b, e 3 a 7) estão localizadas na porção 3’ do genoma e codificam as proteínas estruturais (GP2a, GP2b, E, GP3, GP4, GP5, M, e N respectivamente) do vírus (YOUNG GO et al, 2011).
Dentre as proteínas do envelope viral, a proteína de membrana não-glicosilada de 16-kDa (proteína M) e a proteína não-glicosilada de 30-42 kDa denominada GP5, são as mais abundantes e ocorrem como heterodímeros ligados covalentemente (DE VRIES et al,1995). A Gp2b (anteriormente denominada Gs), GP3 e GP4 são glicoproteínas de menor importância do envelope viral. A pequena proteína E, hidrofóbica, com 6-10.5 kDa é detectada em maior quantidade no envelope do que as outras glicoproteínas com exceção das proteínas M e GP5 (WIERINGA, 2004). A glicoproteína 5 (gp5) é a mais variável dentre as proteínas estruturais, e juntamente com a glicoproteína M é a principal responsável pela interação com a célula hospedeira e indução de anticorpos neutralizantes (METZ et al, 2008).
Atualmente, somente um sorotipo do EAV é reconhecido, o sorotipo Bucyrus; porém, isolados de campo geralmente possuem diferentes graus de virulência (LIMA & OSÓRIO, 2012). A análise e caracterização filogenética com base na sequência parcial da ORF5 (nucleotídeos 11296-11813) permitiu a subdivisão das cepas do EAV em dois grupos distintos: Norte-americano e o Europeu que ainda é subdividido em dois subgrupos: europeu 1 (EU1) e europeu 2 (EU2) (ZHANG et al, 2007).
A transmissão do EAV ocorre principalmente pela via respiratória a partir de secreções de animais na fase aguda da infecção. Outra forma importante de infecção é a venérea, pelo sêmen contaminado. Ainda foi demonstrada a transmissão horizontal via fômites ou infecção vertical do feto, sendo estas formas incomuns ou raramente observadas. O período de incubação da infecção varia de 3 a 14 dias, e o vírus é excretado em altas concentrações nas secreções respiratórias de 7 a 14 dias (BELL et al, 2006).
Há uma grande variação nos sinais clínicos e na severidade da infecção pelo EAV. A maior parte das infecções são subclínicas, e apesar de só haver um sorotipo do EAV, a doença clínica causada por diferentes cepas podem possuir diferentes graus de severidade. Assim como na maioria dos quadros infecciosos, animais velhos, debilitados ou imunossuprimidos além de potros muito jovens geralmente apresentam doença clínica mais grave (HOLYOAK et al, 2008).
Após a exposição, o vírus da arterite equina replica inicialmente nos macrófagos alveolares e rapidamente se dissemina pelo organismo e infecta diversos tipos celulares, incluindo células endoteliais, da musculatura lisa nas arteríolas e miométrio, epitélio tubular renal, epitélio adrenal e, com menor frequência, no parênquima hepático além de células das criptas intestinais e epitélio bronquial (GLASER et al, 1997). Cerca de 10 dias após a infecção, ocorre redução do antígeno viral em todos os locais, com exceção da túnica média das arteríolas musculares. Aparentemente o último local invadido é o epitélio renal tubular, onde o vírus persiste por mais duas semanas. Partículas infecciosas do EAV geralmente não são detectadas nos tecidos após 28 dias de infecção, com exceção ao trato reprodutivo de alguns machos (DEL PIERO, 2000a).
Os sinais clínicos mais consistentes da doença são a febre (geralmente ≤ 41ºC) contínua por dois a nove dias seguido de leucopenia acentuada. Além disso, tem sido frequentemente observado em casos da enfermidade a ocorrência de depressão, anorexia, conjuntivite e rinite com descarga nasal e ocular, edema peri e supra-orbital, edema de escroto e prepúcio ou glândula mamária e nos membros (principalmente membros pélvicos), urticária localizada na tábua do pescoço ou na face, ou até mesmo generalizada por todo o corpo, abortamento, pneumonia intersticial ou pneumoenterite em potros jovens (HOLYOAK et al, 2008; TIMONEY, 2002).
O abortamento normalmente não é precedido por sinais premonitórios e ocorre no final da fase aguda ou na fase convalescente da infecção pelo EAV. Pode ocorrer entre três a dez meses de gestação, e a taxa de abortamentos em surtos de EVA variam desde 10% até 50-60% (TIMONEY & MCCOLLUM, 1993). O feto pode ser expulso parcialmente autolisado, e lesões macroscópicas não são frequentes. O EAV pode ser isolado da placenta e dos tecidos e fluidos fetais que são
considerados importantes fontes de infecção para animais suscetíveis (GLASER et al, 1997).
Especula-se que a patogenia do abortamento esteja associada ao desenvolvimento de miometrite. Neste caso, a redução do fluxo sanguíneo para o feto ocorreria em função da compressão dos vasos sanguíneos pelo edema endometrial, ou por alteração do tônus vascular por diversos mediadores inflamatórios. Os níveis de progesterona sérica diminuem de seis a 48 horas antes do abortamento, e não são detectáveis à necropsia. A diminuição da produção de progesterona pela placenta hipóxica combinada com a liberação local de prostaglandinas desencadeia o descolamento coriônico. Vasculite com trombose associada também induzem a isquemia (DEL PIERO, 2000a).
O garanhão é o reservatório natural do vírus da arterite equina, que garante a sua persistência nas populações equinas por todo o mundo. O estado de portador só foi identificado no garanhão e parece ser dependente de testosterona uma vez que não foi identificado em éguas, potros sexualmente imaturos ou machos castrados (TIMONEY, 2002). Em um estudo realizado por Holyoak et al (1993), o EAV foi recuperado a partir das glândulas sexuais acessórias de potros pré-púberes por mais de 180 dias após infecção experimental. Os andrógenos exercem diversos efeitos nos tecidos reprodutivos que podem facilitar a persistência do EAV, como a manutenção da população celular suscetível ou supressão dos linfócitos T. A castração causa mudanças nessas barreiras, permitindo a eliminação viral do trato reprodutivo (MCCOLLUM et al,1994; HEDGES et al, 1999).
Durante a infecção aguda, garanhões passam por um período de subfertilidade temporária, associada com redução de libido, da motilidade e concentração espermática, e da porcentagem de espermatozoides de morfologia normal no sêmen. Essas alterações podem persistir por mais de 16 semanas, e provavelmente são resultantes do aumento da temperatura escrotal e não por alteração direta induzida pelo vírus (NEU et al, 1992).
Os machos portadores liberam o vírus no sêmen constantemente, sendo uma potencial fonte de transmissão para animais suscetíveis na época da reprodução (TIMONEY, 2002). Como uma das medidas de controle adotadas pelo Governo brasileiro, o Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA) tem como
uma das exigências para a importação de sêmen um atestado sorológico negativo do garanhão contra o EAV.
Estudos indicam a ocorrência de diversidade genética e fenotípica das cepas do EAV durante a infecção persistente no garanhão (ECHEVERRIA et al, 2010). Análises genéticas de sequências do RNA viral no sêmen desses garanhões indicam que as quasispecies de EAV evoluem consideravelmente durante o longo período de infecção persistente nestes animais (HEDGES et al,1999).
3.2 Situação da enfermidade no Brasil e em nível mundial
O grande surto abortivo causado pelo EAV no estado norte-americano do Kentucky em 1984 despertou um grande interesse de técnicos e criadores em relação a este agente viral (TIMONEY, 2002). Atualmente, diversos estudos soroepidemiológicos têm demonstrado que a infecção pelo EAV está amplamente distribuída em cavalos das Américas do Norte e Sul, Europa, Austrália, África e Ásia, com variação considerável na soroprevalência da infecção entre países e entre as populações equinas dentro de alguns países (HOLYOAK et al, 2008; LIMA & OSÓRIO, 2012).
A prevalência da infecção pelo EAV varia consideravelmente de acordo com a localização geográfica dos rebanhos. Em um estudo realizado em 1998, 2% dos cavalos não-vacinados nos EUA foram considerados soropositivos para o EAV, demonstrando a baixa soroprevalência e a alta suscetibilidade da população em caso de um eventual surto (BELL et al, 2006). Semelhantemente, cavalos residentes e não-vacinados da Califórnia tiveram uma soroprevalência de 1,9%, enquanto 18,6% dos cavalos importados para a Califórnia de fora dos EUA (mais comumente da Europa) foram positivos para EAV. Um estudo de 1973 demonstrou a presença de anticorpos anti-EAV em 2,3% dos cavalos ingleses, e de 11,3% em cavalos suíços. Cerca de 14% dos soros coletados entre 1963 e 1975 de cavalos na Holanda foram positivos. Na Alemanha, 1,8% dos cavalos foram soropositivos em 1987; todavia, a soroprevalência subiu para 20% em 1994 (BELL et al, 2006).
O primeiro isolamento do EAV na Austrália foi a partir de sêmen proveniente de garanhões importados dos Estados Unidos. Um estudo sorológico revelou que em 107 amostras de garanhões Standardbred obteve-se 73% de soropositividade, enquanto em Puros-Sangue essa soropositividade caiu para 8% (HUNTINGTON et al, 1990).
A soroprevalência da infecção pelo EAV varia não somente entre países, mas também entre raças. Nos EUA, foi observado uma diferença importante em relação as taxas de soropositividade entre Standardbred e os cavalos Puro-sangue (Thoroughbred). Neste caso, a infecção foi considerada endêmica com 77-84,3% de soropositividade no primeiro grupo, contra somente 0-5,4% de animais soropositivos da raça Puro-sangue (HOLYOAK et al, 2008). Estas diferenças específicas quanto à raça podem refletir diferenças genéticas que conferem resistência à infecção, porém, muito provavelmente são um reflexo da diferença cultural e de manejo dentro dessas populações e raças equinas. Outros estudos não demonstraram nenhuma variação especifica da raça na suscetibilidade à infecção pelo vírus da arterite equina ou no estabelecimento do estado de portador (HOLYOAK et al, 2008).
Na última década, tem sido observado um aumento nos surtos decorrentes da infecção pelo EAV. Em 2005 foi relatado um surto de arterite viral equina em uma propriedade de cavalos quarto de milha no estado do Novo Mexico, EUA, caracterizado por sintomatologia clínica pouco evidente com episódios de abortamentos causados pelo vírus. Em 2006 e 2007, um grande surto envolveu diversos estados americanos. O início se deu em uma propriedade em Novo Mexico, onde cerca de 50% das éguas sofreram abortamentos, e quatro garanhões foram infectados. O vírus se disseminou para outros seis estados americanos através do transporte de sêmen ou das éguas visitantes dessa propriedade (TIMONEY et al, 2006). Posteriormente, comprovou-se que este surto foi consequente ao ocorrido em 2005, causado pela movimentação de animais infectados entre os estados (ZHANG et al, 2010). Cabe ainda ressaltar que o uso difundido da prática de transferência de embriões em cavalos Quarto de Milha e a proliferação do número de propriedades com éguas receptoras nos últimos anos são fatores que desempenham um papel importante na epidemiologia do EAV, e que não eram reconhecidos anteriormente (TIMONEY et al, 2006).
Durante o verão de 2007, ocorreu um surto na região da Normandia, França, com animais infectados pertencentes a 18 propriedades de cinco regiões diferentes do país. Após a investigação epidemiológica, foi sugerido que um garanhão portador teria sido o foco inicial do surto (MISZCZAK et al, 2012), e o sêmen infectado usado para a inseminação artificial em outras propriedades foi o responsável pela dispersão (PRONOST et al, 2010a). Neste surto, oito mortes foram observadas, incluindo um feto, cinco potros jovens e dois cavalos adultos. Quarenta e três animais foram confirmados positivos através de RT-PCR. A análise filogenética revelou que os 33 isolados do EAV pertenciam ao subgrupo EU-2 (PRONOST et al, 2010a).
Na Bélgica foram relatados dois surtos da enfermidade: o primeiro em 2000, em uma propriedade cuja única característica clínica foi um surto abortivo com isolamento do agente e observação de animais soropositivos em 95,5% do plantel; e o segundo surto em 2008 onde dois potros neonatos morreram após apresentarem sintomatologia respiratória aguda e severa (VAIRO et al, 2012). Adicionalmente, uma pesquisa sorológica das amostras submetidas à Faculdade de Medicina Veterinária de Ghent, demonstrou um aumento de 10 a 30% de soropositividade para o EAV em equinos além do isolamento viral a partir de animais nos diferentes surtos (VAIRO et al, 2012).
Um estudo realizado por Lee et al (2010), na Coréia do Sul investigando a ocorrência de doenças infecciosas em cavalos importados entre os anos de 2003 e 2008 demonstrou a presença de 28 animais soropositivos para o EAV em um total de 6.043 animais.
A Argentina é o país sul-americano onde há o maior número de casos registrados. O primeiro isolamento do EAV neste país ocorreu em 2001 a partir do sêmen de um garanhão soropositivo (LIMA &OSORIO, 2012). Em 2010, foi relatado um surto de EAV na província de Buenos Aires, onde a fonte de infecção viral foi o sêmen de um garanhão importado da Holanda. Este sêmen foi utilizado para inseminar éguas de cinco propriedades diferentes, e de onde a infecção se espalhou através de movimentação animal para outras sete propriedades (BARRANDEGUY, 2010).
Na Venezuela, de 1.008 soros equinos pertencentes a cinco estados diferentes, foi observado 2,48% de soropositividade com uma proporção
significativamente maior em cavalos importados em relação aos cavalos locais (SAÉNZ, 2010).
No Brasil, o primeiro surto causado pelo EAV foi relatado em 1993, em Ibiúna, SP a partir de sorologia pareada (BELLO et al, 2007). Diversos estudos sorológicos posteriores tem confirmado a circulação do agente em diferentes regiões do país (LIMA & OSÓRIO, 2012). Bello et al. (2007) detectaram sete amostras positivas (0,85%) para a presença de anticorpos específicos de um total de 826 amostras de equídeos (equinos, muares e asininos) no estado de Minas Gerais.
Diel et al. (2006), encontraram 33 animais sororreativos de 1.506 amostras analisadas, correspondendo a 2,2% do total dos animais testados no Rio Grande do Sul. Em São Paulo, Lara et al (2002) encontraram uma prevalência de 18,2% em um total de 659 amostras. Essa alta prevalência em São Paulo pode ser um reflexo da grande concentração de animais, e o intenso uso de técnicas reprodutivas como a inseminação artificial, onde o sêmen infectado pode ser a fonte de introdução em um plantel negativo. Anteriormente em São Paulo, Fernandes & Souza (1999) observaram 23,52% de animais soropositivos em um grupo de animais com sinais clínicos respiratórios, e 10,34% de animais soropositivos para o EAV para animais com quadro de abortamento. Em um estudo mais recente foi encontrada uma prevalência de 5,7% (80 amostras positivas) num total de 1400 amostras provenientes de mesorregiões paulistas entre 2007 e 2008 (BRAGA et al, 2012).
Não foram detectados animais reagentes à pesquisa de anticorpos contra o EAV, em um estudo com 176 amostras, na região de Monte Negro, Rondônia (AGUIAR et al, 2008). Ainda na região Norte, Heinemann et al (2002) também não detectaram animais reagentes contra o EAV no estado do Pará, num total de 96 animais. A ausência de anticorpos anti-EAV nessa região pode ser devido à baixa aglomeração de animais, do pouco uso das técnicas de inseminação artificial ou da baixa importação de animais.
3.3. Diagnóstico clínico e laboratorial
O diagnóstico da infecção pelo vírus da arterite equina tem como base inicial as características clínicas e epidemiológicas onde se verifica sinais de enfermidade respiratória incluindo dispneia, lacrimejamento, edema de conjuntiva e partes baixas. Os abortamentos precoces ajudam a fundamentar a suspeita clínica (THOMASSIAN, 2005).
A principal preocupação na doença clínica é o abortamento na fase aguda da infecção, geralmente ocorrendo entre os três e 11 meses de gestação, concomitantemente ou logo após a infecção. As éguas que abortam podem ou não apresentar sintomatologia clínica da infecção ou sinais premonitórios de abortamento enquanto que o feto pode apresentar diferentes graus de autólise ou não apresentar lesões macroscópicas aparentes (CHRINSIDE et al, 2000; BELL et al, 2006; DEL PIERO, 2000a). Durante a avaliação histopatológica de casos confirmados da enfermidade, frequentemente observa-se a panvasculite que é mais pronunciada nas arteríolas, particularmente no ceco, cólon, baço, gânglios linfáticos associados e córtex adrenal. A presença de arterite necrotizante disseminada envolvendo células endoteliais e mediais dos vasos afetados é considerado clássico para o EAV (OIE, 2008).
Quando há suspeita de infecção aguda pelo EAV, a confirmação pode ser obtida baseada no isolamento viral ou na detecção de ácido nucléico ou antígenos virais (TIMONEY & MCCOLLUM, 1993). Para o isolamento viral, o material a ser coletado inclui swabes naso-faríngeos e conjuntivais além de amostras de sangue com anticoagulante EDTA ou citrato. O EAV pode ser isolado a partir do soro ou plasma sanguíneo por 7-9 dias após infecção aguda. Uma redução na viremia coincide com a produção de anticorpos neutralizantes específicos (HOLYOAK et al, 2008). O vírus pode ainda ser isolado de uma grande variedade de tecidos e fluidos corpóreos de animais a partir de um a dois dias após infecção experimental pela via respiratória (HOLYOAK et al, 2008; OIE, 2008). Em casos de abortamentos pelo EAV, tanto o feto como a placenta contém grandes quantidades de vírus. Deve ser realizada a tentativa de isolamento viral nos tecidos e fluidos placentários e nos
tecidos fetais, como pulmão, fígado e tecido linforreticular (TIMONEY, 2002; GLASER et al,1997).
Para aumentar as chances de isolamento e detecção do agente, as amostras clínicas devem ser obtidas o mais precocemente possível, logo após o aparecimento de febre ou outros sinais suspeitos da infecção. Os swabes devem ser acondicionados em meio de transporte (meios de cultura celular ou solução salina balanceada contendo 5% de soro fetal bovino) sob refrigeração ou congelados e enviados imediatamente em embalagem isolante térmica até o laboratório de diagnóstico. As amostras de soro sanguíneo devem ser enviadas refrigeradas, mas não congeladas (TIMONEY, 2002; HOLYOAK et al, 2008).
As linhagens celulares normalmente utilizadas para o isolamento do EAV a partir de amostras clínicas são a RK-13, VERO e células pulmonares equinas (DEL PIERO, 2000a). As culturas celulares in vitro são examinadas diariamente para o aparecimento do efeito citopático viral, que normalmente se evidencia entre 2-6 dias após a infecção (OIE, 2008) (Figura 02).
A imunohistoquímica também pode ser utilizada para detecção de antígeno viral, na presença ou não de lesões características da infecção (DEL PIERO, 2000b). A detecção de antígenos virais já foi demonstrada em tecidos de pulmão, coração, fígado, baço e na placenta de fetos abortados (SZEREDI et al, 2005).
Vários testes moleculares de diagnóstico incluindo a RT-PCR (reação em cadeia da polimerase precedida pela transcrição reversa) e RT-PCR em tempo real vêm sendo desenvolvidos para detecção de ácidos nucléicos em culturas de tecidos, secreções nasais e sêmen, e são cada vez mais utilizados na rotina laboratorial. Porém, a validação destes testes ainda é necessária antes da plena aceitação como um instrumento de confiabilidade equivalente ao teste de isolamento viral, considerado o teste de diagnóstico padrão-ouro pela OIE (LU et al, 2008).
A detecção da soroconversão utilizando a técnica de soroneutralização é um método seguro de identificação dos animais infectados. A infecção aguda pode ser confirmada sorologicamente pela detecção do aumento dos títulos de anticorpos neutralizantes anti-EAV entre a fase aguda e convalescente da doença, com um aumento de quatro vezes ou mais nos títulos de anticorpos neutralizantes específicos. A soroconversão também pode ser detectada em éguas que sofreram abortamentos, sendo uma ferramenta útil de diagnóstico quando não se consegue recuperar os restos placentários e fetais para o isolamento viral (TIMONEY & MCCOLLUM, 1993; GLASER et al, 1997; DEL PIERO, 2000a). Infecções naturais ou experimentais com o EAV resultam em imunidade duradoura contra reinfecções com diferentes isolados/cepas do vírus. Anticorpos específicos podem ser detectados entre os dias sete e 14 pós-infecção, coincidindo com o desaparecimento do vírus da circulação sanguínea. Altos títulos neutralizantes são geralmente detectados em animais com infecção persistente (LIMA & OSÓRIO, 2012).
De acordo com a OIE, a detecção de anticorpos específicos ao EAV é baseada no teste de soroneutralização. No entanto, diversos tipos de ensaios imunoenzimáticos (ELISA) têm sido desenvolvidos ao longo dos anos na tentativa de simplificar o diagnóstico sorológico do EAV. Os primeiros testes tinham como característica negativa o grande numero de falso-positivos devido a reações cruzadas com antígenos provenientes de vacinas produzidas em cultura celular (GLASER et al, 1997). Dois testes desenvolvidos, um por Cho et al. (2000) utilizando um anticorpo monoclonal de bloqueio e o outro por Nugent et al. (2000)
