A piscicultura representa uma modalidade de cultivo de elevada produtividade, baixo custo de implemento e manutenção. O crescimento da aquicultura continental, em especial no cultivo da tilápia, vem mostrando sua capacidade de expandir e gerar renda, tornando a tilápia uma das espécies mais cultivadas do Brasil (Associação Brasileira de Piscicultura, 2019). No entanto, os resíduos desta atividade podem atuar como limitantes, visto que o material biológico remanescente pode acarretar no aceleramento de processos de nitrificação e eutrofização (Ostrensk et al., 2007).
Na tilapicultura, o animal é eviscerado pelos pescadores no momento da despesca dos viveiros e as vísceras não são utilizadas para comercialização. Portanto, esta pesquisa sugere uma forma de aproveitamento desse descarte como fonte de glicosaminoglicanos, em especial, do condroitim sulfato.
O procedimento de extração de GAGs aplicado nesse estudo assemelha-se aos que foram empregados anteriormente para obtenção de compostos com potencial farmacológico em diferentes invertebrados e espécies marinhas, inclusive por outros membros do nosso grupo de pesquisa, como o camarão e o caranguejo (Dietrich et al. 1999; Chavante et al. 2000; Medeiros et al. 2000; Brito et al. 2008; Andrade et al. 2013; Cavalcante et al. 2018; Palhares, et al. 2019; Almeida, et al. 2020).
O perfil eletroforético da fração eluída com 3,0M de sal após a complexação (F:3,0M) mostra que diferentes glicosaminoglicanos podem ser adquiridos com esse processo, e que dessa forma, futuros estudos podem utilizar outras frações e outros tipos de glicosaminoglicanos adquiridos no processo de extração e purificação, que não foram usadas nessa pesquisa.
A quantidade total de GAGs obtidos na F:3,0M (814mg) também está de acordo com extrações anteriores, tendo em vista que dentro de toda a massa seca de tilápia (aproximadamente 1kg) a maior parte não corresponde à glicosaminoglicanos, ao exemplo das proteínas, que não são de interesse para essa pesquisa e são eliminadas através de processos como a proteólise. (Dietrich et al. 1999; Andrade et al., 2013). Além disso, métodos de obtenção de GAGs que se assemelham ao do nosso estudo, usando mucosas de origem bovina e suína, são amplamente usados para obtenção de heparina, anticoagulante comercializado por várias indústrias farmacêuticas (Linhardt, 2003).
Durante os processos de purificação é comum observar uma redução nas quantidades de massa das amostras. Essas perdas ocorrem em decorrência do maior grau de pureza
53 adquirido pelo composto à medida em que as etapas vão avançando, eliminando dessa forma, diversas outras moléculas que no momento não são de interesse, nesse caso, o que não é um CS (Nogueira et al. 2018).
O maior grau de pureza obtido através da metodologia empregada pode ser observado pelas porcentagens remanescentes de cada fração obtida, onde a F:0,8VA-0,8M corresponde a 0,007% da massa seca empregada inicialmente. Esses valores estão de acordo com outras extrações prévias de condroitim sulfato e pode acelerar a busca pelas vísceras da Oreochromis
niloticus, considerando que uma maior quantidade de resíduos será necessária para produzir
mais CS-Atilapia (Pinto, 2015).
Além disso, como o Brasil é responsável pela produção de 400 mil toneladas anuais de tilápia, é possível que sejam eliminadas aproximadamente 40 mil toneladas anuais de vísceras (Zein et al. 1985; Associação Brasileira de Piscicultura, 2019). Desta forma, o uso consciente e sustentável de toda essa massa de resíduos para produção de condroitim sulfato pode diminuir o impacto ambiental de vários ecossistemas, auxiliando no crescimento desta indústria (Amirkolaie, 2011).
A eletroforese obtida ao final de todo o processo de purificação (Figura 8) permite observar um composto com padrão de migração semelhante ao do CS, assim como foi observado por outros pesquisadores do grupo (Souza-Junior, 2010; Pinto, 2015). Isso indica que o método de extração de GAGS utilizado nesse estudo pode ser reproduzido com eficiência, garantindo um rendimento satisfatório para a futura produção desses compostos em larga escala.
A estrutura do CS é diferenciada por sua sulfatação. No entanto, dissacarídeos com números e posições de grupos sulfatos variáveis podem ser localizados em diferentes porcentagens dentro da cadeia polissacarídica, isso resulta na heterogeneidade responsável pela variedade e especificidade das funções que desempenha (Sugahara, 2003; Volpi, 2006; Volpi, 2009; Cavalcante et al. 2018; Palhares et al. 2019; Palhares et al. 2020). Como resultado da análise da composição dissacarídica do CS da tilápia, foi possível observar que cerca de 60% dos dissacarídeos contém resíduos de galactosamina sulfatadas na posição 4, que por sua vez, tem sido relatado como o tipo de condroitim como maior atividade antioxidante (Bobula et al., 2017; Zhu et. al. 2018).
Esse perfil dissacarídico fortalece nosso argumento sobre a purificação de um composto tipo condroitim sulfato, além de permitir a observação de uma semelhança com o padrão dissacarídico do condroitim extraído da traquéia bovina (CS-Abovino), como mostrado
na Tabela 5, que está entre os CS mais comercializados atualmente, sugerindo alto grau de semelhança entre esses 2 compostos (Zhu et. al. 2018).
Tabela 5: Perfil dissacarídico e massa molecular do Condroitim sulfato. CS-Atilapia: Condroitim sulfato de tilápia;
CS-Abovino: Condroitim sulfato bovino; ΔDi4S: Dissacarídeo sulfatado na posição 4 da galactosamina; ΔDi6S:
Dissacarídeo sulfatado na posição 6 da galactosamina; Δi0S: Dissacarídeo sem sulfatação
Além disso, é possível observar diferenças moleculares entre o perfil do CS extraído das vísceras da tilápia e outros CS, como o extraído da cartilagem de tubarão, composto de 49% de ΔDi6S, 30% de ΔDi4S, 2% de ΔDi0S e ainda 19% de dissacarídeo sulfatado nas posiçãoes 2 e 6 da galactosamina (ΔDi2,6S). Isto reflete as diferenças estruturais entre os diversos tipos de condroitim encontrados na natureza, e mostra o quanto organismos de maior proximidade evolutiva podem ter perfis dissacarídicos totalmente diferentes, ao exemplo da tilápia e do tubarão, que pertencem à superclasse peixe (Zhu et al. 2018).
É interessante destacar também que na Figura 9 é possível observar alguns picos menores entre o ΔDi0S e o ΔDi6S, esses picos provavelmente pertencem a dissacarídeos sulfatados em outras posições, além do carbono não sulfatado e carbonos sulfatados na posição 4 e 6 da galactosamina, porém eles encontram-se em quantidades muito pequenas, tendo, dessa forma, um impacto baixo na degradação e caraterização estrutural do CS-Atilapia.
Atualmente, o CS vem sendo usado no tratamento da osteoartrite devido seu potencial anti-inflamatório, antiapoptótico e antioxidante, isso levou vários pesquisadores a avaliar o potencial farmacológico e efeito citotóxico de outras fontes de CS (Volpi, 2006; Monfort et al., 2008; Pinto, 2015). Dessa forma, o CS-Atilapia, teve seu efeito citotóxico testado em cultura de células RAW 264.7, onde foi possível observar um aumento da citotoxicidade nas concentrações testadas acima de 400 µg/mL. Esses dados estão de acordo com a maioria dos CS descritos na literatura, não exibindo toxicidade nas concentrações de 20, 40, 100 e 200µg/mL (Bobula et al., 2017; Wu et al. 2018; Gao et al. 2019) porém com a observação de que o CS-Atilapia é considerado mais citotóxico nas concentrações de 400 e 1000µg/mL do que outros tipos de CS que não mostraram redução da viabilidade das células nessas concentrações (Bobula et al., 2017; Wu et al. 2018).
55 Esses valores são, porém, importantes para definir a dose adequada para futuros estudos e testes usando o CS-Atilapia,que receberão prioridades para as doses de 20, 40, 100 e 200µg/mL, que indicaram um potencial uso seguro.
A literatura descreve alguns mecanismos pelos quais uma molécula pode inibir a quantidade de ROS em um sistema, o mais comum deles é pela inibição direta das espécies reativas de oxigênio, como são os casos do peróxido de hidrogênio, do radical hidroxila e do radical superóxido, porém uma molécula também pode atuar inibindo metais que participam das reações de Harber-Weiss e Fentom, ou agir aumentando ou diminuindo a atividade de enzimas como a óxido nítrico sintase, catalase e a heme-oxigenase-1 (Cañas et al. 2007; Ju et al. 2017; Zhu et al. 2018).
A inibição de espécies reativas por condroitim sulfato descrita na literatura revela mais de um mecanismo de ação, quando aplicado em culturas de células, podendo atuar diretamente sobre os produtos e precursores da reação de Haber-Weiss ou estimular vias antioxidantes alternativas, que resultam na redução dessas moléculas intracelularmente (Ju et al. 2017, Zhu et al. 2018; Gao et al., 2019; Hu et al. 2019).
Para elucidar cada uma dessas vias, inicialmente foi feita a quantificação de espécies reativas de oxigênio (ROS) intracelulares, usando a mesma cultura de células do teste de citotoxicidade (RAW 264.7) e as concentrações que não apresentaram qualquer efeito tóxico.
A verificação da capacidade total do CS-Atilapia de inibir as ROS em meio celular foi inicialmente feita pelo DCFH-DA, também em cultura de RAW 264.7. Este experimento mostrou a capacidade de inibir até 52% das ROS na concentração de 40µg/mL, esse efeito é maior que de algumas moléculas não CS descritas na literatura, como exemplo de um grupo de cetonas aromáticas chamadas calconas, que foram capazes de reduzir a quantidade de ROS em 50% na cultura de células RAW 264.7, utilizando 280µg/mL destas, ou do extrato de polissacarídeos da estirpe amarela do cogumelo Jinhua (Flammulina velutipes), que foi capaz de reduzir os níveis de ROS em 53% na concentração de 500µg/mL (Bist et al. 2017; Hu et al. 2019).
Outros tipos de CS também tiveram sua capacidade de inibir ROS mensuradas, como exemplo das nanoparticula de selênio com base em CS de cartilagem de tubarão, que reduziu os níveis de ROS no sistema em 53% na concentração de 50µg/mL, ou do CS de mucosa suína que foi capaz de reduzir em 18% a quantidade de ROS do sistema, com 400µg/mL, ambos em cultura de célula de neuroblastoma humano (SH-SY5Y) (Ju et al. 2017; Gao, 2019).
Esse resultado é considerado de grande importância, pois o CS-Atilapia foi capaz de alcançar atividades semelhantes ou melhores às inibições de ROS intracelulares já descritas na literatura, ao exemplo das que foram apresentadas acima, porém numa concentração muito mais baixa (40µg/mL), que não demonstrou qualquer toxicidade para as células e que usa como fonte de extração uma materia prima residual. Todas essas informações refletem a capacidade do CS-Atilapia em inibir as ROS mesmo em baixas concentrações e um melhor potencial farmacológico desta molécula.
Para investigar como ocorre o efeito do CS-Atilapia sobre as espécies reativas de oxigênio, foram avaliados separadamente o sequestro de radicais superóxido e hidroxila, bem como o efeito sobre metais como íons ferroso e cúprico, que são integrantes de processos biológicos nos quais o CS está envolvido (Ferreira et al. 1997).
Com relação aos radicais hidroxila e superóxido, o CS-Atilapia foi capaz de reduzir a quantidade destas moléculas, in vitro, em 21% e 30%, respectivamente, na concentração de 100µg/mL. Estes valores são mais altos que o de alguns CS descritos na literatura, como o caso do CS extraído da Raja porosa, que foi capaz de reduzir aproximadamente 10% destes radicais, na concentração de 500µg/mL (Zhou et al. 2020). A ação do CS-Atilapia em inibir esses radicais foi bem mais baixa quando comparada com CS de outras fontes animais que usaram concentrações mais altas, como aquele extraído de salamandra (Andrias davidianus) e traquea bovina, que reduziram a quantidade de radical hidroxila e superóxido em aproximadamente 70%, na concentração de 2mg/mL. Por outro lado, nas concentrações mais baixas (20 a 500µg/mL) a capacidade dos CS de outras fontes de sequestrar radicais assemelhou-se ao do CS-Atilapia com aproximadamente 25% de eficiência (Ajusaka et al. 2016; Zhu et al. 2018).
Os resultados obtidos em ambos os testes sugerem que o CS-Atilapia foi capaz de inibir os radicais hidroxila e superóxido nas concentrações de 100 e 200µg/mL, embora estas concentrações estejam mais baixas que a maioria dos outros estudos descritos anteriormente (Ajusaka et al. 2016; Zhu et al. 2018, Zhou et al. 2020). Entretando é importante destacar que em nenhum desses trabalhos foi apresentado resultado sobre a citotoxicidade dos CS testados.
Estes testes demonstram também a capacidade do CS-Atilapia em doar prótons de suas hidroxilas para estabilizar esses radicais livres, atuando diretamente sobre elas. Estes valores foram mais altos na inibição do radical aniônico superóxido, provavelmente resultante da curta meia vida do radical hidroxila. O fato de o CS-Atilapia demonstrar maior capacidade que o CS-Abovino em reduzir diretamente essas espécies reativas pode, pelo menos em parte explicar a maior atividade inibitória de ROS intracelular que foi observada.
57 Com o intuito de confirmar os efeitos da inibição dos radicais livres, foi feito o teste de inibição da peroxidação lipídica in vitro, pois o radical superóxido e principalmente o hidroxila são conhecidos por causar danos em lipídios, especialmente os de membrana (Ajisaka, et al. 2016; Zou et al. 2016). Nessa situação, o CS-Atilapia na sua maior concentração (200µg/mL) conseguiu inibir 14% da peroxidação lipídica e não apresentou diferença estatística nas concentrações menores. Esse resultado sugere que o efeito do CS-Atilapia na inibição da peroxidação lipídica, in vitro, depende de uma dose mais alta do que as usadas nos testes anteriores, contudo, como as concentrações mais baixas expressaram um efeito reduzido na inibição da peroxidação lipídica, torna-se possível pensar que esse mecanismo influencia pouco na inibição de ROS total, observada na concentração de 40µg/mL no teste de DCFH-DA (Campo etl.al. 2008). Curiosamente, nesse experimento não foi detectada diferença estatística entre o CS-Atilapia e CS-Abovino, provavelmente devido a suas semelhanças estruturais.
A partir destes dados, o próximo passo foi investigar a ação do CS-Atilapia nas reações que geram espécies reativas de oxigênio como as reações de Haber-Weiss. Estes experimentos foram feitos através da quelação dos íons ferroso e cúprico in vitro, tendo em vista que esses metais podem atuar gerando novos radicais livres, principalmente radicais hidroxilas e superóxido. Nessa situação, o CS-Atilapia foi capaz de reduzir em 34% a quantidade de íons ferrosos e 4% dos níveis de cobre, na concentração de 200µg/mL, efeitos menores que do CS- Abovino, que reduziu 43 e 18%, respectivamente e de outras moléculas, como o CS extraído de
Lapemis curtus, que foi capaz de inibir em 40% a quantidade de íons ferrosso na concentração
de 2mg/mL (Bai et al. 2018). Negreiros e colaboradores (2015) também mostraram que 2mg/mL de polissacarídeos sulfatos de algas podem quelar 60% das quantidades de íon ferroso e que 0,5mg/mL podem quelar 67% dos íons de cobre com 0,5mg/mL, resultados bem mais altos que os detectados no CS-Atilapia.
Com a observação destes dados é possível perceber que o CS-Atilapia possui a capacidade de interagir com a reação de Harber-Weiss e Fentom, por diminuir a disponibilidade dos componentes desta, em especial com os íons de ferro, que é o principal componente metálico da maioria das estruturas dos organismos biológicos, mesmo em concentrações baixas, inibindo a formação de espécies reativas. Porém esses resultados sugerem, assim como a interação direta com as espécies reativas, que a atividade do CS-Atilapia em reduzir ROS com concentrações muito baixas ainda não está completamente explicada, ao exemplo do próprio CS-Abovino que mesmo quelando maior quantidade de metais não conseguiu inibir a mesma quantidade de ROS intracelulares que o CS-Atilapia.
Todas essas observações levam a pensar que o CS-Atilapia tem um bom potencial antioxidante quando aplicado em sistemas biológicos e que esta capacidade tem relação com mais de uma via. O CS-Atilapia é capaz de atuar no sequestro direto de espécies reativas e na inibição da reação de Haber-Weiss, porém com o envolvimento de outros mecanismos além dos citados.
Um provável outro mecanismo de atuação do CS-Atilapia para explicar esse resultado é o sequestro das moléculas de peróxido de hidrogênio, no meio biológico, podendo ou não atuar também sobre enzimas como a catalase ou a superóxido dismutase (SOD), esta última já teve sua relação com o CS demonstrada em alguns estudos, como o descrito por Campos e colaboradores (2008) onde o CS conseguiu aumentar a conversão de radical superóxido em peróxido de hidrogênio e O2, através desta enzima.
Outra provável via de atuação do condroitim da tilápia é a ativação da hemeoxigenase- 1 (Cañas et al. 2007; Egea et al. 2010). Onde a ativação de proteínas C reativas geram cascatas de sinalizações que aumentam a síntese de proteínas antioxidantes HO-1, resultando em uma drástica redução nos níveis de ROS intracelulares. Esse mecanismo é bastante relatado em quadros de doenças neurodegenerativas, como o Parkinson e o Alzheimer.
Contudo o mecanismo pelo qual o CS-Atilapia atua para causar seu efeito antioxidante ainda não está completamente claro, sendo necessários outros estudos como a inibição direta do H2O2 e testes com outras culturas de células que possam averiguar a relação do CS com a HO-1 e a SOD.
É interessante destacar que o CS purificado de vísceras de tilápia pode desempenhar efeitos farmacológicos tão altos ou até melhores que outras moléculas que são descritas na literatura, como os descritos anteriormente, inclusive utilizando concentrações mais baixas (Bobula et al. 2017; Zhu et al. 2018; Bai et al. 2018).
Esse estudo também revela um aspecto inovador, uma vez que o aproveitamento das vísceras da tilápia como uma fonte para a extração de moléculas tipo CS, com potencialidades farmacológicas, abre uma nova perspectiva capaz de minimizar o impacto ambiental gerado pelos rejeitos descartados pela tilapicultura, garantindo assim a sustentabilidade dessa atividade econômica.
Estes dados podem contribuir com os estudos de glicosaminoglicanos, em especial com o condroitim sulfato, demonstrando os potenciais farmacêuticos deste grupo de moléculas, além de auxiliar nas pesquisas com antioxidantes, ajudando a esclarecer como diversas moléculas conseguem interar com radicais livres em vários sistemas biológicos.
59 Por fim, a melhor concentração sugerida para uso do CS-Atilapia foi a de 100µg/mL, isto leva em consideração a baixa citotoxicidade encontrada nesta proporção, além dos seus efeitos demonstrados, tanto em inibir ROS intracelularmente, quando na quelação de metais e espécies reativas in vitro.
6 CONCLUSÃO
Os resultados apresentados sugerem que o Condroitim sulfato extraído das vísceras da tilápia pode ser caracterizado como um condroitim-4-sulfato e que este possui atividade em mais de um mecanismo antioxidante, atuando tanto sob a quelação direta de radicais livres e íon metálicos quanto com vias de sinalização intracelulares que geram proteínas antioxidantes. A consequência desses mecanismos é a redução de níveis intracelulares de espécies reativas de oxigênio em baixas concentrações que pode vir a ser estudado como tratamento em diversas patologias degenerativas.
Por fim, também é possível falar que as vísceras da tilápia tem potencial de uso como fonte alternativa na extração de Glicosaminoglicanos como condroitim sulfato, auxiliando o desenvolvimento sustentável dessa atividade econômica presente em vários países do mundo.
Esta pesquisa abre portas para novos estudos, em especial no que se refere a elucidação das vias antioxidantes de participação do CS-Atilapia, visto que isso pode levar esta molécula a se tornar um potente candidado terapêutico.
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