Preparação e caracterização de complexos multicomponentes contendo ciclodextrinas e benznidazol

Texto

(1)UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS. POLYANNE NUNES DE MELO. PREPARAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE COMPLEXOS MULTICOMPONENTES CONTENDO CICLODEXTRINAS E BENZNIDAZOL. NATAL-RN 2013.

(2) POLYANNE NUNES DE MELO. PREPARAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE COMPLEXOS MULTICOMPONENTES CONTENDO CICLODEXTRINAS E BENZNIDAZOL. Dissertação. apresentada. ao. Programa. de. Pós-. graduação em Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como parte dos requisitos para obtenção do título de mestre em Ciências Farmacêuticas.. Orientador: Prof. Dr. Arnóbio Antônio da Silva Júnior Co-orientadora: Dra. Lília Basílio de Caland. NATAL-RN 2013.

(3) CATALOGAÇÃO NA FONTE M528p Melo, Polyanne Nunes de. Preparação e caracterização de complexos multicomponentes contendo ciclodextrinas e benznidazol / Polyanne Nunes de Melo. – Natal, 2013. 141f. Orientador: Prof. Dr. Arnóbio Antônio da Silva Júnior. Coorientadora: Dra. Lília Basílio de Caland Dissertação (Mestrado) – Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas. Centro de Ciências da Saúde. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. 1. Tecnologia farmacêutica – Dissertação. 2. Benznidazol – Dissertação. 3. Ciclodextrinas – Dissertação. 4. Estudos de solubilidade – Dissertação. I. Silva Junior, Arnóbio Antônio. II. Título. RN-UF/BS-CCS CDU: 615.014(043.3).

(4)

(5) EPÍGRAFE “Agradeço todas as dificuldades que enfrentei; não fosse por elas, não teria saído do lugar. As facilidades nos impedem de caminhar.” Chico Xavier.

(6) DEDICATÓRIA. Dedico este trabalho aos meus pais Marlúcia Nunes de Melo e José Cícero de Melo, alicerces em minha vida..

(7) AGRADECIMENTOS. A Deus em primeiro lugar, por estar ao meu lado, guiando meus passos e segurando minha mão em todos os momentos desta caminhada para que eu me sentisse forte e capaz. Aos meus pais, José Cícero de Melo e Marlucia Nunes de Melo por terem me dado a oportunidade de chegar até aqui e por todo o esforço feito para que eu me tornasse quem hoje sou. Ao meu orientador Prof. Arnóbio Antônio da Silva Júnior por toda ajuda intelectual no processo de desenvolvimento deste trabalho. A ele agradeço pela compreensão em muitos momentos, pela sua disponibilidade e por todo o conhecimento que a mim transmitiu. A minha co-orientadora Lília Basílio de Caland, por seu compromisso, amizade, paciência e carinho, que me fizeram me sentir mais segura para dar continuidade ao meu trabalho. A minha irmã, Maryanne Nunes de Melo, pela sua constante presença ao meu lado, sem a qual, talvez não tivesse chegado aqui. Agradeço a ela por seu companheirismo, amizade, compreensão e por todas as palavras ditas, que tanto me fizeram crescer. A meus irmãos Cristiano Robson e Lucyanne Melo, que foram, e continuarão sendo, meus exemplos de vida e determinação, e ao meu irmão Arion Gleidson pelo apoio dado. Ao meu noivo e amigo Leonardo Doro Pires, pelo seu amor, companheirismo e dedicação que tanto me ajudaram a crescer pessoalmente e profissionalmente durante este período. A minha amigas e companheiras de laboratório Alice Rodrigues, Edilene Gadelha, Jahamunna Abrantes, Letícia Strek e Margarete Moreno, pelo companheirismo, ajuda, conselhos e sorrisos, que fizeram a minha caminhada menos árdua e mais alegre. Aos alunos de iniciação científica, Hugo Carpegiany e Arthur Medeiros pela ajuda no desenvolvimento do trabalho. A todos que compõem o Laboratório de Tecnologia e Biotecnologia Farmacêutica (TECBIOFAR), pela ajuda no desenvolvimento deste trabalho e pela confiança em mim depositada..

(8) A minhas amigas Ana Cláudia, Bruna Miranda, Janaina Ferrari e Livya Rafaely, que nunca me deixaram pensar que estava sozinha. Aos meus tios, Manuel e Gil, pelo apoio nos momentos mais difíceis. A minha tia Marli Melo por nunca ter esquecido de mim. Sua amizade, carinho e presença foram essenciais. Às funciónarias do PPGCF da UFRN, Fábia e Aureliana, pela disposição em ajudar. A todos os funcionários da Faculdade de Farmacia da URFN, que de certa forma contribuíram para o desenvolvimento deste trabalho. Ao Laboratório de Sistemas Dispersos (LASID), pela disponibilidade do dissolutor para o teste de dissolução. Ao Núcleo de Estudos em Petróleo e Gás Natural (NEPGN) pela análise de MEV dos sistemas em estudo. Ao Laboratório de Nanoestruturas Magnéticas e Semicondutoras (LNMS) pela análise de DRX dos sistemas em estudo. À professora Marcela Longhi e ao professor Euzébio Guimarães pela colaboração com o estudo de RMN e modelagem molecular e com seus conhecimentos pessoais. Aos professores componentes da banca de qualificação Cícero Aragão, Euzébio Guimarães e Maria Joselice e Silva e aos professores componentes da banca de defesa da dissertação, pelas contribuições dadas ao nosso trabalho. Agradeço, por fim, a todos os familiares e a todos que de certa forma se fizeram presente na minha vida e que deixaram um pouquinho de cada um, sendo eles também responsáveis pela minha conquista..

(9) RESUMO. A doença de Chagas tem como única alternativa para tratamento, no Brasil, o benznidazol (BNZ). Este fármaco possui baixa solubilidade, o que restringe sua velocidade de dissolução. Diante disto, o presente trabalho teve como objetivo o estudo das interações do BNZ em sistemas binários com a beta-ciclodextrina (β-CD) e a hidroxipropil-beta-ciclodextrina (HP-β-CD), com o intuito de aumentar a solubilidade aquosa do fármaco. A influência de sete polímeros hidrofílicos, da trietanolamina (TEA) e da metil-1-pirrolidona-2 (NMP) na solubilidade aquosa aparente do benznidazol, assim como na formação dos complexos de inclusão, também foi investigada. As interações em solução foram previstas e investigadas usando os diagramas de solubilidade de fases, espectroscopia de ressonancia magnética nuclear de prótons (RMN) e modelagem molecular. Diferentes complexos foram obtidos em fase sólida por secagem por atomização em aparelho de “spray dryer” e a caracterização físico-química destes incluiu a espectrofotometria UV-Vis, a espectroscopia na região do infravermelho, a microscopia eletrônica de varredura, a difração de raios-X e os ensaios de dissolução do fármaco a partir das diferentes amostras. O aumento da solubilidade aquosa aparente do fármaco foi alcançada de forma linear (perfil AL) na presença de ambas as ciclodextrinas em diferentes valores de pH. A presença dos polímeros hidrofílicos e da metil-1-pirrolidona-2 contribui para a estabilização dos complexos formados, enquanto a trietanolamina diminuiu a constante de estabilidade (Kc) dos complexos formados. O modelo do log linear aplicado aos diagramas de solubilidade revelou que a trietanolamina e a metil-1-pirrolidona-2 mostraram uma ação cossolvente (ambos. solventes). e. complexante. (metil-1-pirrolidona-2).. Os. melhores. resultados foram obtidos com os complexos envolvendo a metil-1-pirrolidona-2 e a hidroxipropil-beta-ciclodextrina, com um aumento de solubilidade do fármaco em 27,9 e 9,4 vezes, respectivamente. A eficácia dos complexos foi comprovada pelos ensaios de dissolução, nos quais os complexos ternários e misturas físicas envolvendo a metil-1-pirrolidona-2 e as ciclodextrinas investigadas. apresentaram. os. melhores. resultados,. demonstrando. a. possibilidade de uso como um novo insumo farmacêutico, que leve ao aumento da biodisponibilidade do benznidazol..

(10) Palavras-chave: benznidazol, estudos de solubilidade, cossolvência, complexos multicomponentes, spray drying..

(11) ABSTRACT. The benznidazole (BNZ) is the only alternative for Chagas disease treatment in Brazil. This drug has low solubility, which restricts its dissolution rate. Thus, the present work aimed to study the BNZ interactions in binary systems with beta–cyclodextrin (β-CD) and hydroxypropyl-beta–cyclodextrin (HP-β-CD), in order to increase the apparent aqueous solubility of drug. The influence of seven hydrophilic polymers, triethanolamine (TEA) and 1-methyl-2pyrrolidone (NMP) in benznidazole apparent aqueous solubility, as well as the formation of inclusion complexes was also investigated. The interactions in solution were predicted and investigated using phase solubility diagram methodology, nuclear magnetic resonance of protons (RMN) and molecular modeling. Complexes were obtained in solid phase by spray drying and physicochemical characterization included the UV-Vis spectrophotometric spectroscopy in the infrared region, scanning electron microscopy, X-ray diffraction and dissolution drug test from the different systems. The increment on apparent aqueous solubility of drug was achieved with a linear type (AL) in presence of both cyclodextrins at different pH values. The hydrophilic polymers and 1-methyl-2-pyrrolidone contributes to the formation of inclusion complexes, while the triethanolamine decreased the complex stability constant (Kc). The log-linear. model. applied. for. solubility. diagrams. revealed. that. both. triethanolamine and 1-methyl-2-pyrrolidone showed an action cosolvent (both solvents) and complexing (1-methyl-2-pyrrolidone). The best results were obtained with complexes involving 1-methyl-2-pyrrolidone and hydroxypropylbeta-cyclodextrin, with an increased of benznidazole solubility in 27.9 and 9.4 times, respectively. The complexes effectiveness was proven by dissolution tests, in which the ternary complexes and physical mixtures involving 1-methyl2-pyrrolidone and both cyclodextrins investigated showed better results, showing the potential use as novel pharmaceutical ingredient, that leads to increased benznidazole bioavailability.. Keywords:. benznidazole,. complex, spray drying.. solubility studies,. cosolvency,. multicomponent.

(12) LISTA DE ILUSTRAÇÕES. Figura 1 - Representação esquemática da estrutura química do benznidazol. 22 Figura 2 - Representação esquemática da estrutura das ciclodextrinas. ......... 24 Figura 3 – Representação gráfica dos perfis de solubilidade A e B, com seus respectivos subtipos. Fonte: BREWSTER e LOFTSSON, 2007. ..................... 28 Figura 4 - Gráfico obtido após varredura do BNZ contaminado com β-CD e TEA, e β-CD e polímeros hidrofílicos. Linha verde (β-CD e TEA), rosa (β-CD e polímeros), vermelha (BNZ, β-CD e TEA), azul (BNZ, β-CD e polímeros) e preto (BNZ)....................................................................................................... 52 Figura 5 - Curva analítica do benznidazol. ....................................................... 53 Figura 6 - Diagrama de solubilidade do BNZ na presença de β-CD................. 57 Figura 7- Diagrama de solubilidade do BNZ na presença de β-CD em pH 3 (A) e em pH 10 (B). ................................................................................................ 59 Figura 8 – Curvas de solubilidade do BNZ na presença de (A): (●) PEG 4000, (○) PEG 10000 e (▼) PEG 1500; (B) outros polímeros: (●) PLU, (○) PVA, (▼) PVP-K 30 e ( ) HPMC. ................................................................................... 61 Figura 9 - Diagrama de solubilidade do BNZ na presença de TEA (0 a 40% (p/v)). ................................................................................................................ 62 Figura 10 - Diagrama de solubilidade do BNZ na presença de NMP (0 a 40% (p/v)). ................................................................................................................ 63 Figura 11 - Diagrama de solubilidade do BNZ na presença de β-CD e TEA... 66 Figura 12 - Diagrama de solubilidade do BNZ na presença de β-CD e NMP.. 67 Figura 13 - Diagrama de solubilidade do BNZ na presença de TEA de 0 a 0,67 mol L-1 e β-CD 15 mM. ..................................................................................... 69 Figura 14 - Diagrama de solubilidade do BNZ na presença de NMP de 0 a 0,025 mol L-1 e β-CD 15 mM. ............................................................................ 70 Figura 15 - Curva de solubilidade do BNZ na presença de TEA . .................... 71 Figura 16 - Curva de solubilidade do BNZ na presença de NMP. ................... 71 Figura 17 – Influência do efeito de cossolvência e de complexação no perfil de solubilidade na escala semi-log. Adaptado de SANGHVI et al., 2008. ............. 72 Figura 18 – Complexo de inclusão proposto para o BNZ e a β-CD e o potencial eletrostático mapeado da molécula BNZ (porções polares em azul). .............. 73 Figura 19 – Quadros de dinâmica molecular do BNZ e da β-CD na presença de TEA. ............................................................................................................ 75 Figura 20 – Dinâmica molecular do BNZ e da β-CD na presença de MP. ...... 76.

(13) Figura 21 – Representação esquemática da estrutura química do (A) BNZ, (B) β-CD e (C) TEA. ............................................................................................... 78 Figura 22 - Diagrama de solubilidade do BNZ na presença de HP-β-CD (A) em água e (B) em solução ácida. ........................................................................... 81 Figura 23 - Diagrama de solubilidade do BNZ na presença de HP-β-CD com (A) TEA e (B) NMP................................................................................................. 82 Figura 24 – Espectro na região IV do BNZ ...................................................... 85 Figura 25 – Espectros na região IV da β-CD e da HP-β-CD ........................... 87 Figura 26 - Espectros na região IV da TEA ..................................................... 89 Figura 27 - Espectros na região IV da NMP .................................................... 90 Figura 28 – Espectro IV do BNZ:β-CD SD e BNZ:β-CD MF ............................ 91 Figura 29 – Espectros IV do BNZ:β-CD:TEA SD; BNZ:β-CD:TEA MF; BNZ:βCD:NMP SD e BNZ:β-CD:NMP MF ................................................................. 93 Figura 30 – Espectros IV do BNZ:HP-β-CD SD; BNZ:HP-β-CD MF ................ 95 Figura 31 – Espectros IV do BNZ:HP-β-CD:TEA SD; BNZ:HP-β-CD:TEA MF; BNZ:HP-β-CD:NMP SD e BNZ:HP-β-CD:NMP MF ......................................... 97 Figura 32 – Espectros IV do BNZ:TEA SD; BNZ:TEA MF; BNZ:NMP SD e BNZ:NMP MF ................................................................................................... 98 Figura 33 – Difratograma do BNZ NSD (linha rosa) e BNZ SD (linha preta). 100 Figura 34 - Difratograma da β-CD e da HP-β-CD .......................................... 102 Figura 35 – Difratogramas do (a) BNZ SD, (b) β-CD, (c) BNZ:β-CD MF, (d) BNZ:β-CD SD, (e) BNZ:β-CD:TEA MF, (f) BNZ:β-CD:TEA SD, (g) BNZ:βCD:NMP MF e (h) BNZ:β-CD:NMP SD. ......................................................... 103 Figura 36 – Difratogramas do (a) BNZ SD, (b) HP-β-CD, (c) BNZ:HP-β-CD MF, (d) BNZ:HP-β-CD SD, (e) BNZ:HP-β-CD:TEA MF, (f) BNZ:HP-β-CD:TEA SD, (g) BNZ:HP-β-CD:NMP SD e (h) BNZ:HP-β-CD:NMP MF. ........................... 106 Figura 37 – Difratogramas do (a) BNZ SD, (b) BNZ:TEA MF, (c) BNZ:TEA SD, (d) BNZ:NMP MF e (e) BNZ:NMP SD. ........................................................... 107 Figura 38 – Fotomicrografias eletrônicas de varredura do BNZ NSD; BNZ SD; β-CD e HP-β-CD ............................................................................................ 109 Figura 39 – Fotomicrografias eletrônicas de varredura do BNZ:β-CD; BNZ:βCD:TEA; BNZ:β-CD:NMP; BNZ:HP-β-CD; BNZ:HP-β-CD:TEA e BNZ:HP-βCD:NMP ......................................................................................................... 111 Figura 40 – Fotomicrografias eletrônicas de varredura do BNZ:TEA e BNZ:NMP ....................................................................................................... 113 Figura 41 – Perfil de dissolução do (●) BNZ NSD e do (○) BNZ SD, em condição Sink. ................................................................................................ 114.

(14) Figura 42 – Perfil de dissolução dos sistemas contendo (A) BNZ:β-CD, (B) BNZ:β-CD:TEA e (C) BNZ:β-CD:NMP. (●) BNZ NSD , (○) BNZ SD, (▼) SD e ( ) MF ........................................................................................................... 115 Figura 43 – Perfil de dissolução dos sistemas contendo (A) BNZ:HP-β-CD, (B) BNZ:HP-β-CD:TEA e (C) BNZ:HP-β-CD:NMP. (●) BNZ NSD , (○) BNZ SD, (▼) SD e ( ) MF .................................................................................................. 118 Figura 44 – Perfil de dissolução dos sistemas contendo (A) BNZ:TEA, (B) BNZ:NMP. (●) BNZ NSD , (○) BNZ SD, (▼) SD e ( ) MF ............................ 120.

(15) LISTA DE TABELAS Tabela 1 – Representação estrutural e propriedades físico-químicas de ciclodextrinas de interesse farmacêutico. ......................................................... 29 Tabela 2 – Parâmetros do spray drying para obtenção dos complexos em fase sólida (SILVA-JÚNIOR et al., 2008; OLIVEIRA et al., 2012). ........................... 47 Tabela 3 - Resultados experimentais do estudo de validação para análise do BNZ através do método espectrofotométrico UV-Vis. ...................................... 55 Tabela 4 - Valores de r e análise de variância para os diferentes estudos com β-CD. ................................................................................................................ 59 Tabela 5 - Valores de K1:1, aumento da solubilidade, pH e ∆Glivre das soluções aquosas contendo o complexo β-CD-BNZ, em diferentes condições. ......... 64 Tabela 6 – Deslocamentos químicos (δ) do RMN 1H dos componentes individuais e alterações na presença dos sistemas binários e ternários (∆δ). .. 78 Tabela 7- Constantes de estabilidade obtidas para o estudo de solubilidade com a β-CD e com a HP-β-CD. ........................................................................ 79 Tabela 8 – Quantificação teórica e experimental dos complexos obtidos através do spray dryer. ................................................................................................. 84 Tabela 9 – Picos observados no espectro IV do BNZ. ..................................... 86 Tabela 10 – Picos observados no espectro IV da β-CD. .................................. 88 Tabela 11 – Picos observados no espectro IV da HP-β-CD............................. 88 Tabela12– Picos observados no espectro IV da TEA. ..................................... 89 Tabela 13 – Picos observados no espectro IV da NMP. .................................. 90 Tabela 14 – Média dos valores de quantidade dissolvida (QD) e dos valores de eficiência de dissolução (ED) nos tempos de 15 e 30 minutos, contendo β-CD. ....................................................................................................................... 116 Tabela 15 – Média dos valores de quantidade dissolvida (QD) e dos valores de eficiência de dissolução (ED) nos tempos de 15 e 30 minutos, para os sistemas contendo HP-β-CD. ........................................................................................ 119 Tabela 16 – Média dos valores de quantidade dissolvida (QD) e dos valores de eficiência de dissolução (ED) nos tempos de 15 e 30 minutos, para os sistemas binários contendo TEA e NMP. ...................................................................... 121.

(16) LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária α-CD – alfa-ciclodextrinas BNZ – benznidazol BNZ SD – benznidazol spray dryed BNZ NSD – benznidazol não spray dryed β-CD – beta-ciclodextrina CD – ciclodextrinas DRX – difratometria de raios-X HP-β-CD – hidroxipropil-beta-ciclodextrina HPMC – hidropropilmetilcelulose ICH – Conferência Internacional de Harmonização IV – infravermelho Kc – constante de equilíbrio/estabilidade K1:1 - constante de equilíbrio/estabilidade quando o perfil é linear, indicando uma estequiometria de 1:1 MEV – microscopia eletrônica de varredura MF – mistura física NMP - metil-1-pirrolidona-2 PEG – polietilenoglicol PH – polímeros hidrofílicos PLU – Plurinic F 127® PVA – álcool polivinílico PVP – polivinilpirrolidona RM-β-CD - randomil-metilada-beta-ciclodextrina RMN – ressonância magnética nuclear SB-β-CD - sulfobutil-éter-beta-ciclodextrina SD – spray dryed TEA – trietanolamina γ-CD – gama-ciclodextrina.

(17) SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO .............................................................................................. 19 2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA ..................................................................... 20 2.1 Doença de Chagas ................................................................................. 20 2.2 Benznidazol ............................................................................................ 22 2.3 Ciclodextrinas.......................................................................................... 23 2.4 Terceiros componentes ........................................................................... 30 2.4.1 Polímeros hidrofílicos ........................................................................... 30 2.4.2 Trietanolamina .................................................................................. 31 2.4.3 Metil-1-pirrolidona-2 .......................................................................... 32 2.5 Cossolvência e complexação .................................................................. 33 2.6 Spray drying ............................................................................................ 34 2.7 Métodos utilizados para avaliar as interações entre os componentes nos complexos de inclusão .................................................................................. 35 3 OBJETIVOS .................................................................................................. 36 3.1 Objetivo Geral ......................................................................................... 36 3.2 Objetivos Específicos .............................................................................. 36 4 JUSTIFICATIVA ............................................................................................ 38 5 MATERIAIS E MÉTODOS............................................................................. 39 5.1 Reagentes, materiais e equipamentos .................................................... 39 5.1.1 Reagentes e materiais ...................................................................... 39 5.1.2 Equipamentos ................................................................................... 39 5.2 Métodos .................................................................................................. 40 5.2.1 Validação do método espectrofotométrico UV-Vis para o doseamento do BNZ....................................................................................................... 40 5.2.1.1 Especificidade ............................................................................ 40 5.2.1.2 Curva Analítica ........................................................................... 41 5.2.1.3 Linearidade e intervalo ............................................................... 41 5.2.1.4 Precisão...................................................................................... 42 5.2.1.5 Exatidão...................................................................................... 42 5.2.1.6 Robustez .................................................................................... 43 5.2.2 Estudo em solução ........................................................................... 43.

(18) 5.2.2.1 Ensaios de solubilidade .............................................................. 43 5.2.2.2 Efeito combinado do pH e das CD na solubilidade do BNZ........ 44 5.2.2.3 Efeito dos polímeros hidrofílicos na solubilidade do BNZ ........... 44 5.2.2.4 Efeito da TEA e da NMP na solubilidade do BNZ ....................... 45 5.2.2.5 Efeito combinado da CD e do terceiro componente ................... 45 5.2.3 Estudo do mecanismo de interação do BNZ com a TEA e com a NMP ................................................................................................................... 46 5.2.4 Preparação dos complexos de inclusão em fase sólida ................... 46 5.2.5 Preparação das misturas físicas ....................................................... 47 5.2.6 Análise quantitativa do fármaco nos complexos ............................... 47 5.2.7 Modelagem molecular....................................................................... 48 5.2.8 Estudo de Ressonância Magnética Nuclear de prótons (RMN 1H) ... 49 5.2.9 Caracterização físico-química ........................................................... 49 5.2.9.1 Espectroscopia na região do infravermelho (Espectroscopia IV) 49 5.2.9.2 Difratometria de raios-X (DRX) ................................................... 50 5.2.9.3 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) ............................... 50 5.2.9.4 Estudo de dissolução ................................................................. 50 5.2.10 Estatística ....................................................................................... 51 6 RESULTADOS E DISCUSSÃO..................................................................... 52 6.1 Validação do método espectrofotométrico UV-Vis .................................. 52 6.2 Ensaios de solubilidade .......................................................................... 57 6.2.1 Estudo de solubilidade de fases com β-CD e o efeito combinado com o pH ........................................................................................................... 57 6.2.2 Efeito dos polímeros hidrofílicos na solubilidade do BNZ ................. 60 6.2.3 Efeito da TEA e da NMP na solubilidade do BNZ ............................. 62 6.2.4 Efeito combinado da β-CD e do terceiro componente ...................... 64 6.2.4.1 Efeito da β-CD e de polímeros hidrofílicos ................................. 64 6.2.4.2 Efeito da β-CD na presença de TEA/NMP ................................. 66 6.2.5 Estudo do mecanismo de interação do BNZ com a TEA e com a NMP ................................................................................................................... 70 6.2.6 Modelagem molecular....................................................................... 73 6.2.7 Estudos de Ressonância Magnética Nuclear de prótons (RMN 1H) . 77.

(19) 6.2.8 Ensaio de solubilidade com HP-β-CD e o efeito combinado com o pH ................................................................................................................... 79 6.2.8.1 Efeito combinado da HP-β-CD e do terceiro componente .......... 82 6.3. Preparação dos complexos em fase sólida ............................................ 83 6.4 Análise quantitativa do fármaco nos complexos ..................................... 83 6.5 Efeito da interação dos componentes nas propriedades físico-químicas dos sistemas ................................................................................................. 85 6.5.1 Espectroscopia na região do infravermelho (IV) ............................... 85 6.5.2 Difratometria de raios-X (DRX) ......................................................... 99 6.5.3 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) ................................... 108 6.5.4 Estudo de dissolução ...................................................................... 113 7 CONCLUSÕES ........................................................................................... 122 8. PERSPECTIVAS FUTURAS ...................................................................... 125 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................... 126.

(20) 19. 1 INTRODUÇÃO. A doença de Chagas é causada principalmente pelo parasita Trypanosoma cruzi (PARKER e SETHI, 2011) e no Brasil tem como única alternativa para o seu tratamento o benznidazol (BNZ) (SOARES-SOBRINHO et al., 2011). Devido a sua baixa solubilidade, o desenvolvimento de dispersões sólidas contendo este fármaco tem sido o alvo de vários estudos em tecnologia farmacêutica. As ciclodextrinas (CD) são excipientes amplamente utilizados para o aumento da solubilidade, estabilidade e da biodisponibilidade de fármacos (CUNHA FILHO e SÁ BARRETO, 2007; HEDGES, 1998). Sua estrutura espacial cônica confere propriedades físico-químicas únicas, sendo capazes de solubilizar-se em meio aquoso e ao mesmo tempo complexar, no interior da sua cavidade, moléculas hidrofóbicas (CUNHA FILHO e SÁ BARRETO, 2008). No caso em que somente a complexação com CD não fornece uma quantidade de fármaco solúvel adequada, o uso de complexos multicomponentes tem sido apresentado como uma interessante alternativa (GUEDES et al., 2008). O terceiro componente utilizado, além do fármaco e da CD, envolve geralmente polímeros hidrofílicos e compostos hidrofílicos como a trietanolamina e derivados da pirrolidona. O presente estudo teve como objetivo estudar as interações do BNZ com a beta-ciclodextrina (β-CD) e hidroxipropil-beta-ciclodextrina (HP-β-CD) na presença de trietanolamina (TEA), metil-1-pirrolidona-2 (NMP) e polímeros hidrofílicos, como terceiros componentes, para a obtenção de complexos ternários, visando melhorar a solubilidade/velocidade de dissolução do fármaco..

(21) 20. 2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA. 2.1 Doença de Chagas. O mal de Chagas ou tripanossomíase americana é uma doença endêmica causada principalmente pelo parasita Trypanosoma cruzi (T. cruzi) e transmitida por um inseto conhecido no Brasil como barbeiro. Descoberta em 1909 na cidade mineira de Lassance, por Carlos Chagas, médico e pesquisador do Instituto Oswaldo Cruz (IOC), a doença tornou-se objeto de uma larga tradição de pesquisa no Brasil e no exterior (HADDOCK, 1979; KROPF, 2005; PARKER e SETHI, 2011; ROMERO e MORILLA, 2010). Segundo a World Health Organization (WHO) (2010), 10 milhões de pessoas foram infectadas pelo protozoário, principalmente na America Latina; mais de 25 milhões de pessoas correram risco de infecção; e até 2008 mais de 10 mil pessoas morreram em consequência desta doença. Na America Latina, os anos de vida perdidos, ajustados por incapacidade/deficiência, apresentaram-se em maior escala devido à doença de Chagas do que à meningite, a doenças sexualmente transmissíveis (DST), a hepatites B e C, e à malária (ROMERO e MORILLA, 2010). A doença de Chagas foi classificada pela Organização Mundial de Saúde (OMS) como uma doença negligenciada, por ser mais prevalente em países em desenvolvimento e apresentar poucas alternativas de tratamento. A distribuição geográfica da infecção chagásica, incluindo os seus reservatórios e seus vetores, estende-se desde o sul dos Estados Unidos até o sul da Argentina e Chile (COURA e DIAS, 2009). Acredita-se que a doença de Chagas tenha se iniciado como uma enzootia de animais silvestres há milhões de anos, transmitida entre os animais por vetores da ordem Hemiptera, família Reduvidae, subfamília Triatominae (HOARE, 1972). O mecanismo de transmissão da doença de Chagas de maior importância epidemiológica é através do vetor, onde a infecção ocorre pela penetração do T. cruzi na forma de tripomastigotas metacíclicos (eliminados nas fezes ou urina de triatomíneos, durante o hematofagismo), em solução de continuidade da pele ou mucosa íntegra. Além deste mecanismo, a transfusão sanguínea, transmissão.

(22) 21. congênita, acidentes de laboratório, transmissão oral, coito e os transplantes, também podem ser citados como formas de transmissão desta endemia (RASSI JR., RASSI e REZENDE, 2012). Os sinais da infecção aparecem no próprio lugar onde se deu a contaminação pelas fezes do inseto. Estes sinais surgem mais ou menos de 4 a 6 dias após o contato do barbeiro com a sua vítima. Os tripanossomas, eliminados pelo barbeiro e introduzidos nos tecidos da região, determinam uma inflamação que marca a "porta de entrada" da doença (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 1989). Portanto, a fase aguda da doença inicia-se através das manifestações locais na conjuntiva (sinal de Romaña) ou na pele (chagoma de inoculação) (RASSI JR., RASSI e REZENDE, 2012). As manifestações gerais são representadas por febre, adenopatia generalizada, hepatomegalia, esplenomegalia, miocardite e meningoencefalite nos casos graves (COURA, 2007). Depois da fase aguda ocorre a fase crônica (10 a 30 anos), a qual geralmente é assintomática, mas pode se apresentar com graves sintomas. Os sintomas se manifestam no sistema cardiocirculatório (cardiomegalia), digestivo (megaesôfago e megacólon), ou ambos (forma cardiodigestiva ou mista) (RASSI JR., RASSI e REZENDE, 2012). O diagnóstico da doença para a fase aguda é feito através de microscopia com identificação da forma tripomastigota em esfregaço de sangue periférico. No entanto, na fase crônica, devido ao declínio da parasitemia sanguínea, o diagnóstico é realizado com a confirmação da presença de anticorpos IgG anti-T. cruzi., através de dois testes sorológicos diferentes, como por exemplo ELISA (Enzyme-Linked Immunoabsorbent Assay) e imunofluorescência indireta (PARKER e SETHI, 2011). Os primeiros compostos desenvolvidos experimentalmente para o tratamento específico da doença de Chagas foram o atoxyl (arsênico), a tintura de fucsina, o tártaro emético e o cloreto de mercúrio, porém todos estes compostos se mostraram ineficazes no tratamento proposto (COURA e CASTRO, 2002; CROFT, 1999). Por volta do início da década de 70, surgiram dois compostos com novas perspectivas, tanto pela eficácia na fase aguda quanto pela tolerância: o nifurtimox da Bayer (Lampit®) e o benznidazol da Roche (Rochagan®) (DIAS e DESSOY, 2009; OLIVEIRA et al., 2008). No entanto, na década de 1980, o nifurtimox teve seu uso interrompido no Brasil seguido de outros países da America do Sul, por apresentar muitos efeitos adversos secundários e pelo desenvolvimento de cepas resistentes. Além disso, o desinteresse do laboratório farmacêutico em continuar a produção de.

(23) 22. um medicamento não lucrativo foi um fator de grande relevância para o fim da comercialização deste composto (MEZENCEV et al., 2008; PAULA et al., 2009; ROMERO e MORILLA, 2010; SOBRINHO et al., 2007). Os fármacos utilizados para a Doença de Chagas apresentam limitações quanto a sua eficácia na fase crônica da doença. Isto ocorre principalmente devido nesta fase os parasitas se encontrarem no interior das células musculares, na forma de amastigotas, havendo, portanto, uma redução da parasitemia na corrente sanguínea, o que consequentemente dificulta a ação antiparasitária dos fármacos.. 2.2 Benznidazol. Embora não seja uma molécula ideal, devido a sua baixa solubilidade e alta toxicidade, o benznidazol (N-benzyl-2-nitroimidazol acetamida) é o único fármaco disponível para o tratamento da doença de Chagas no Brasil (SOARES-SOBRINHO et al, 2010; SOARES-SOBRINHO et al., 2011). Sua molécula é formada por um grupo imidazol, um grupo benzeno e um grupo central acetamida (Figura 1). Em abril de 2003, os direitos e a tecnologia de fabricação do benznidazol (BNZ) foram cedidos pela Roche ao Laboratório Farmacêutico do Estado de Pernambuco (LAFEPE) (SCHOFFIELD, JANNINI e SALVATELLA, 2006).. Figura 1 - Representação esquemática da estrutura química do benznidazol.. Evidências indicam que o BNZ atua através da formação de radicais livres e/ou metabólitos eletrofílicos (URBINA e DOCAMPO, 2003). O grupo nitro (NO2) presente nesta molécula é reduzido ao grupo amino (NH2) pela ação de enzimas do tipo nitroredutases, que atuam especificamente em sistemas moleculares do tipo RNO2, levando à formação de um intermediário nitro radicalar (R-NO2-), com subsequente formação de hidroxilamina (R-NHOH). O radical nitro formado estaria envolvido com o efeito tripanocida do BNZ, através da formação de ligações.

(24) 23. covalentes com macromoléculas do T. cruzi (DNA e citocromo P450). Foi verificado também que o BNZ aumenta a fagocitose e lisa o T. cruzi através de um mecanismo dependente de interferon-gama (IFN-γ), e inibe o crescimento do T. cruzi através da enzima NADH-fumarato redutase (DIAS e DESSOY, 2009) . O BNZ está disponível no mercado na forma de comprimidos de 100 mg, sendo usualmente recomendada a dose de 5-7 mg/kg/dia durante um período de tratamento entre 30 e 60 dias (SALOMON, 2012; VIOTTI et al., 2009). O BNZ é totalmente absorvido por via oral, atingindo a concentração máxima sanguínea em 2 a 4 horas. Possui meia vida de 12 horas, sendo seus metabólitos eliminados pela urina e fezes (SOBRINHO et al, 2007). No entanto, este fármaco apresenta baixa eficácia na fase crônica da doença, significativas variações regionais na eficácia, devido ao surgimento de resistência ao T. cruzi, alta taxa de abandono do tratamento, devido aos efeitos colaterais causados, longo período de tratamento (30 a 60 dias) e a inexistência de formulação de uso pediátrico (MEZENCEV et al., 2008; PAULA et al., 2009). A toxicidade do BNZ pode ter como causa principal a interação de seus metabólitos com componentes celulares (CASTRO, 1993). O BNZ pode produzir dermatites com erupção cutânea, mialgias, polineuropatias, polineurites e desordens da medula óssea, trombocitopenia púrpura e agranulocitose, além de efeitos generalizados como náuseas, anorexia, insônia, depressão, entre outros (CASTRO, MECCA e BARTEL, 2006). Devido o BNZ apresentar baixa solubilidade em água e nos fluidos aquosos e, consequentemente, por ter sua velocidade de dissolução limitada, estratégias que permitam solucionar este problema tem sido alvo de vários estudos. (SOBRINHO et al., 2007; SOBRINHO et. al, 2009; SALOMON, 2012).. 2.3 Ciclodextrinas. As ciclodextrinas (CD) são excipientes amplamente utilizados para o aumento da solubilidade, estabilidade e biodisponibilidade de fármacos (CUNHA FILHO e SÁ BARRETO,. 2007;. HEDGES,. 1998),. as. quais. foram. descobertas. há. aproximadamente 120 anos e chamadas inicialmente de “cellulosines”. Em 1891, um cientista francês, A. Villiers, isolou a CD pela primeira vez através da digestão do.

(25) 24. amido, com auxílio do Bacillus amylobacter. Em 1903, um microbiologista austríaco, Franz Schardinger, demonstrou a estrutura cíclica destes compostos (BREWSTER e LOFTSSON, 2007; GUEDES et al. 2008; SINGH, SHARMA e BANERJEE, 2002). As CD também são conhecidas como cicloamiloses, ciclomaltoses e dextrinas de Schardinger, e são produzidas como resultado de uma reação intramolecular de transglicolisação. por. degradação. do. amido. pela. enzima. ciclodextrina. glucanotransferase (GGtase) (MARTIN DEL VALLE, 2004). As CD são carboidratos compostos de unidades de glicose (α-Dglicopiranose) unidas por ligações tipo α-1,4 (CEREDA, 2003; UEKAMA, HIRAYAMA e IRIE, 1998) e variam de acordo com número de unidades de glicose em: alfaciclodextrina (α-CD), beta-ciclodextrina (β-CD) e gama-ciclodextrina (γ-CD), com seis, sete e oito unidades, respectivamente (Figura 2). Estas são referidas como a primeira geração ou CD naturais (LOFTSSON e BREWSTER, 1996; MARTIN DEL VALLE, 2004).. Figura 2 - Representação esquemática da estrutura das ciclodextrinas.. A β-CD possui 21 grupos hidroxilas, dos quais 7 são hidroxilas primárias e 14 secundárias (UEKAMA, HIRAYAMA e. IRIE, 1998). Por. possuir cavidade. intermediária, podendo abrigar um grande número de moléculas farmacêuticas, ter baixo custo e não apresentar toxicidade quando administrada por via oral, a β-CD é a mais comum em formulações farmacêuticas (BREWSTER e LOFTSSON, 2007; MARTIN DEL VALLE, 2004). As CD possuem formato de cone truncado com a extremidade superior mais larga do que a inferior (Figura 2). Esta estruturação se dá devido à conformação das cadeias das unidades de glicopiranose: os grupos hidroxilas secundárias da CD estão localizados na borda mais larga do cone, enquanto que as hidroxilas primárias se localizam na borda mais estreita (JIANG, YAN e HUANG, 2011)..

(26) 25. A cavidade central da molécula é revestida por um esqueleto de carbonos e oxigênios etéreos dos resíduos de glicose, o que confere um meio menos hidrofílico do que o meio aquoso. Por outro lado, os grupos hidroxilas presentes nas extremidades do cone da CD confiam propriedades hidrofílicas ao seu exterior (JIANG, YAN e HUANG, 2011). No estudo realizado por Lichtenthaler e Immel (1994) a estruturação da α-CD e sua polaridade foram confirmadas através do programa de design molecular assistido (MOLCAD). Verificou-se que a porção interna da molécula é hidrofóbica e a parte exterior hidrofílica, porém a polaridade da parte exterior se torna menor com a aproximação da extremidade mais estreita do cone. Apesar dos grupos hidroxilas (OH) serem responsáveis pela hidrofilia da superfície. externa. das. CD,. estes. podem. levar. à. aglomeração. destes. oligossacarídeos e, consequente, à precipitação dos aglomerados formados. Sabese que as hidroxilas formam ligações de hidrogênio com a água presente no meio externo, induzindo à solubilização dos complexos CD-molécula, e a solvatação das moléculas de CD. Porém, a formação de ligações de hidrogênio entre as hidroxilas das CD pode levar a aglomeração destas moléculas no estado complexado ou não complexado (JIANG, YAN e HUANG, 2011). As CD naturais são hidrolisadas por α-amilase, a qual cliva as ligações glicosídicas do tipo α-1,4. As α-CD e β-CD são praticamente resistentes ao ácido estomacal e às amilases salivares e pancreáticas, mas são extensivamente hidrolisadas no cólon, enquanto que a γ-CD é lentamente digerida mesmo nas partes superiores do intestino. A introdução de grupos substituintes, no geral, retarda a hidrólise enzimática das CD, que ocorre devido à diminuição da afinidade das enzimas pelas CD ou devido a uma redução da atividade intrínseca das enzimas. Após administração oral, as CD são clivadas em maltodextrinas supostamente acíclicas, as quais são ainda metabolizadas, absorvidas e excretadas em H2O e CO2. Há ainda evidências da absorção de pequena quantidade de β-CD na sua forma intacta quando administrada oralmente. As CD modificadas possuem baixa absorção e sua maior parte é excretada nas fezes na forma intacta (IRIE e UEKAMA, 1997). Estudos de toxicidade demonstraram que as CD administradas por via oral são praticamente não tóxicas, devido a sua baixa absorção através do trato gastrointestinal. Doses de β-CD em ratos (654 ou 864 mg/Kg/dia para machos e.

(27) 26. fêmeas, respectivamente) e cachorros (1831 e 1967 mg/Kg/dia para machos e fêmeas, respectivamente) não apresentaram efeitos tóxicos, não sendo, portanto, verificado mortalidade em animais que receberam altas doses das CD naturais. Estudos de toxicidade com a hidroxipropil-beta-ciclodextrina (HP-β-CD) em humanos demonstrou que a CD modificada é toxicologicamente segura em doses diárias < 16 g, apresentando apenas diarreia quando em altas doses (BELLRINGER et al., 1995; GOULD e SCOTT, 2005; IRIE e UEKAMA, 1997). A estrutura espacial cônica e a orientação dos grupos hidroxílicos para o exterior conferem a estes oligossacarídeos cíclicos, propriedades físico-químicas únicas, sendo capazes de solubilizar-se em meio aquoso e, ao mesmo tempo, encapsular no interior da sua cavidade, moléculas hidrofóbicas (CUNHA FILHO e SÁ BARRETO, 2008). O termo complexo de inclusão “Einschlussverbindung” foi introduzido na literatura por Schlenk na década de 50 (SCHLENK et al., 1958). Em solução aquosa, a cavidade ligeiramente apolar da CD é ocupada por moléculas de água, o que é energeticamente desfavorecido (interação apolar-polar). Portanto, a molécula de água pode ser facilmente substituída por uma molécula hóspede apropriada de menor polaridade que a água. Uma molécula de ciclodextrina pode conter uma ou mais moléculas aprisionadas em seu interior, porém a relação mais frequentemente observada entre a CD e a molécula hóspede é de 1:1 (SZEJTLI, 1998). O complexo de inclusão formado promove uma alteração favorável de entalpia e redução da energia total do sistema, contribuindo para o aumento da estabilidade do complexo formado (LYRA et al., 2010). As ligações envolvidas na formação dos complexos de inclusão são interações eletrostáticas de Van der Waals, interações hidrofóbicas e ligações de hidrogênio (GÓRNAZ et al., 2009; SAJEESH et al., 2010). As mudanças nas propriedades físico-químicas dos fármacos dependem da solubilidade e da estabilidade do complexo formado (SZEJTLI, 1998; UEKAMA, HIRAYAMA e IRIE, 1998). Predominantemente, compostos hidrofóbicos possuem sua biodisponibilidade oral aumentada com o uso de CD. No entanto, fatores como constante de ligação, razão CD:fármaco, dose, possível influência da CD sobre a permeabilidade intestinal, etc., podem ser significativos na determinação da influência da CD sobre a biodisponibilidade dos fármacos (CARRIER, MILLER e AHMED, 2007)..

(28) 27. O método de solubilidade de fases, descrito em 1965 por Higushi e Connors é habitualmente utilizado como primeira verificação da formação de complexos de inclusão em solução. Este método fundamenta-se na monitorização das alterações de solubilidade do fármaco induzida pela adição de CD, permitindo obter a constante de estabilidade e a estequiometria de formação do complexo (CUNHA-FILHO e SÁBARRETO, 2007; LYRA et al., 2010). O fármaco é adicionado em excesso a várias soluções de CD de concentrações crescentes. As diferentes amostras são submetidas à agitação e, após ter sido alcançado o equilíbrio entre fármaco complexado e fármaco não complexado, as amostras são filtradas de modo a determinar a concentração do fármaco. Os diagramas de solubilidade de fases são dependentes do modelo de equilíbrio que se estabelece durante a formação dos complexos de inclusão. De acordo com o tipo de diagrama de solubilidade, os complexos podem ser classificados em tipo A, quando a solubilidade do substrato aumenta com o incremento da concentração de CD; e tipo B, quando há a formação de complexos de baixa solubilidade aquosa (Figura 3). O perfil A é subdividido em três tipos: AL, AP e AN. O perfil AL indica um aumento linear da solubilidade da molécula hóspede em função da concentração do agente solubilizante (CD); o perfil A P indica que a solubilização é mais efetiva em maiores concentrações de CD, ou seja, há um desvio positivo da linearidade da curva de solubilização; e por fim, o perfil AN indica um desvio negativo da linearidade, em que a solubilidade diminui quanto maior for a concentração de CD. Já o perfil tipo B é dividido em duas subclasses: B S, que é verificado quando a solubilidade máxima da molécula é alcançada com determinada concentração de CD, e esta adicionada em excesso forma complexos que precipitam; e o perfil BI, que é identificado quando há a formação de complexos insolúveis, que precipitam assim que são formados (BREWSTER e LOFTSSON, 2007; CUNHA-FILHO e SÁ-BARRETO, 2007)..

(29) 28. Figura 3 – Representação gráfica dos perfis de solubilidade A e B, com seus respectivos subtipos. Fonte: BREWSTER e LOFTSSON, 2007.. A estabilidade ou constante de equilíbrio (Kc) dos complexos pode ser estimada a partir da solubilidade intrínseca do substrato (So) e da inclinação da reta resultante do diagrama de solubilidade (1):. (1). Algumas modificações das ciclodextrinas naturais tem sido utilizadas com o intuito de proporcionar características específicas como hidrofobicidade, maior solubilidade, carga, especificidade e assim melhorar sua eficiência (BREWSTER e LOFTSSON, 2007; CEREDA, 2003; LOFTSSON e BREWSTER, 1996; UEKAMA, HIRAYAMA e IRIE, 1998). Estas modificações são realizadas basicamente, nos grupos hidroxilas primários e/ou secundários, através da ligação de diferentes grupos funcionais (GUEDES et al., 2008) (Tabela 1)..

(30) 29. Tabela 1 – Representação estrutural e propriedades físico-químicas de ciclodextrinas de interesse farmacêutico. Adaptado de BREWSTER e LOFTSSON, 2007.. Ciclodextrina. R. Número substituintes. a. Massa. Solubilidade. molar. aquosab. (Da). (mg/mL). α-ciclodextrina (αCD). −H. 0. 972. 145. β-ciclodextrina (βCD). −H. 0. 1135. 18,5. 2-hidroxipropil-β-. −CH2CHOHCH3. 0,65. 1400. >600. −(CH2)4SO3−Na+. 0,9. 2163. >500. −CH3. 1,8. 1312. >500. Maltosyl−. 0. 1459. >1500. γ-ciclodextrina (γCD). −H. 0. 1297. 232. 2-hidroxipropil-γ-. −CH2CHOHCH3. 0,6. 1576. >500. ciclodextrina (HPβCD) Sulfobutileter-βciclodextrina (SBEβCD) Randomilmetilada-βciclodextrina (RMβCD) 6-O-maltosil-βciclodextrina (G2βCD). ciclodextrina (HPγCD) a b. número médio de substituintes por unidade de repetição de glicose solubilidade em água pura a aproximadamente 25°C. A modificação do tipo de ciclodextrina geralmente leva a um aumento no custo da matéria prima. Assim, nos casos em que somente a complexação com CD não fornecem uma quantidade de fármaco solúvel adequada, o uso de complexos multicomponentes tem sido apresentado como uma interessante alternativa. Os.

(31) 30. complexos ternários são sistemas supramoleculares compostos por três entidades moleculares distintas, onde o terceiro componente pode ter várias origens e propostas (KURKOV e LOFTSSON, 2012). O terceiro componente utilizado, além do fármaco e da CD, envolve geralmente polímeros hidrofílicos ou aminoácidos (CIRRI et al., 2006; GUEDES et al., 2008; LOFTSSON et al., 1994; MURA, MAESTRELLI e CIRRI, 2003; MURA et al., 2005; SELVAM e GEETHA, 2008; SIGUROARDÓTTIR e LOFTSSON, 1995), e também outros compostos hidrofílicos como a trietanolamina (GRANERO e LONGHI, 2007; GRANERO et al., 2008; REDENTI, SZENTE e SZEJTLI, 2001). O efeito da 2-pirrolidona e de seus derivados sobre a solubilidade de diferentes fármacos é verificado na literatura (JAIN e YALKOWSKY, 2007; MIYAKO et al., 2010). Estes agentes de solubilização ainda não foram utilizados em combinação com CD, no entanto podem apresentar grande potencial como terceiros componentes.. 2.4 Terceiros componentes. 2.4.1 Polímeros hidrofílicos. Os polímeros hidrofílicos são classificados como uma classe de polímeros capaz de se dissolver e/ou intumescer na presença de água e/ou soluções aquosas, e são conhecidos por possuírem uma grande capacidade de absorverem água (até 1000 vezes o seu peso). São caracterizados por possuírem ramificações de grupos polares, como hidroxil, carboxil ou grupos amino (MIKKELSEN, 1994). Os polímeros hidrossolúveis tem sido amplamente utilizados em formulações farmacêuticas e são conhecidos por formarem complexos com pequenas moléculas, quando em solução aquosa, aumentando a solubilidade de fármacos pouco solúveis em água. É observado também que esses polímeros podem interagir com micelas e com CD, aumentando o poder solubilizante desses agentes, através do sinergismo entre suas ações (LOFTSSON, FRIDRIKSDÓTTIR e GUDMUNDSDÓTTIR, 1996). Loftsson e colaboradores (1994) apontaram algumas razões para a utilização de polímeros no aumento da eficiência de complexação das CD: apenas uma quantidade limitada de CD pode ser utilizada em certas formulações, como soluções isotônicas e comprimidos; e as CD são relativamente caras, onde o uso de.

(32) 31. polímeros pode diminuir o custo de produção. O uso de polímeros hidrofílicos como CMC, HPMC, PVP, PEG 4000 e PEG 6000, juntamente com CD, já está bem estabelecido na literatura (AMMAR et al., 2006; LIMA et al., 2011; LOFTSSON e FRIORIKSDÓTTIR, 1998; LOFTSSON et al., 2001; PALOMARES-ALONSO et al., 2010), no entanto o mecanismo envolvido ainda não está totalmente elucidado. De forma geral, os polímeros hidrofílicos podem aumentar a velocidade de dissolução de fármacos com baixa solubilidade aquosa através de três mecanismos distintos: (a) o fármaco pode se dispersar no interior da matriz polimérica, na forma amorfa; (b) o polímero pode levar a um aumento da interação entre as moléculas de água e de fármaco, ou (c) a dissolução dos polímeros pode levar a um aumento na solubilização do fármaco em meio aquoso devido a formação de complexos fármaco-polímero ou devido um efeito cossolvente destes polímeros. Assim, a elucidação do mecanismo envolvido é muito importante para prever a contribuição dos polímeros hidrofílicos no incremento da solubilidade do fármaco em dispersões sólidas ou em sistemas de complexos multicomponentes com CD.. 2.4.2 Trietanolamina. A trietanolamina (TEA) é classificada como uma alcanolamina, geralmente utilizada em indústrias farmacêuticas, cosméticas e de produtos de higiene, devido a sua ação neutralizante (INOUE et al., 1982; SPERANZA et al., 2006). Além de agente alcalinizanate, também é conhedida como agente emulsificante, sendo amplamente utilizada na produção de tensoativos, emulsificantes e solventes. A TEA é largamente encontrada em formulações tópicas, principalmente em emulsões (KONISH et al, 1992; ROWE, SHESKEY e OWEN, 2004). Este agente é um líquido límpido, viscoso, de coloração incolor a amarelo pálido, com ligeiro ordo amoniacal, muito higroscópico e solúvel em água. Possui ponto de fusão de 20 a 21 °C e ponto de ebulição em torno de 335 ° C (ROWE, SHESKEY e OWEN, 2004). Foi verificado em estudos anteriores que a TEA não possui efeito genotóxico em células procariontes e eucariontes (INOUE et al., 1982), nem efeito tóxico e carcinogênico em camundongos (KONISH et al, 1992; STOTT et al., 2000). Em ratos Wistar a TEA possui baixa toxicidade sistêmica e pouca irritação ao trato respiratório (GAMMER et al., 2008). Estima-se que a dose letal humana da TEA seja em torno de 5-15 g/Kg de peso corporal (ROWE, SHESKEY E OWEN, 2004)..

(33) 32. Devido às suas propriedades físico-químicas e sua baixa toxicidade, a TEA vem sendo utilizada com sucesso em associação com CD para aumentar a solubilidade de fármacos pouco solúveis em água, como o ácido ascórbico, acetazolamida, diclofenaco. a. sulfisoxazolona. (GARNERO. e. LONGHI,. 2010;. GRANERO,. GARNERO e LONGHI, 2003; MORA, LONGHI e GRANERO, 2010; PALMAS et al., 2009).. 2.4.3 Metil-1-pirrolidona-2. A metil-1-pirrolidona-2, também conhecida como N-metil pirrolidona (NMP), é um líquido orgânico, incolor, biodegradável, solúvel em água, etanol e outros solventes orgânicos. Possui propriedades solubilizantes e ponto de fusão e ebulição de 25,5 °C e 245 °C, respectivamente. A NMP pode ser utilizada com segurança como agente solubilizante ou solvente em formulações farmacêuticas humanas, em aplicações parenterais, orais e tópicas, pois embora possua um grupo amida potencialmente hidrolisável, amidas são consideradas resistentes em pH entre 1 e 8 e requerem aquecimento prolongado em ácidos ou bases fortes para que ocorra a hidrólise (JAIN e YALKOWSKY, 2007; ROWE, SHESKEY e OWEN, 2004). Jouyban, Panahi-Azar e Khonsari (2011) demonstraram o poder solubilizante da NMP ao estudar a solubilidade do ácido salicílico em diferentes solventes. Eles observaram que a solubilidade máxima do ácido salicílico foi conseguida na presença da NMP. Em um estudo realizado por Miyako e colaboradores (2010) também foi verificado o poder de cossolvência da NMP frente à solubilização de diferentes fármacos. Quanto à segurança da NMP, em estudo realizado com ratas grávidas não foi verificado efeito teratogênico e embrioletal após os animais serem expostos a vapores deste solvente nas doses de 30 e 60 ppm (SAILLENFAIT, GALLISSOT e MOREL, 2003). Outro estudo demonstrou que a dose única de 3800 mg de NMP/Kg de peso corporal, não induziu aberrações cromossômicas em ratos (ENGELHARDT e FLEIG, 1993). Porém, Saillenfait e colaboradores (2002), e Flick e colaboradores (2009) verificaram o desenvolvimento de toxicidade em ratas grávidas e nos embriões, após administração oral de NMP na dose de 250 e 125 mg/kg/dia, respectivamente, e utilizando sistemas in vitro. No entanto, o potencial da NMP em induzir doenças das vias aéreas e outros efeitos sistêmicos em humanos não está claro (CARNERUP, SPANNE e JONSSON, 2006)..

(34) 33. 2.5 Cossolvência e complexação. Diversos mecanismos podem estar presentes na solubilização de fármacos de baixa solubilidade aquosa por estes compostos líquidos (TEA e NMP). A cossolvência e a complexação estão geralmente envolvidos (JAIN e YALKOWSKY, 2007; MILLARD, ALVAREZ-NÚÑEZ e YALKOWSKY, 2002). A adição de um cossolvente reduz a polaridade da água, enfraquecendo a rede de ligações de hidrogênio intermoleculares, o que resulta em uma maior solubilidade aquosa de fármacos pouco solúveis em água (RAM et al, 2001; SANGHVI et al., 2008). Por outro lado, complexação é a associação estequiométrica não covalente entre duas ou mais moléculas, levando a formação de uma entidade distinta estruturalmente. A complexação diminui a exposição das partes hidrofóbicas do fármaco na água, resultando na sua maior solubilidade (JAIN e YALKOWSKY, 2007; SANGHVI et al., 2008). Em um estudo realizado por Sanghvi (2006), foi proposto um modelo em que o solubilizante poderia ter propriedades tanto cossolvente como complexante de forma independente. Desta forma, a solubilidade total do soluto é definida como: ,. onde. Scossolvência. e. Scomplexação. são. a. contribuição do agente solubilizante na solubilidade total, pelos mecanismos de cossolvência e complexação, respectivamente; e Sw é a solubilidade do soluto na água (solubilidade intrínseca). De acordo com o modelo log-linear (LI e YALKOWSKY, 1994; YALKOWSKY e RUBINO, 1985), Smix é a soma da solubilidade intrínseca e da solubilidade devido à cossolvência, expressa pela seguinte equação:. (2) onde σ é o poder solubilizante do cossolvente para o sistema cossolvente-soluto; e f é a fração de volume do cossolvente no meio aquoso. O valor de Scossolvência pode então ser expresso como:. (3) ou (4).

(35) 34. De acordo com este modelo é possível estimar a contribuição, de cossolvência e/ou complexação, do agente solubilizante na solubilidade do soluto. Após determinar este mecanismo e entender a dinâmica de associação destas substâncias,. assim. como. com. os. complexos. binários,. estes. complexos. multicomponentes podem ser obtidos em fase sólida levando a obtenção de um novo insumo.. 2.6 Spray drying. Os métodos de preparação de complexos de inclusão em fase sólida contendo CD incluem malaxagem, trituração, liofilização, evaporação, coprecipitação e mistura física (FREITAS et al, 2012; LIN e KAO, 1989; NAIDU et al., 2004; RUZ et al., 2012). No entanto, alguns destes procedimentos são demorados e requerem múltiplos processamentos, incluindo reações iniciais, recristalização, filtração e secagem. Além disso, alguns métodos de preparação necessitam de solventes orgânicos como meio de dissolução, e o solvente orgânico residual presente nos complexos dificilmente pode ser removido por completo do produto (LIN e KAO, 1989). A técnica de secagem por aspersão ou atomização spray drying oferece versatilidade diante de outros meios de obtenção de complexos de inclusão. A secagem por atomização é a única operação capaz de transformar diretamente soluções ou suspensões em um produto sólido. Esta técnica oferece a vantagem de conter uma única etapa, reduzindo, desta forma, tempo e custo, bem como favorece um melhor controle do processo (LIN e KAO, 1989; PAUDEL et al, 2012; RATTES e OLIVEIRA, 2007). Além disso, várias propriedades das partículas, como tamanho, densidade aparente e propriedades de fluxo podem ser facilmente ajustadas através da manipulação dos parâmetros do processo ou configuração do aparelho spray dryer. O processo de secagem ocorre da seguinte forma: (a) atomização da matériaprima líquida em um pulverizador de gotas finas; (b) a matéria-prima é colocada em contato com o ar de secagem quente à temperatura suficiente para evaporação da umidade; (c) formação do produto sólido; e (d) separação do produto seco do ar de secagem (CAL e SOLLOHUB, 2010; LEE et al., 2011; OLIVEIRA et al., 2012;.

(36) 35. PATEL, PATEL e SUTHAR, 2010; PAUDEL et al, 2012; SILVA-JÚNIOR et al., 2008, 2009). Diversos estudos com CD utilizam a secagem por aspersão como técnica para a obtenção dos complexos de inclusão, como por exemplo a formação do complexo de inclusão diazepam:β-CD (BOOTSMA et al., 1989), indometacina:HP-βCD (LIN et al., 1991) e carbamazepina:β-CD (KOESTER et al., 2003).. 2.7 Métodos utilizados para avaliar as interações entre os componentes nos complexos de inclusão. Qualquer metodologia que tenha sensibilidade suficiente para medir as diferenças entre as propriedades físico-químicas dos componentes isolados (CD e fármaco) e as propriedades apresentadas pelo complexo de inclusão, pode ser utilizada. para. caracterizar. esses. complexos,. em. diferentes. ângulos.. A. caracterização de complexos de inclusão em solução é geralmente realizada através de espectroscopia de absorção UV-VIS, técnicas de fluorescência, Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE), espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (RMN) e modelagem molecular. Enquanto que para a caracterização de complexos em fase sólida utiliza-se, na maioria das vezes, técnicas de Difração de Raios-X (DRX), estudos térmicos, como Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC) e Termogravimetria (TG), Espectroscopia de Infravermelho com Transformada de Fourier (FTIR), Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) e estudos de dissolução (CARRIER, MILLER e AHMED, 2007; LYRA et al., 2010; SINGH et al., 2010). Além destas técnicas clássicas, recentemente outras técnicas, como espectroscopia de Raman, eletroforese capilar, potenciometria, calorimetria de titulação isotérmica, dicroísmo circular, entre outras, também vem sendo utilizadas (SINGH et al., 2010; VENTURINE et al., 2008). Diante do que foi exposto, o presente trabalho propõe a investigação sistemática de componentes que proporcionem uma melhor solubilização aquosa do BNZ, assim como a obtenção e caracterização de complexos multicomponentes contendo BNZ e CD..

(37) 36. 3 OBJETIVOS. 3.1 Objetivo Geral. Avaliar as interações do benznidazol com ciclodextrinas na presença de trietanolamina,. metil-1-pirrolidona-2. e. polímeros. hidrofílicos,. como. terceiro. componente, para a obtenção de complexos ternários visando melhorar a solubilidade/velocidade de dissolução do fármaco.. 3.2 Objetivos Específicos . Formação de complexo molecular contendo benznidazol e beta-. ciclodextrina, e benznidazol e hidroxipropil-beta-ciclodextrina através do estudo de solubilidade de fases, com e sem os polímeros hidrofílicos (polietilenoglicóis 1500, 4000 e 10000, álcool polivinílico, polivinilpirrolidona, hidroxipropilmetilcelulose e Pluronic F127®), trietanolamina, metil-1-pirrolidona-2 e soluções ácida e alcalina; . Determinação da estequiometria e da constante de equilíbrio (Kc) dos. complexos formados; . Analisar a solubilidade aquosa do benznidazol na presença de. trietanolamina, metil-1-pirrolidona-2 e polímeros hidrofílicos através do estudo de solubilidade de fases; . Analisar a ação da trietanolamina e metil-1-pirrolidona-2 sobre a. solubilidade aquosa do benznidazol através do estudo do modelo log linear; . Obtenção dos complexos de inclusão contendo benznidazol e beta-. ciclodextrina,. e. benznidazil. e. hidroxipropil-beta-ciclodextrina. associados. à. trietanolamina, metil-1-pirrolidona-2 e polímeros hidrofílicos, em fase sólida, utilizando a técnica de secagem por atomização spray drying; . Desenvolvimento e validação da metodologia analítica utilizada para. determinação analítica do benznidazol;  sólida;. Análise quantitativa do fármaco nos complexos de inclusão em fase.

(38) 37. . Estudo de modelagem molecular dos complexos entre benznidazol e. beta-ciclodextrina, com e sem a trietanolamina e metil-1-pirrolidona-2; . Estudo de Ressonância Magnética Nuclear de prótons (RMN H1) do. benznidazol, beta-ciclodextrina e trietanolamina, nas suas formas livres e complexadas; . Verificação da liberação do fármaco através do estudo de dissolução in. vitro dos sistemas obtidos; . Avaliar as interações dos componentes nos sistemas obtidos em fase sólida por:.  Microscopia eletrônica de varredura (MEV);  Espectroscopia na região do infravermelho (Espectroscopia IV);  Difratometria de raios-X (DRX)..

(39) 38. 4 JUSTIFICATIVA. Devido à baixa solubilidade aquosa do benznidazol, o que limita o sucesso de comprimidos, e à ausência de formas farmacêuticas líquidas para a administração deste fármaco, o Ministério da Saúde do Brasil vem estimulando a pesquisa e desenvolvimento destas formas líquidas de administração para alguns fármacos utilizados no tratamento de doenças negligenciadas (Edital MCT/CNPq/CTSaúde/MS/ SCTIE/DECIT Nº 034/2008), entre eles o benznidazol. O presente estudo foi realizado com o objetivo de obter e caracterizar complexos multicomponentes em fase sólida para o aumento da solubilidade e/ou velocidade de dissolução do benznidazol. A preparação e caracterização dos novos insumos permitirão estudos futuros como estratégia para o aumento da eficiência terapêutica do benznidazol e a obtenção de um insumo farmacêutico de solubilidade modificada, que possibilite futuramente a obtenção de uma formulação em pó para pronta dissolução/dispersão e administração oral na forma líquida..