Difratometria de raios-X (DRX)

A técnica de DRX foi utilizada a fim de se verificar o estado e o nível de organização do BNZ, bem como o tipo de cristal envolvido nas diferentes amostras. Sabe-se que a DRX é uma das técnicas mais utilizadas para a determinação e

caracterização microestrutural de materiais cristalinos (ASADA et al., 2004; HARRIS, 2002; ZIGONE e RUBESSA, 2005).

Inicialmente foi obtido o difratograma do BNZ não submetido à atomização

spray drying (BNZ NSD) e do BNZ obtido após o processo de secagem (BNZ SD)

(Figura 33).

Figura 33 – Difratograma do BNZ NSD (linha rosa) e BNZ SD (linha preta).

O perfil de difração do BNZ NSD evidenciou picos de difração de alta intensidade em ângulos de difração em torno de 7,2; 10,8; 16,6; 21,8 e 25 ° 2 Theta, além de outros picos secundários de menor intensidade, demonstrando o estado cristalino do fármaco. Na literatura já está bem estabelecido a cristalinidade do BNZ através da técnica de DRX (LIMA et al., 2011; MAXIMIANO et al., 2010; SOARES SOBRINHO et al., 2011; SOARES SOBRINHO et al., 2012).

Uma comparação entre os difratogramas BNZ NSD e BNZ SD foi realizada com o intuito de se verificar a influência da técnica da atomização na organização das partículas no sólido. De acordo com o verificado na Figura 33, foram identificados os mesmos picos de difração do BNZ NSD no difratograma do BNZ SD, o que indica a presença do mesmo tipo de cristal em ambas as amostras. No entanto, alguns picos apresentaram-se com menor intensidade (7,2; 10,8; 16,6; 21,8 ° 2 Theta) no BNZ SD e esta amostra apresentou um maior halo de amorfização na região de 2 Theta entre 20 e 30°. Esta diminuição de intensidade pode estar relacionada com a alteração do tamanho dos cristalitos, unidades

formadoras dos cristais. Segunda a Lei de Bragg, a intensidade difratada é dependente do número de elétrons no átomo, e, consequentemente, da densidade da molécula, sendo a intensidade da radiação difratada distinta para os diferentes planos cristalinos (BRÜGEMANN e GERNDT, 2004). Além disso, a partir da equação de Scherrer (equação 11) é possível relacionar as grandezas envolvidas no tamanho da partícula cristalina, na qual a largura e altura do pico de difração são consequência do tamanho do cristalito (BURTON et al., 2009; PATTERSON, 1939).

(11)

βhkl = largura integral das linhas de difração em radianos (Área / Intensidade); K = constante de proporcionalidade dependente da forma das partículas; λ = comprimento de onda (Å);

Tf = dimensão linear da partícula (Å);

θ = ângulo de difração de Bragg em radianos.

Os difratogramas obtidos da β-CD e da HP-β-CD estão mostrados na Figura 34.

Figura 34 - Difratograma da β-CD e da HP-β-CD.

O difratograma da β-CD mostrou-se com perfil de estrutura cristalina devido à presença de picos intensos em 9,0; 12,5; 22,7; 27,0 e 34,7 ° 2 Theta. Já a HP-β-CD apresentou-se como estrutura amorfa, o que foi identificado devido à ausência de picos de cristalinidade. Na literatura, os mesmo perfis de difração para ambas as CD foram verificados (ESCLUSA-DIAZ et al., 1994; MORAIS et al., 2006; ROIK e BELYAKOVA, 2011).

Após análise dos difratogramas do fármaco e das CD, as amostras SD e suas respectivas MF foram analisadas através da DRX (Figura 35 e 36).

Figura 35 – Difratogramas do (a) BNZ SD, (b) β-CD, (c) BNZ:β-CD MF, (d) BNZ:β-CD SD, (e) BNZ:β- CD:TEA MF, (f) BNZ:β-CD:TEA SD, (g) BNZ:β-CD:NMP MF e (h) BNZ:β-CD:NMP SD.

Ao se analisar o sistema binário contendo BNZ e β-CD (Figura 35), foi identificado, na MF, uma sobreposição dos picos presentes nos difratogramas dos componentes puros, sem a presença de picos adicionais. Ainda pode-se perceber

uma diminuição de intensidade dos picos do BNZ, provavelmente devido a sua menor proporção (em massa) na mistura. Por outro lado, o difratograma do sistema SD apresentou claramente halos de amorfização, não sendo possível a visualização clara dos picos de cristalização do BNZ e da β-CD. A DRX é um método adequado para a determinação do estado molecular do complexo de inclusão, sendo geralmente atribuído à formação do complexo de inclusão, um perfil de difração padrão para estruturas amorfas (AIGNER et al., 2012; CORTI et al., 2007). Em um estudo realizado por Soares-Sobrinho e colaboradores (2011) foi verificado evidências de complexação entre o BNZ e a sulfobutil-éter-beta-ciclodextrina (SB-β- CD), e a randomil-metilada-beta-ciclodextrina (RM-β-CD) através do desaparecimento ou diminuição de intensidade dos picos difratados do BNZ, quando as misturas foram preparadas pelos métodos de malaxagem, liofilização e evaporação. Por outro lado, Soares-Sobrinho e colaboradores (2012) verificaram apenas uma leve diminuição na intensidade dos picos do BNZ, quando complexado com a RM-β-CD.

O presente estudo permitiu identificar mudanças na organização do material após a secagem por atomização em relação à MF, indicando a formação de complexo de inclusão entre o BNZ e a β-CD no sistema SD, como antes demonstrado nos estudos de espectroscopia de IV. A interação na MF, demonstrada através da espectroscopia de IV, pode estar ocorrendo entre as superfícies cristalinas do fármaco e da β-CD, sem levar necessariamente à amorfização do material.

Nos difratogramas dos sistemas ternários contendo a β-CD verificou-se um perfil cristalino para ambas as misturas físicas, contendo TEA e NMP, porém com algumas modificações, quando comparado com os componentes isolados (Figura 35). Na BNZ:β-CD:TEA MF não foi possível identificar os picos em 9; 27 e 34,7 °, da CD, e o pico em 21,8 °, do BNZ. Na BNZ:β-CD:NMP MF os picos 9; 22,7 e 34 ° desapareceram. O desaparecimento de picos pode ocorrer devido a uma interação entre os componentes, possivelmente provocada pela dissolução de parte do material após a adição do cossolvente específico. Isto pode ocorrer também devido ao processo empregado na obtenção do material (RIBEIRO et al., 2003; RIBEIRO, FERREIRA e VEIGA, 2003). No entanto, foi verificado que o BNZ mantem-se cristalino quando submetido ao processo de atomização, quando atomizado em

solução contendo apenas o fármaco, o que indica que pode estar ocorrendo uma interação entre os componentes nas MF.

Comparando o difratograma obtido para o BNZ:β-CD:TEA SD com sua MF, foi verificado um pefil mais amorfo, com diminuição da intensidade dos picos, o que indica uma interação mais acentuada entre os componentes (Figura 35). Isto se deve provavelmente a uma complexação parcial (PATEL et al, 2007; SHU et al., 2006) ou até mesmo total do BNZ, pois de acordo com Roik e Belyakova (2011) a diminuição detectável da cristalinidade de complexos moleculares é resultado da inserção da molécula a ser complexada na cavidade da molécula complexante.

Ao se analisar o difratograma do BNZ:β-CD:NMP SD (Figura 35) identificou- se um perfil bastante semelhante ao encontrado no sistema binário SD, no qual foi verificado uma amorfização quase que completa da amostra, devido ao desaparecimento de vários picos. Podemos dizer que houve a formação de um novo insumo sólido, ou seja, a formação do complexo de inclusão, com um difratograma diferente dos obtidos para os componentes isolados (RIBEIRO, FERREIRA e VEIGA, 2003).

A Figura 36 mostra os difratogramas obtidos para os sistemas binários e ternários com a HP-β-CD.

Os difratogramas das MF, tanto do sistema binário como dos ternários, apresentaram-se como uma sobreposição dos espectros dos componentes isolados. Os picos mais intensos do BNZ poderam ser visualizados, porém com menor intensidade, assim como ocorreu nos sistemas com a β-CD, devido a maior proporção da CD. Os picos secundários foram cobertos pelo difratograma da HP-β- CD. As MF BNZ:HP-β-CD:TEA e BNZ:HP-β-CD:NMP apresentaram difratogramas praticamente idênticos, porém com uma leve diminuição na intensidade dos picos quando comparados com o BNZ:HP-β-CD MF.

Através da DRX não foi possível verificar indícios de interação entre o BNZ e a HP-β-CD na MF, pois isto só seria possível se houvesse uma formação de eutéticos. Em contrapartida, esta interação pode ser vista na presença dos solventes TEA e NMP devido à diminuição de intensidade dos picos, ocorridas provavelmente por dissolução parcial do material e consequente interação mais forte em relação às misturas binárias da CD com o fármaco. No estudo de espectroscopia IV, esta interação também foi observada.

Figura 36 – Difratogramas do (a) BNZ SD, (b) HP-β-CD, (c) BNZ:HP-β-CD MF, (d) BNZ:HP-β-CD SD, (e) BNZ:HP-β-CD:TEA MF, (f) BNZ:HP-β-CD:TEA SD, (g) BNZ:HP-β-CD:NMP SD e (h) BNZ:HP-β-CD:NMP MF.

No sistema BNZ:HP-β-CD SD foi verificado um perfil amorfo (Figura 36), sem a presença dos picos de difração do BNZ, o que indica a complexação do fármaco. Na presença da TEA e da NMP, o difratograma mostrou-se menos amorfo em comparação com o sistema binário, mas mais amorfo em comparação com suas respectivas MF. Isto sugere que os cossolventes podem estar contribuindo para uma maior organização do material ou mesmo diminuindo a eficiência da formação

de complexos de inclusão no sistema BNZ:HP-β-CD SD. Isto foi anteriormente observado nos estudos de solubilidade.

Figura 37 – Difratogramas do (a) BNZ SD, (b) BNZ:TEA MF, (c) BNZ:TEA SD, (d) BNZ:NMP MF e (e) BNZ:NMP SD.

O estudo de DRX também foi realizado para os sistemas binários BNZ:TEA e BNZ:NMP (Figura 37). Foi verificado que tanto as MF como os SD, na presença de ambos os solventes, apresentaram-se com perfil de estrutura cristalina, devido à presença de picos de difração.

Comparando-se a BNZ:TEA MF com o BNZ SD, foi verificado mudanças discretas na intensidade de alguns picos. A manutenção do difratograma cristalino do BNZ permite-nos sugerir a não formação de complexos, porém devido à mudança na intensidade de alguns picos, uma interação entre os compostos pode estar ocorrendo. Foi verificado através das metodologias empregadas neste

trabalho, que a TEA age apenas como cossolvente sobre a solubilidade do BNZ, e não como complexante. Isso pode explicar a discreta mudança de cristalinidade nos difratogramas do BNZ na presença da TEA.

Analisando-se o difratograma do BNZ:TEA SD, foi verificado um comportamento igual ao da sua MF, com mudanças discretas em seu difratograma. Isto sugere que apesar de a TEA ter evaporado do sistema, a TEA presente na solução de secagem modificou o hábito cristalino do BNZ, o que resultou em uma organização das partículas de BNZ semelhante às do BNZ na presença da TEA (MF). É interesante destacar que a presença de TEA modifica as propriedades coligativas da solução de secagem, o que pode levar a obtenção de materiais com hábitos cristalinos diferentes ou alterações no nível de organização do material (CHAN, POSEY e ROCHELLE, 1993; CHENG et al, 2003; RAY, PATI e PRAMANIK, 2001; SCOTT et al., 1990). Dessa forma, os dados experimentais confluem para a eliminação da TEA do sistema sólido pós a secagem.

Na presença da NMP, os difratogramas do BNZ comportaram-se de maneira oposta. Para a MF foi verificado um aumento de intensidade dos picos de difração. Apesar do estudo de espectrometria IV não revelar interação entre o BNZ e a NMP na MF, podemos sugerir que esse aumento de intensidade pode ter ocorrido devido à reorganização dos cristalitos de BNZ, após o contato com a NMP. Já no BNZ:NMP SD, os picos verificados diminuíram de intensidade, provavelmente devido a obtenção de um novo insumo sólido.

Além dos estudos de cristalinidade do material, é importante observar a forma e a superfície das partículas para melhor compreender os dados dos estudos de dissolução.

6.5.3 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)

O MEV é normalmente utilizado para estudar os aspectos microscópicos dos componentes puros e dos produtos obtidos por diferentes técnicas, como SD e MF (NAIDU et al., 2004). Dessa forma, a partir da análise das fotomicrografias é possível verificar a morfologia dos complexos obtidos e compará-los com as estruturas visualizadas para os componentes individuais. A Figura 38 mostra as fotomicrografias dos componentes puros.

Figura 38 – Fotomicrografias eletrônicas de varredura do BNZ NSD; BNZ SD; β-CD e HP-β-CD. Observando a fotomicrografia do BNZ NSD verifica-se a presença de cristais regulares com superfície lisa, os quais estão, em alguns pontos, aglomerados. Já o BNZ SD apresentou-se com menor uniformidade, apresentando-se como estrutura arredondada com superfície contendo pequenos cristais, havendo também a formação de aglomerados. Como verificado no estudo de DRX, ambas as estruturas mostraram-se cristalinas, porém o processo de secagem por pulverização modificou o tamanho das partículas que contém os cristalitos do BNZ, o que explica as diferenças observadas no estudo de MEV entre o BNZ NSD e BNS SD. Sabe-se que o processo de secagem spray drying pode levar a amorfização da molécula devido à rápida secagem não permitir a total reorganização da estrutura (CAL e SOLLOHUB, 2010). Além disso, Paudel e colaboradores (2012) relataram que a secagem por aspersão de fármacos pouco solúveis em água leva a formação de materiais amorfos. No entanto, o estado sólido final do produto depende também da natureza química da substância, do sistema solvente e condições de secagem. Para o BNZ SD foi mantido o tipo de cristal em relação ao BNZ NSD, com diferenças apenas no tamanho de cristalitos.

Observa-se na Figura 38 que a β-CD consiste de partículas cristalinas de tamanho e forma irregular, onde as partículas de menor tamanho se depositam sobre as maiores, e, muitas vezes, apresentam-se com formato de paralelogramas. Resultados similares foram encontrados na literatura (FIGUEIRAS et al., 2007; MURA et al., 2002; NAIDU et al, 2004). Por outro lado, a HP-β-CD revela-se amorfa, como partículas esféricas ocas, com variação de tamanho, como antes observado no estudo de DRX (Figura 38). Segundo observado por Baboota, Dhaliwal e Kohli (2004), através do MEV, a HP-β-CD possui estrutura cristalina. Porém a maioria dos estudos com a HP-β-CD, assim como com outras CD derivadas, revela que essas CD são constituídas de partículas esféricas amorfas (FIGUEIRAS et al., 2007; GARNERO, AIASSA e LONGHI, 2012; MURA et al., 2002; WANG et al., 2001). As fotomicrografias obtidas da HP-β-CD demonstram claramente que este material foi obtido por um processo rápido de secagem, como secagem por atomização ou em leito de jorro, o que explica a forma esférica das partículas e seu caráter amorfo.

Através da MEV é possível observar possíveis modificações na estrutura das partículas, como a forma e a superfície, o que permite inferir sobre a cristalinidade destas partículas, principalmente quando associada a estudos de DRX, quando estas são submetidas a diferentes métodos utilizados para obtenção de complexos de inclusão (PRALHAD e RAJENDRAKUMA, 2004). Para tanto, foram obtidas as fotomicrografias dos sistemas SD (Figura 39).

Figura 39 – Fotomicrografias eletrônicas de varredura do BNZ:β-CD; BNZ:β-CD:TEA; BNZ:β- CD:NMP; BNZ:HP-β-CD; BNZ:HP-β-CD:TEA e BNZ:HP-β-CD:NMP.

As fotomicrografias de MEV demonstram que os sistemas binários e ternários contendo a β-CD foram obtidos com sucesso (Figura 39), os quais apresentaram morfologias semelhantes. Os sistemas revelaram partículas esféricas com tamanhos variados e superfície irregular. No sistema ternário com a NMP, identificou-se, na superfície das estruturas esféricas, partículas cristalinas, semelhantes às do BNZ. Ainda no sistema ternário BNZ:β-CD:NMP foi verificado a formação de agregados, provavelmente devido a presença do terceiro componente. Em um estudo realizado por Pinto e colaboradores (2005), a formação de complexos de inclusão entre a benzocaína e a β-CD foi identificado através da

obtenção de um pó compacto e homogêneo, enquanto que Shen e colaboradores (2006) verificaram que a formação de complexo de inclusão entre o gossipol e a β- CD levava a formação de estuturas cristalinas cúbicas. Em ambos os estudos, a formação do complexo de inclusão foi identificada devido à perda da forma original dos componentes puros, levando a formação de uma única fase. Diante disto, os resultados de MEV contribuíram com as observações no estudo de DRX das amostras, nos quais foi verificada a formação de complexos de inclusão entre o BNZ e a β-CD na presença ou não dos terceiros componentes. A presença de estruturas cristalinas semelhantes ao BNZ na superfície das esferas pode indicar a presença de parte do BNZ não complexado.

As fotomicrografias dos sistemas contendo a HP-β-CD revelaram uma grande semelhança com as estruturas verificadas para os complexos com a β-CD (Figura 39), apesar das CD apresentarem morfologias bem distintas, quando puras (Figura 38). Os complexos binários e ternários com a CD derivada foram identificados como estruturas esféricas amorfas de tamanhos diferentes, demonstrando que esta característica depende do método de secagem e do sistema solvente empregado. Estas estruturas diferenciaram-se dos complexos com a β-CD por apresentaram superfície com aspecto de casca de laranja, derivado da estrutura da CD. Pequenos cristais em forma de agulha também foram revelados na superfície das esferas, referentes, provavelmente, ao BNZ não complexado. Em um estudo realizado por Baboota, Dhaliwal e Kohli (2004) as fotomicrografias das amostras contendo rofecoxib e HP-β-CD, obtidas por aspersão spray drying, apresentaram morfologia típica dos complexos obtidos por este método: partículas bem pequenas tendendo a agregação, sugerindo a presença de material amorfo. Porém, nas fotomicrografias aqui apresentadas, apesar da presença de partículas esféricas e amorfas, como demosntrado no estudo de DRX, não apresentaram agregados. Diante do que foi identificado através do estudo de MEV, podemos confirmar a obtenção de um novo insumo sólido, com interação entre os constituintes.

Apesar de a MEV ser uma ferramenta insuficiente para afirmar a formação de complexos de inclusão, esta técnica é capaz de identificar a presença de um componente único (FIGUEIRAS et al., 2007; LYRA et al., 2010; NAIDU et al., 2004), e no estudo em questão, outras técnicas foram utilizadas para confirmar a inclusão do fármaco na cavidade das CD.

Figura 40 – Fotomicrografias eletrônicas de varredura do BNZ:TEA e BNZ:NMP.

A Figura 40 mostra as fotomicrografias dos sistemas BNZ:TEA e BNZ:NMP. O sistema BNZ:TEA apresentou-se como uma estrutura cristalina, na forma de agulhas, na maioria das vezes formando agregados, e na forma de estruturas maiores sem forma definida. Já o sistema BNZ:NMP apresentou-se com perfil menos cristalino, com formato mais esférico, porém com depósito de grande quantidade de unidades cristalinas, na forma de agulhas, em sua superfície. Ambos os sistemas revelaram estruturas diferentes da observada para o BNZ puro, sugerindo interação entre os compostos, o que corrobora com o estudo de DRX.

6.5.4 Estudo de dissolução

O emprego do estudo de dissolução para caracterização físico-química de sistemas contendo CD, em fase sólida, já está bem estabelecido na literatura, sendo uma das mais importantes técnicas utilizadas (MOYANO et al. 1997; MURA et al., 1999).

O estudo de dissolução foi realizado com o intuito de verificar a contribuição das CD, assim como dos terceiros componentes, na velocidade de dissolução do farmáco. É esperado um aumento da concentração do fármaco no meio de dissolução, quando na sua forma complexada, pois como já demonstrado nos estudos anteriores, os excipentes estudados levam ao incremento da solubilidade aquosa do BNZ.

O estudo de dissolução foi conduzido, inicialmente, para o BNZ NSD e para o BNZ SD (Figura 41). Uma comparação entre os perfis de dissolução de ambas as

amostras foi realizado com o objetivo de verificar a influência da técnica de atomização na dissolução do BNZ.

Figura 41 – Perfil de dissolução do (●) BNZ NSD e do (○) BNZ SD, em condição Sink.

Ao analisar o perfil de dissolução do BNZ NSD e do BNZ SD podemos verificar que a secagem por atomização levou a uma diminuição da velocidade de dissolução do fármaco presente no meio de dissolução, apesar do estudo de MEV indicar partículas com menor organização estrutural para o BNZ SD. Esta diminuição pode ser observada já a partir dos primeiros 10 minutos e se estendeu até o final do estudo, passando de 74 ± 6 % (BNZ NSD) de massa solúvel, para 46 ± 12 % (BNZ SD). Segundo a equação de Noyes-Whitney, a velocidade de dissolução de um sólido é diretamente proporcional a sua área de superfície (HINTZ e JOHNSON, 1989; RASENACK e MÜLLER, 2002). Diante disto, podemos sugerir a presença de partículas maiores do BNZ SD em relação ao BNZ NSD, ou o maior número de agregados no BNZ SD, o que leva ao retardamento da dissolução do fármaco, pois quanto maior o tamanho da partícula, menor a sua área de superfície. Como consequência, os valores de QD15 e QD30, assim como os de ED15 e ED30 foram maiores para o BNZ não submetido a secagem por atomização (NSD) (Tabela 14).

Os perfis de dissolução dos complexos e das misturas físicas foram comparados a seguir. A Figura 42 mostra os perfis de dissolução dos complexos binários e ternários contendo a β-CD.

Figura 42 – Perfil de dissolução dos sistemas contendo (A) BNZ:β-CD, (B) BNZ:β-CD:TEA e (C) BNZ:β-CD:NMP. (●) BNZ NSD, (○) BNZ SD, (▼) SD e ( ) MF.

Comparando-se os perfis de dissolução dos sistemas binários com os do fármaco puro (NSD e SD), foi verificado que tanto o BNZ:β-CD MF como o BNZ:β-

CD SD apresentaram melhores resultados para QD e ED em ambos os tempos analisados (Figura 42 A e Tabela 14), o que indica a formação de complexos de inclusão. Estudos anteriores demonstraram que a complexação com CD aumenta a dissolução de moléculas com baixa solubilidade aquosa (FIGUEIRAS et al., 2007; MURA et al., 1998). Além disso, foi verificado que os valores obtidos para a MF