3.8.1 Redução do estresse oxidativo intracelular
Para medir a geração e inibição de espécies reativas de oxigênio (ROS) intracelular em cultura de células RAW 264,7, foi realizado o ensaio com 2,7-diclorofluoresceína diacetato (DCFH-DA), específico para esse tipo de molécula, como citado por Gao (2019). Nesse experimento as células cultivadas em meio DMEM foram incubadas com LPS (2µg/mL) por 18 horas a 37ºC, em seguida o meio foi aspirado e ocorreu a adição das amostras nas concentrações de 20, 40, 100 e 200µg/mL, mantendo-se por 4 horas a 37ºC, seguindo o mesmo protocolo. Por fim os poços foram lavados com PBS e incubados com o composto DCFH-DA por uma hora, com redução de luz.
De acordo com a quantidade de ROS presentes no meio, a reação dará origem a uma maior quantidade de fluorescência, que pode ser detectado por um leitor de fluorescência no comprimento de onda azul (485nm a 535nm). Por fim, a seguinte fórmula é aplicada para determinação da porcentagem de inibição de espécies reativas:
Quantidade de ROS (%) = [(Ab2 – Ab1)/Ab1] x100
Onde Ab1 é a absorbância do controle tratado apenas com LPS e Ab2 é a absorbância das células expostas ao LPS e tratadas com compostos.
Para este experimento, as células tratadas com CS foram comparadas com um controle negativo (CN) que refere as células que não foram tratadas com LPS nem CS, não recebendo um aumento da quantidade de radicais oxidantes, e um controle-LPS, onde as células tinham os níveis de espécies reativas aumentados, porém não foram tratadas com nenhuma concentração de CS. Além disso, nesse teste e em todos os outros ensaios antioxidantes, o CS adquirido da tilápia foi também comparado com o CS de origem bovina (CS-Abovino).
37 Para verificar o tipo de espécies reativas de oxigênio que o CS é capaz de reduzir, foram feitos os testes de redução dos radicais aniônico superóxido e hidroxila.
Nesse caso, a atividade de quelação do radical hidroxil foi mensurada de acordo com o método reportado por Smirnoff (1985), com algumas modificações. Nesse caso, os poços da placa receberam adição de 50µL de sulfato ferroso 9mM (FeSO4), 50µL dos CS (nas concentrações de 20 a 200µg/mL) e 50µL de peróxido de hidrogênio 8,8mM. Para finalizar a reação, houve o acréscimo de 50µL de ácido salicílico-etanol 9mM, que permitiu que a reação fosse lida em espectrofotometria, sob absorbância de 510nm. Nesta situação, o ácido ascórbico foi usado como controle positivo e uma triplicata de poços sem a adição de CS foram utilizadas como controle negativo. A fórmula utilizada para calcular a inibição do radical hidroxila foi:
Sequestro Hidroxila (%) = [AbB-(Ab2-Ab0)]/AbB x100
Onde Ab0 é a Absorbância do controle negativo, Ab2 é a absorbância da amostra e AbB é a absorbância do Branco.
3.8.3 Sequestro do radical aniônico superóxido
Para realização do teste de sequestro de radical superóxido foi seguido o protocolo descrito por Nishikimi e colaboradores (1972), que leva em consideração a redução do tetrazólio nitroazul (NBT).
Nesse caso, a mistura da reação foi feita contendo 156µM de Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo, o tetrazólio nitroazul 156µM e metasulfato de fenazina (PMS), além das diversas concentrações de CS (20µg/mL até 200 µg/mL), totalizando 200µL em cada um dos poços, que teve sua absorbância mensurada sob 560nm. Nesse experimento, o ácido ascórbico foi usado como controle positivo novamente e um poço sem tratamento com CS foi denominado de controle negativo. A fórmula utilizada para calcular a inibição do radical superóxido foi:
Sequestro superóxido (%) = (Ab0 – Ab2)/(Ab0-AbB)
Onde Ab0 é a absorbância do controle negativo, Ab2 é a absorbância das amostras e AbB é absorbância do branco.
3.8.4 Avaliação da peroxidação lipídica
Por fim, para verificar o quanto o CS pode inibir danos causados pelas ROS às estruturas celulares, tal como as membranas lipídicas, foi feito o teste de peroxidação lipídica.
Nesse caso, o teste de inibição da peroxidação lipídica foi montado seguindo o relato de Devasagayam e colaboradores (2003). Onde foi orquestrado um sistema, em microplaca, de suspensão de gema de ovo, 10% de tampão PBS (pH: 7,4), 25µL de sulfato ferroso 0,07M. Em seguida foi feito a adição de 250µL de solução contendo concentrações de condroitim sulfato (20 a 200µg/mL) seguido de incubação por 30 min sob 37ºC. Também, a mistura recebeu adição de mais 750µL de ácido tricloroacético 20% e 750µL de ácido tiobartitúrico 0,8%, aquecendo-a por mais 15 minutos em 100ºC. Por fim a mistura foi centrifugada sob 5600g por 10 minutos e a leitura foi feito com espectrofotometria a 532nm. A fórmula usada para calcular a inibição da peroxidação lipídica foi:
Inibição Peroxidação Lipídica (%) = [1-(Ab2-Ab0)] x100
Onde Ab0 é a Absorbância do controle negativo e Ab2 é a absorbância das amostras.
3.8.5 Capacidade quelante do íon ferroso
Com o intuito de observar por qual mecanismo o CS inibe a formação das ROS (por inibição da reação de Haber-Weiss ou alguma via alternativa) foram feitos os testes de quelação dos íons metálicos que participam da reação de Haber-Weiss.
A capacidade do condroitim em quelar o íon Fe2+ foi feita através da detecção de ferrozina descrito (Borg, 1993; Wang et al. 2003). Para esse experimento, foram adicionados 100µL do CS nas concentrações de 20 µg até 200µg, em seguida houve a adição de 100µL do sulfato ferroso 0,1M. Após 5 minutos houve a adição de 100µL de ferrosina a 0,25mM, seguido pela incubação por 10 minutos, para consequente leitura sob 562nm. O controle positivo utilizado neste teste foi o EDTA 20µg/mL. Para calcular a quantidade de quelação do íon Fe2+, foi aplicada a seguinte fórmula:
Quelação de Fe2+ (%) = [Ab0-(Ab2-AbB)]/Ab0 x100
Onde Ab0 é a absorbância do Controle negativo; Ab2 é a absorbância das amostras e AbB é absorbância do Branco.
39 3.8.6 Capacidade quelante do íon cúprico
A redução do íon Cu2+ foi feita seguindo o protocolo de Megias e colaboradores (2009), esse teste se baseia na associação do cobre com o violeta de pirocatecol, que confere uma coloração acompanhável por espectrofotometria, na absorbância de 632nm. Sendo que a quantidade de cobre livre retirado da solução é proporcional à atividade redutora da molécula testada. O teste foi realizado com várias concentrações de CS (20 a 200µg/mL) e a fórmula utilizada para calcular a quelação do íon cúprico foi:
Quelação de Cu2+ (%)= [(Ab0-Ab2)/Ab0] x100
Onde Ab0 é a absorbância do controle negativo e Ab2 é a absorbância das amostras.