CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA
LUIZ HENRIQUE COSTA DE MEDEIROS
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTIOXIDANTE DE
CONDROITIM SULFATO EXTRAÍDO DAS VÍSCERAS DE
TILÁPIA Oreochromis niloticus
NATAL
2020
LUIZ HENRIQUE COSTA DE MEDEIROS
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTIOXIDANTE DE
CONDROITIM SULFATO EXTRAÍDO DAS VÍSCERAS DE
TILÁPIA Oreochromis niloticus
Dissertação apresentada ao Departamento de Bioquímica da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Bioquímica. Orientadora: Suely Ferreira Chavante
Co-orientadora: Guilianna Paiva Viana de Andrade Souza.
Natal
2020
Medeiros, Luiz Henrique Costa de.
Avaliação do potencial antioxidante de Condroitim sulfato extraído das vísceras de tilápia Oreochromis niloticus / Luiz Henrique Costa de Medeiros. - Natal, 2020.
73 f.: il.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Biociências. Programa de Pós-graduação em Bioquímica.
Orientadora: Profa. Dra. Suely Ferreira Chavante.
Coorientadora: Profa. Dra. Giulianna Paiva Viana de Andrade Souza.
1.
1. Antioxidante - Dissertação. 2. Condroitim sulf
Dissertação. 3. DCFH-DA - Dissertação. 4. Oreochromis niloticus - Dissertação. 5. Proteoglicanos - Dissertação. 6. ROS
Dissertação. I. Chavante, Suely Ferreira. II. Souza, Giulianna Paiva Viana de Andrade. III. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. IV. Título.
RN/UF/BSCB C
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial Prof. Leopoldo Nelson - -Centro de Biociências - CB
LUIZ HENRIQUE COSTA DE MEDEIROS
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTIOXIDANTE DE CONDROITIM SULFATO
EXTRAÍDO DAS VÍSCERAS DE TILÁPIA OREOCHROMIS NILOTICUS
Dissertação apresentada ao Departamento de Bioquímica da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Bioquímica.
Aprovado em: 27/08/2020
Dedico esta obra
A todas as pessoas que direto ou indiretamente participaram da minha formação, durante
AGRADECIMENTOS
Agradeço imensamente a Deus e todo o universo por me dar a oportunidade e privilégio de poder defender um mestrado em um país com tanta desigualdade social.
Agradeço a toda minha família por estarem ao meu lado desde meu nascimento, acolhendo e dando suporte durante toda minha jornada. Em especial a Eva Costa, Jorge José de Medeiros, César Augusto Costa de Medeiros e Leonardo da Silva Alves. Vocês são parte da pessoa que
sou, me ensinaram tudo, foram porto, abrigo e escola. Eu não escolheria ninguém diferente para acompanhar-me nessa jornada. Essa dissertação também pertence a cada um de vocês.
À Universidade Federal do Rio Grande do Norte por ter permitido meu desenvolvimento como biomédico e humano desde 2013.
Ao Departamento de Bioquímica, incluindo todos os professores e equipes dos laboratórios, funcionários e colegas. Cada um de vocês participou da minha formação e contribuiu para o
conhecimento que me permitiu chegar até esse local.
Um agradecimento especial a Giulianna Paiva Viana de Andrade Souza e Suely Ferreira Chavante, minhas duas orientadoras, por todos os ensinamentos e anos de participação na
minha formação acadêmica.
Aos demais professores da UFRN, em especial aqueles que participaram da minha formação como Biomédico e disponibilizaram-se para fazer parte da minha Banca de qualificação e
defesa.
Agradeço a todos meus colegas de laboratório, incluindo os colaboradores da UNIFESP, em especial Helena Nader e Marcelo Lima, que contribuíram para que essa pesquisa acontecesse.
A todos os membros do DBQ que direto e indiretamente contribuíram para meus experimentos, em especial Marilia Negresiros, Weslley Paiva, Hugo Rocha e Ana Katarina
Marcelle França, Adriane Lemos, Isabela Fortaleza, Marianna Barros, Pedro Amorim, Claudia Pereira, Silvania Oliveira, Jader Alves, Ana Beatriz, Monalyse Carine, meus colegas
da UPA Potengi e tantos outros que não estão tiveram seus nomes escritos aqui. Vocês são oásis em um mundo ainda tão cheio de problemas.
Ao CNPq e CAPES por terem acreditado e permitido que essa pesquisa acontecesse.
“O que prevemos raramente ocorre; o que menos esperamos geralmente acontece.”
Oreochromis niloticus
RESUMO
Os glicosaminoglicanos são polissacarídeos presentes na superfície celular e matriz extracelular da grande maioria dos animais, eles desempenham diversas funções biológicas, tais como crescimento celular, diferenciação, antioxidante, neuroprotetores e outros. Entre os glicosaminoglicanos, o condroitim sulfato (CS) se destaca por seu efeito antioxidante e pode ser encontrado em várias espécies de peixes, como a tilápia (Oreochromis niloticus) cujo cultivo representa uma importante atividade econômica na cidade de Natal (RN/Brasil), a qual gera diariamente dezenas de quilos de vísceras como resíduo de sua produção. Desta forma, esse estudo visa utilizar os rejeitos da tilapicultura obtidos em feiras livres do município de Natal, como matéria prima para extração e purificação de condroitim sulfato, além de avaliar seu efeito antioxidante. Para isso os resíduos foram expostos a um processo de proteólise enzimática, seguido de complexação e descomplexação com resina Lewatit. Este método permitiu obter um pool de glicosaminoglicanos que em seguida foi exposto à técnicas de purificação baseados em fracionamentos com acetona e cromatografia de troca iônica acompanhados por eletroforese em gel de agarose e degradação enzimática. Posteriormente foram feitos testes antioxidantes que visaram quantificar a capacidade do CS em inibir espécies reativas intracelulares e in vitro, visto que o desequilíbrio nos níveis destas espécies reativas tem participação em quadros clínicos como as doenças autoimunes, neurodegenerativas e câncer. Para isso foram usados métodos de inibição de espécies reativas intracelulares (DCFH-DA), quelação dos íons ferroso e cúprico, inibição dos radicais superóxidos e hidroxila, além da inibição de óxido nítrico e peroxidação lipídica. Como resultados, foi possível observar que em cada quilo de massa seca de víscera de tilápia é possível extrair aproximadamente 69mg de condroitim sulfato purificado, sendo composto 59% por condroitim-4-sulfato. Através da observação dos valores obtidos nos testes antioxidante foi possível ressaltar uma inibição de até 52% do total de espécies reativas intracelulares em cultura de células RAW 264.7, sem demonstração de citotoxicidade até a concentração de 200mg/mL de condroitim. Os demais testes sugerem que essa inibição ocorre por diversos fatores, que vão desde a inibição dos metais e dos radicais livres (p<0,05), até a provável participação em vias secundárias, como a ativação de proteínas antioxidantes. Os resultados obtidos nesse estudo fortalecem a extração e uso de glicosaminoglicanos, em especial do condroitim sulfato, auxiliando na compreensão dos efeitos biológicos de condroitins oriundos de múltiplas fontes, dando ênfase para seu efeito antioxidante e fornecendo uma alternativa de descarte para o rejeito biológico produzido pela produção comercial de tilápia, abrindo perspectivas para possíveis usos dessa molécula na pesquisa e indústria.
Palavras-chave: Antioxidante, Condroitim sulfato, DCFH-DA, Oreochromis niloticus, proteoglicanos, ROS.
Evaluation of the antioxidant potential of the Chondroitin sulfate extracted from the viscera of tilápia Oreochromis niloticus
ABSTRACT
Glycosaminoglycans are polysaccharides present in the cell surface and extracellular matrix of the vast majority of animals. They perform several biological functions, such as cell growth, differentiation, antioxidant, neuroprotec and others. Among glycosaminoglycans, chondroitin sulfate (CS) stands out for its antioxidant effect and can also be found in many fish species, such as tilapia (Oreochromis niloticus) whose cultivation represents an important economic activity in Natal (RN / Brazil). ), eliminating a big quantity of viscera as a waste of its production, daily. Thus, the following study uses the tilapia wastes that have been obteined in free markets in city of Natal, as raw material for the extraction and purification of chondroitin sulfate, in addition to evaluete its antioxidant effect. For this, the residues were exposed to an enzymatic proteolyse process, followed by complexation and decomplexing with Lewatit resin, obtaining a pool of glycosaminoglycans that have been used in purification procedures like acetone fractionation and ion exchange chromatography, accompained by agarose gel electrophoresis and enzimatic degradation. Subsequently, antioxidant tests were performed to quantify the ability of CS to inhibit reactive species intracellular and in vitro, since the imbalance in their quantities has a role in clinical conditions such as autoimmune, neurodegenerative diseases and cancer. For this, methods such as inhibition of intracelular ROS (DCFH-DA), chelation of ferrous and cupric ions, inhibition of superoxide and hydroxyl radicals, in addition to inhibition of nitric oxide and lipid peroxidation were used. As a result, it was possible to observe that in each kilogram of tilapia viscera dry mass it is possible to extract approximately 69mg of purified chondroitin sulfate, being 59% composed of chondroitin-4-sulfate. By observing the values obtained in the antioxidant tests, it was possible to highlight an inhibition of up to 52% of the reactive intracellular species in culture of RAW 264.7 cells, without demonstration of cytotoxicity up to the concentration of 200mg /mL of chondroitin. The other tests showed that this inhibition occurs due to several factors, ranging from the inhibition of metals and free radicals (p<0,05), to the probable participation in secondary pathways, such as the activation of antioxidant proteins. The results obtained in this study strengthen the extraction and use of glycosaminoglycans, especially chondroitin sulfate, helping to understand the biological effects of chondroitins from multiple sources, emphasizing their antioxidant effect and providing a disposal alternative for the biological waste produced by commercial tilapia production, opening perspectives for possible uses of this molecule in research and industry.
Keywords: Antioxidant, Chondroitin sulfate, DCFH-DA, Oreochromis niloticus, proteoglycans, ROS.
Figura 1: Reação de Harber-Weiss e Fenton...23
Figura 2: Via alternativa proposta para o mecanismo antioxidante do CS...25
Figura 3: Oreochromis niloticus (Tilápia do Nilo)...31
Figura 4: Esquema representativo do fracionamento com acetona...33
Figura 5: Fluxograma sobre os procedimentos de extração e purificação...34
Figura 6: Perfil eletroforético de GAGs obtidos de Oreochromis inloticus ...40
Figura 7: Eletroforese das frações obtidas após o fracionamento com acetona...41
Figura 8: Eletroforese das frações obtidas após a cromatografia por DEAE-sephacel...42
Figura 9: Degradação enzimática do Condroitim sulfato das vísceras da tilápia...43
Figura 10: Avaliação da citotoxicidade em cultura de células RAW 264.7...44
Figura 11: Inibição das espécies reativas de oxigênio em meio intracelular...45
Figura 12: Avaliação do sequestro dos radicais hidroxila in vitro...46
Figura 13: Avaliação do sequestro dos radicais superóxido...47
Figura 14: Avaliação da inibição da peroxidação lipídica...48
Figura 15: Potencial de quelação de ferro...49
Figura 16: Potencial de quelação de cobre...50
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Principais Glicosaminoglicanos e suas estruturas...19
Tabela 2: Tipos de condroitim sulfato...21
Tabela 3: Rendimentos da extração e purificação de GAGs das vísceras do Oreochromis
niloticus...43
Tabela 4: Comparação dos efeitos antioxidantes entre o CS-Atilapia e o CS-Abovino... 51 Tabela 5: Perfil dissacarídico e massa molecular do Condroitim sulfato...54
ΔDi0S Dissacarídeo sem sulfatação
ΔDi2,6S Dissacarídeo sulfatado nas posições 2 e 6 da galactosamina
ΔDi4S Dissacarídeo sulfatado na posição 4 da galactosamina
ΔDi6S Dissacarídeo sulfatado na posição 6 da galactosamina
Ab0 Absorbância do controle negativo
Ab1 Absorbância do controle negativo com LPS
Ab2 Absorbância dos sistemas tratados
AbB Absorbância do branco
AKT Proteína quinase B
ANOVA Análise de Variância Univariada
C2 Carbono 2 C4 Carbono 4 C6 Carbono 6 CN Controle Negativo CO2 Dióxido de carbono CP Controle positivo CS Condroitim sulfato
CS-0 Condroitim sem sulfatação
CS-A Condroitim sulfatado na posição 4 da galactosomina
CS-Abovino Condroitim sulfato extraído da traqueia bovina
CS-C Condroitim sulfatado na posição 6 da galactosomina
CS-Ctubarão Condroitim sulfato extraído da cartilagem de tubarão
CS-D Condroitim sulfatado na posição 2 do glucurônico e 6 da galactosomina
CS-K Condroitim sulfatado na posição 3 do glucurônico e 4 da galactosomina
CS-L Condroitim sulfatado na posição 3 do glucurônico e 6 da galactosomina
CS-M Condroitim sulfatado na posição 3 do glucurônico e posições 4 e 6 da galactosomina
CTV Cloreto de Centiltrimetilamônio
DCFH-DA Teste do 2,7-diclorofluoresceína diacetato
DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium
DS Dermatam sulfato
EDTA Ácido etilenodiaminotetracético
F:3,0M Fração 3M de cloreto de sódio
F:0,5VA Fração 0,5 volumes de acetona
F:0,6VA Fração 0,6 volumes de acetona
F:0,7VA Fração 0,7 volumes de acetona
F:0,8VA Fração 0,8 volumes de acetona
F:1,0VA Fração 1,0 volumes de acetona
F:0,8VA-0,5M Fração 0,8 volumes de acetona, 0,5M de cloreto de sódio
F:0,8VA-0,8M Fração 0,8 volumes de acetona, 0,8M de cloreto de sódio
F:0,8VA-1,0M Fração 0,8 volumes de acetona, 1,0M de cloreto de sódio
Fe2+ Íon ferroso
Fe3+ Íon férrico
FeSO4 Sulfato ferroso
GAG Glicosaminoglicano
GalNAc N-acetilgalactosamina
cromatografia líquida de alta pressão
H2O2 Peróxido de hidrogênio
HA Ácido hialurônico
Hep Heparina
HO-1 Heme oxigenase-1
HS Heparam sulfato
LPS Lipopolissacarídeo
MTT Brometo de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolium
NaCl Cloreto de sódio
NBT Tetrazólio nitroazul
NO Óxido nítrico
NOS Óxido nítrico sintase
O2•- Radical ânion superóxido
OH• Radical hidroxila
ONOO− Peroxinitrito
PBS Tampão fosfato-salino
PDA Tampão (1,3-diaminopropano)
PI3K Fosfoinositida 3-cinase
PKC Proteína C reativa
PMS Metasulfato de fenazina
Pós-CPX Pós-complexação
Pré-CPX Pré-complexação
QS Queratam sulfato
ROS Espécies reativas de oxigênio
SAX-HPLC Coluna de troca aniônica forte
SOD Superóxido dismutase
TCA Ácido tricloroacético
UNIFESP Universidade Federal de São Paulo
SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO ... 18 1.1. Polissacarídeos ... 18 1.2. Glicosaminoglicanos ... 18 1.3 Condroitim sulfato ... 20 1.4 Espécies reativas ... 22 1.5 Efeitos antioxidantes ... 24
1.6 Glicosaminoglicanos de fontes aquáticas ... 26
2 OBJETIVOS ... 28 2.1 Objetivo geral ... 28 2.2 Objetivos específicos ... 28 3 MATERIAIS E MÉTODOS ... 29 3.1 Reagentes e equipamentos ... 29 3.2 Material biológico ... 30 3.2.1 Vísceras da tilápia ... 30
3.2.2 Células usadas nos experimentos ... 31
3.3 Extração dos glicosaminoglicanos do Oreochromis niloticus ... 31
3.4 Purificação dos GAGs obtidos do Oreochromis niloticus ... 32
3.4.1 Fracionamento dos GAGs ... 32
3.4.2 Cromatografia de troca iônica ... 33
3.5 Eletroforese em gel de agarose ... 34
3.6 Degradação com enzimas ... 35
3.7 Teste de citotoxicidade ... 35
3.8 Ensaios de atividade antioxidante ... 36
3.8.1 Redução do estresse oxidativo intracelular ... 36
3.8.3 Sequestro do radical aniônico superóxido ... 37
3.8.4 Avaliação da peroxidação lipídica ... 38
3.8.5 Capacidade quelante do íon ferroso... 38
3.8.6 Capacidade quelante do íon cúprico ... 39
3.9 Análise estatística ... 39
4 RESULTADOS ... 40
4.1 Extração e purificação dos de um CS do Oreochromis niloticus ... 40
4.2 Análise da composição dissacarídicas do CS das vísceras da tilápia ... 43
4.3 Viabilidade Celular ... 44
4.4 Atividades antioxidantes ... 44
4.4.1 Inibição das espécies reativas de oxigênio em células ... 45
4.4.2 Sequestro do radical hidroxila ... 46
4.4.3 Sequestro do radical superóxido ... 47
4.4.4 Inibição da Peroxidação Lipídica ... 47
4.4.5 Quelação do íon ferroso ... 48
4.4.6 Quelação do íon cúprico ... 49
5 DISCUSSÃO ... 52
6 CONCLUSÃO ... 60
1. INTRODUÇÃO
1.1. Polissacarídeos
Nas últimas décadas, diversas biomoléculas vêm sendo extraídas de fontes naturais e investigadas com relação a suas aplicações biológicas e farmacológicas. Isto segue a demanda da indústria farmacêutica e alimentícia em desenvolver produtos que tenham aplicações biomédicas e que gerem uma atividade financeiramente rentável (Silva et al. 2012). Ao exemplo dessas moléculas temos os polissacarídeos, que são polímeros de monossacarídeos presentes em todos os organismos vivos, com exceção dos vírus.
Os polissacarídeos são conhecidos por sua estabilidade, baixa toxicidade, alta hidrofilicidade, capacidade de formar géis, potencial biodegradável e capacidade de sofrer modificações químicas, atuando como elementos estruturais e de sustentação nas paredes celulares de plantas e bactérias e, também, no revestimento celular e tecido conjuntivo dos animais (Sinha et al. 2001; Nelson e Cox, 2002; Aristimunha, 2014).
1.2. Glicosaminoglicanos
Um grupo especial de polissacarídeos, são os glicosaminoglicanos (GAGs). Eles são formados por unidades dissacarídicas repetidas de uma hexosamina e um açúcar não nitrogenado, unidos através de ligação glicosídica. Na unidade dissacarídicas dos GAGs, um dos monossacarídeos sempre será um açúcar aminado (α-D-glucosamina ou D-galactosamina) e o outro será um ácido urônico (ácido D-glucurônico ou ácido-L-idurônico) ou uma galactose (Dietrich, 1983; Kjellen, 1991; Lamari, 2006; Afratis, 2012; Valcarcel, 2018).
As diferenças na composição dissacarídica dos GAGs resultam em vários tipos de moléculas que compõem esse grupo. Essas variações dão origem aos principais GAGs encontrados em vertebrados, que são a heparina (Hep) e o heparam sulfato (HS), compostos de unidades repetidas de glucosamina com ácido glucurônico ou idurônico; o condroitim sulfato (CS), galactosamina com ácido glucurônico; dermatam sulfato (DS), galactosamina com ácido glucurônico ou idurônico; queratam sulfato (QS), glucosamina com galactose; e o
19 ácido hialurônico (HA), glucosamina com ácido glucurônico, como mostrado na Tabela 1 (Volpi, 2009; Yamada & Sugahara, 2008; Morla, 2019).
GAG Hexosamina Ácido Urônico/ Galactose Dissacarídeo Heparina (Hep) D-glucosamina Ácido L-idurônico/ Ácido D-glucurônico Heparam Sulfato (HS) D-glucosamina Ácido D-glucurônico/Ácido L-idurônico Condroitim Sulfato (CS) D-galactosamina Ácido D- glucurônico Dermatam Sulfato (DS) D-galactosamina Ácido D- glucurônico/ Ácido L-idurônico Queratam Sulfato (QS) D-glucosamina galactose Ácido Hialurônico (HA) D-glucosamina Ácido D-glucurônico
Tabela 1: Principais glicosaminoglicanos e suas estruturas. As regiões mostradas com “R” na imagem representam radicais onde podem haver sulfatação. Imagem adaptada de Kastana, 2019 e Morla, 2019.
As unidades dissacarídicas de GAGs apresentam um grande número de cargas negativas relativas ao número de grupos sulfato e/ou carboxil presentes nessas moléculas, sendo então consideradas moléculas polianiônicas. Dentro deste contexto, o ácido hialurônico é descrito como o único GAG que não apresenta sulfato em sua composição (Lamberg et al. 1974).
Os glicosaminoglicanos desempenham diversas funções biológicas, tais como composição e hidratação da matriz extracelular, sinalização celular e movimento de grânulos citoplasmáticos, sendo detectados, na forma de proteoglicanos, onde as cadeias de
glicosaminoglicanos estão ligadas covalentemente a um core protéico, com exceção do ácido hialurônico (Medeiros, 2000; Prydz &Dalen, 2000; Sampaio, 2006).
A variedade de funções dentro dos GAGs é aumentada por sua grande diversidade, tendo em vista que podem variar em composição dissacarídica, tipo de ligação glicosídica, tamanho molecular das cadeias, grau de sulfatação e região de ligação às proteínas (Gandhi, 2008).
Essas variações podem ser observadas, por exemplo, quando comparamos a estrutura e os efeitos biológicos de fontes diferentes de glicosaminoglicanos, que possibilita diversas interações biológicas e permite que os GAGs possam atuar farmacologicamente como anticoagulante, antitrombótico, anti-inflamatório, antioxidante, antiviral, entre outros (Dietrich, 1983; Nader & Dietrich, 1989; Viola, 2012; Xiong et al. 2012).
1.3 Condroitim sulfato
Com relação aos efeitos farmacológicos, um glicosaminogicano que vem recebendo destaque é o condroitim sulfato (CS), principalmente por seu efeito antioxidante e anti-inflamatório (Campo et al. 2006; Bobula et al. 2018; Zhu et al. 2018). Ele é um GAG natural presente na matriz extracelular de tecidos conjuntivos, como: cartilagens, pele, tendões e cérebro, podendo ser purificado e extraído desses tecidos (Souich et al. 2009). O CS é formado por unidades alternadas de ácido D-glucurônico (GlcA) β(1>3) ligado a um resíduo de N-acetil-D-galactosamina (GalNAc), sendo encontrado ligados covalentemente a proteínas, na forma de proteoglicano (Ruoslathi, 1988; Prabhakar, 2006; Lamari et al. 2006). Suas cadeias são montadas no retículo endoplasmático e no complexo de Golgi e são iniciadas pela síntese de um tetrassacarídeo β-D-glucurônico-β-D-galactose-β-D-galactose-β-D-xilose que se liga covalentemente a um resíduo de serina no core proteico (Beaty et al. 1986; Sugahara et al. 2000; Volpi et al. 2006; Uyama, 2007).
Uma única cadeia de CS pode conter mais de 100 unidades dissacarídicas, sofrendo diversas modificações na medida em que é sintetizada, tal como a ausência de sulfatação (CS-0) ou sulfatação em sítios diversos (Uyama et al. 2007; Kusche-gullberg; Kjellén, 2003). O padrão de sulfatação é uma importante modificação na molécula por regular a interação do CS com diversas cadeias de proteínas, ocasionando variações em seus efeitos farmacológicos e diferentes nomenclaturas dos heterodímeros de CS, de acordo com sua predominância de sítios sulfatados (Properzi, 2003; Volpi et al. 2006; Flangea et al. 2009).
21 A literetatura já descreve diversos tipos de CS, como exemplo dos CS-A e CS-C, que possuem sulfatação nos carbono 4 e 6 da galactosamina, respectivamente; enquanto isso, alguns outros tipos de CS, como o CS-D, CS-E, CS-K, CS-L, CS-M e CS-S possuem sulfatação em 2 ou mais carbonos, como mostrado na Tabela 2 (Carney et al. 1991; Yamada & Sugahara, 2008; Volpi, 2009; Cavalcante et al. 2018; Palhares et al. 2019; Pomin et al. 2019).
Tabela 2: Tipos de condroitim sulfato.
O CS tende a ter variações estruturais de acordo com a espécie animal extraída, tipo do tecido, idade do animal e condições fisiológicas. Essas diferenças estruturais refletem disparidades nos efeitos farmacológicos entre os CS adquiridos de fontes diversas permite um estudo comparativo entre estas fontes de polissacarídeos. Como exemplos, temos o CS obtido da traqueia bovina, predominantemente composto de CS-A (CS-Abovino) e cartilagem de tubarão, composto em maioria por CS-C (CS-Ctubarão) (Maccari et al. 2010; Volpi, 2009; Zhu et. al. 2018).
O condroitim é um importante componente estrutural de cartilagens e está amplamente distribuído na matriz extracelular de animais, tendo como principal função biológica a de fornecer baixo atrito e desgaste nas articulações sinoviais, porém também pode atuar farmacologicamente no crescimento de células neurais, regeneração axonal, divisão celular, adesão celular e modulador de fatores de crescimento (Egea, et al. 2010; Zhu et al. 2018). Além disso, diversos estudos mostraram que moléculas do tipo condroitim sulfato são capazes
de atuar como antioxidante, em especial sobre as vias formadoras de espécies reativas de oxigênio (ROS) e espécies reativas de nitrogênio (RNS) (Egea, et al. 2010; Herotin et al. 2010; Bobula, 2018; Zhu et al. 2018).
1.4 Espécies reativas
As espécies reativas de oxigênio (ROS) e espécies reativas de nitrogênio (RNS) são moléculas instáveis, capazes de transformar outras moléculas com as quais colidem. Elas são produzidas em quase todas as células eucarióticas e estão envolvidas em diversos processos biológicos, desde a respiração celular, proliferação, migração, diferenciação, dinâmica do citoesqueleto, metabolismo celular e processos de defesa do organismo, como a inflamação (Silva, 2010; Griendling et al. 2019).
Por outro lado, situações patológicas ou exógenas, como exemplo da poluição ambiental, tabaco e radiação ionizante, podem aumentar a produção dessas espécies. O maior número desses radicais é relacionado com alteração da estrutura e função de lipídios, proteínas e ácidos nucleicos, devido seus elétrons desemparelhados (Gao et al. 2019).
Isso leva a disfunções teciduais que podem implicar no desenvolvimento de doenças crônicas e degenerativas, ao exemplo de doenças cardiovasculares, câncer, doenças autoimunes, artrite reumatoide, distúrbios degenerativos e outros (Pham-Hyu, 2008; Abdelhedi, 2016; Ahmad et al. 2017; Bai, 2018; Griendling et al. 2019).
Entre as espécies reativas de nitrogênio, o principal representante é o óxido nítrico (NO). Ele possui um elétron desemparelhado, que o designa como radical livre, porém este elétron fica localizado entre os átomos de oxigênio e nitrogênio, conferindo maior estabilidade para essa molécula. Em células de mamíferos, o NO é formado pelo óxido nítrico sintase (NOS). O NO é capaz de agir como segundo mensageiro para modular diversos processos biológicos, incluindo função endotelial, contração e dilatação de células do músculo liso, inflamação, neuroplasticidade e citotoxicidade. Porém ele pode reagir com ROS dando origem a outras RNS, ao exemplo do peroxinitrito (ONOO−), conhecido por seu alto efeito oxidante (Hughes, 2008; Griendling et al. 2019).
As espécies reativas de oxigênio, por sua vez, têm como principais representantes o peróxido de hidrogênio (H2O2), o radical ânion superóxido (O2•-) e o radical hidroxila (OH•). Elas são sintetizadas, em maioria, durante a respiração celular, onde uma parte do O2 que não é reduzida à água, acaba por originar essas ROS (Barreiros et al. 2006; Griendling et al.
23 2019).
O ânion superóxido é formado pela redução do oxigênio molecular (O2) através de uma catálise enzimática realizada pela xantina oxidase, NADPH oxidase, ou pela cadeia transportadora de elétrons presente nas mitocôndrias, tendo um importante papel como sinalizador molecular por oxidar grupos -SH em ligações dissulfeto. Além disso, o O2 •-também é gerado pelas células de defesa do organismo, para eliminar microrganismos invasores (Al-Mamum et al. 2007; Mittal et al. 2014).
Na presença do íon férrico (Fe3+), o ânion superóxido é convertido a O2, com produção do íon ferroso (Fe2+), reação que é conhecida como Harber-Weiss (Figura 1). Esse Fe2+ acabará por reagir com o H2O2 do meio celular, dando origem ao OH
•
, OH- e mais íon férrico (reação de Fenton), que alimentará novamente a reação de Harber-Weiss, dando origem a um ciclo de produção de espécies reativas como o radical hidroxila (Ferreira et al., 1997). O íon cúprico (Cu2+) também é capaz de participar da reação de Fenton como o Fe2+, porém tem menos impacto devido sua menor disponibilidade no organismo (Aguiar et al. 2007).
Figura 1: Reação de Harber-Weiss e Fenton. Extraído de Ferreira et al., 1997.
O OH• formado pela reação de Fenton é conhecido por ser o mais deletério aos organismos vivos, devido sua capacidade de atacar moléculas por sequestro de hidrogênio e adição de insaturações. Sendo dificilmente sequestrado in vivo por sua meia-vida curta e facilmente neutralizado in vitro, por sua alta reatividade a diversas moléculas (Forrester et al. 2018).
As ROS, em especial o OH• também podem causar dano a várias estruturas celulares e biomoléculas, como as proteínas, lipídios, DNA, RNA e membrana celulares. No processo conhecido como peroxidação lipídica, a espécie reativa ataca sítios susceptíveis da cadeia lipídica, convertendo-o em um centro de radical livre, esse carbono radicalar, por sua vez consegue reagir com moléculas de oxigênio, formando o radical lipídio-peroxila (Forrester et
al. 2018).
Esse processo desestabiliza membranas celulares devido a ataques aos fosfolipídios presentes nas membranas. A peroxidação lipídica tem importância fisiológica na resposta inflamatória aguda, por ser utilizado para eliminar patógenos invasores, porém seu desequilíbrio está relacionado com quadros clínicos como câncer, artrite e aterosclerose (Lima et al. 2001).
1.5 Efeitos antioxidantes
Com a disseminação de vários quadros clínicos relacionados ao estresse oxidante, surgiu, na indústria farmacêutica e alimentícia uma maior demanda por produtos que possam reduzir os níveis dessas espécies reativas, em especial das ROS (Ahmad et al. 2017).
Nesse contexto, diversas biomoléculas tais como polissacarídeos sulfatados extraídos de algas, heparam sulfato da cabeça de camarão e vários tipos de condroitim sulfato vêm sendo descrito como potenciais moléculas antioxidantes e antinflamatórias, por serem alvos de estudos com capacidade de reduzir os níveis de espécies reativas tanto intracelularmente quanto in vitro, em grande maioria a partir da interação direta com esses radicais (Campo et al. 2006; Volpi, 2011; Negreiros, 2015; Bobula et al. 2018; Vasconcelos, 2018; Zhu et al. 2018).
Alguns tipos de CS tiveram efeitos antioxidantes testados in vitro e em cultura de células. Um exemplo é o potencial do CS em reduzir espécies reativas intracelulares quando testado em cultura de células de neuroblastoma humano (SH-SY5Y), foi demonstrado por Ju e colaboradores (2017) que nessas linhagens, o 400µg/mL de CS foram capazes de reduzir em aproximadamente 20% a quantidade de espécies reativas totais presentes no sistema, alcançando maior semelhança com o controle negativo (Ju et al. 2017).
Estes estudos abriram portas para outros experimentos, como os que usaram CS extraídos da traquea bovina, cartilagem de salamandra gigante chinesa (Andrias davidianus), cartilagem de Raja porosa e cartilagem de tubarão. Estas moléculas reduziram, in vitro, as quantidades de radicais hidroxila e superóxido em aproximadamente 70%, na concentração de 2mg/mL. Nas menores concentrações (400 e 500µg/mL) o sequestro destes radicais aproximou-se de 25%, com excessão da raja porosa, que alcançou 10% de redução destas moléculas, sob 500µg/mL (Ajusaka et al. 2016; Zhu et al. 2018; Zhou et al. 2020).
Outros estudos mostraram efeito do CS em diferentes pontos da reação de Haber-Weiss, como na quelação de íon ferroso (Fe2+), onde o condroitim extraído da serpente
25 marinha (Lapemis curtus) foi capaz de inibir este íon em aproximadamente 15% e 40%, nas concentrações de 200µg/mL e 2,0mg/mL, respectivamente (Bai et al. 2018).
Alguns estudos in vivo também foram realizados com o CS nas últimas décadas, seguindo os resultados encontrados in vitro, ao exemplo dos estudos em modelo de rato, para atuar como hepatoprotetor, além de agir no tratamento de peritonites e artrite, cujos efeitos foram associados a sua capacidade antioxidante (Breborowicks, et al. 1994; Campo et al. 2003; Ha, 2003; ).
Ele também já foi relacionado com vias neuroprotetoras, onde foi proposta a relação dessa molécula com a redução dos níveis de ROS através de vias de sinalização alternativas. Nesse caso, o CS ativa, intracelularmente uma proteína C reativa (PKC) que aumenta a fosforilação da fosfoinositida 3-cinase (PI3K) e consequentemente a via de sinalização por proteína quinase B (AKT). Essa via é responsável pela estimulação da síntese da heme oxigenase-1 (HO-1), uma proteína antioxidante que é capaz de neutralizar os níveis de espécies reativas de oxigênio (ROS), como mostrado na figura 2 (Canãs et al. 2007; Souich et al. 2009; Gao, et al. 2019).
Figura 2: Via alternativa proposta para o mecanismo antioxidante do CS. Figura extraída de Egea e colaboradores, 2010.
Essa redução nos níveis de ROS intracelular é relacionada com um melhor funcionamento mitocondrial, devido à redução na perda de elétrons da cadeia respiratória para esses radicais livres, evitando a apoptose destas células. Esse mecanismo de redução de ROS
em células neurais é bastante relacionado à melhora de quadros neurodegenerativos, como o Alzheimer e Parkinson e tem motivado diversas pesquisas por novas moléculas antioxidantes (Canãs et al. 2007; Souich et al. 2009; Egea et al. 2010; Ju et al. 2017; Gao, et al. 2019).
1.6 Glicosaminoglicanos de fontes aquáticas
Nas últimas décadas, diversas fontes de moléculas antioxidantes foram propostas, ao exemplo da extração de compostos biológicos de organismos aquáticos que vem mostrando um grande crescimento (Mayer, et al., 2012; Silva, et al.; 201; Pinto, 2015).
Dessa forma, vários tipos de polissacarídeos sulfatados, foram extraídos dessas fontes, ao exemplo dos extraídos do caranguejo, algas e resíduos da carcinicultura (Andrade et al. 2013; Brito et al. 2008; Negreiros, 2015; Pinto, 2015). Além disso, um destaque vem sendo dado para a extração de moléculas nos tecidos de peixes, como exemplo Chimaera monstrosa e Sciaena umbra, tendo em vista que a produção de algumas dessas espécies, para consumo, origina resíduos que podem ser utilizados como fontes de moléculas (Bougatef et al. 2018; Vázquez et al. 2019)
Nos últimos anos, a produção de organismos aquáticos (aquicultura) demonstrou ser a atividade econômica de maior crescimento mundial dentro da indústria de produção alimentícia. Esta evolução foi observada pela produção mundial de pescado, que atingiu aproximadamente 178 milhões de toneladas em 2018, um crescimento de 3,4% em relação ao ano de 2017 (Fao, 2020; Hamli, 2013).
Segundo a Associação Brasileira de Piscicultura (2019), o Brasil tem a criação de peixes como principal representante dentre as atividades aquícolas, produzindo mais de 700 mil toneladas em 2018, o que representa crescimento de 4,5% em relação ao ano anterior.
Neste mesmo ano a produção de tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus), teve um grande destaque, avançando 11,9% e ultrapassando 400 mil toneladas por ano, sendo considerado um desempenho acima da média. Com esse resultado, a espécie representa a terceira maior produção de pescado do mundo e representa 55,4% da produção total de peixes de cultivo no Brasil, colocando o país na 4ª posição dentre os maiores produtores de tilápia do mundo, perdendo apenas para China, indonésia e Tailândia (Associação Brasileira de Piscicultura, 2019; Fao, 2020).
Nesse contexto, a Tilápia, Oreochromis niloticus, peixe de origem africana, está introduzida em todos os estados brasileiros, demostrando a capacidade de adaptação da espécie, e representa, no Rio Grande do Norte, 95% da produção total de peixes, alcançando
27 2300 toneladas do insumo em 2018 (Associação Brasileira de Piscicultura, 2019).
Todos esses dados implicam na importância e crescimento da produção da tilápia em nível local e mundial, porém seu cultivo gera grandes quantidades de resíduos, tal como pele e suas vísceras internas, que correspondem às partes não comercializadas do peixe, ao exemplo do intestino, rins, estômago, baço e bexiga. Estes rejeitos alcançam aproximadamente 10% da massa total do peixe e são conhecidos por causar danos aos ecossistemas naturais, atuando em processos como o acúmulo de material orgânico (eutrofização) em corpos de água (Zein et al. 1985; Amirkolaie, 2011; Mo et al. 2017).
Dessa forma, é necessário que sejam criados novos métodos para minimizar os impactos ambientais e criar condições para o desenvolvimento sustentável dessa atividade econômica. Um exemplo disso é o uso da pele da tilápia que vem sendo utilizada como biomaterial estável, principalmente no tratamento de queimaduras (Sun, 2017), porém, até o presente momento, poucos estudos sugerem um uso adequado para as vísceras remanescentes dessa atividade, que são tratadas como rejeitos, uma vez que são descartadas por completo, ocasionando problemas ambientais.
Considerando essa problemática, nosso grupo de pesquisa decidiu dar continuidade ao trabalho de Pinto (2015), usando as vísceras da tilápia como possível fonte de CS. Para isso, o CS teve sua estrutura caracterizada e foi investigado seu potencial efeito antioxidante, em especial na redução dos níveis das espécies reativas de oxigênio intracelular e in vitro. O resultado deste estudo poderá contribuir para agregar valor a um material residual descartado diariamente pelos produtores do peixe e consequentemente, gerar empregos para a região, diminuir os impactos ambientais e assim garantir a sustentabilidade dessa atividade econômica.
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Avaliar a estrutura e potencial antioxidante de um condroitim sulfato purificado das vísceras do Oreochromis niloticus.
2.2 Objetivos específicos
Extrair e purificar um CS das vísceras de tilápia.
Caracterizar estruturalmente o condroitim sulfato extraído da tilápia. Avaliar o potencial citotóxico destas moléculas.
Avaliar a atividade antioxidante deste composto com testes in vitro na produção de radicais livres.
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3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Reagentes e equipamentos
1,3-diaminopropano acetato (PDA) e tolueno fornecida pela Aldrich Chemical (EUA). Acetona, metanol e benzina fornecidos pela Cromato Produtos químicos Ltda (SP). Ácido sulfúrico, álcool metílico, hidróxido de sódio, peróxido de hidrogênio e sulfato
de ferro heptahidratado foram adquiridos de Diadma (SP, Brasil).
Ácido etilenodiminotetracético (EDTA) obtido pela VETEC (Duque de caxias, RJ, Brasil)
Ácido clorídrico obtido da ISOFAR Indústria e Comercio de Produtos Químicos Ltda (Duque de Caxias, RJ, Brasil)
Ácido ascórbico, ferrozina, nitroblue tetrazolium (NBT) adquiridos da Sigma-Aldrich (São Paulo, SP, Brasil).
Agarose fornecida pela BioRad Laboratories (EUA).
Agitador orbital, banho maria e estufa modelo 515 de 2013, foram adquiridos da FANEM Ltda (Piracicaba, SP, Brasil).
Azul de toluidina e vermelho de cresol adquirida da Sigma Chemical (EUA).
Balança analítica de precisão (mod. B-tec, 2200) e bomba a vácuo obtidos da Tecnal (Brasil).
Bancada de fluxo laminar (PACHANE Pa300). Banho Maria (Tecnal, Brasil).
Brometo de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltretazolium adquirido pela Sigma Aldrich (EUA).
Câmara de Neubauer (Loptik Labor).
Câmara para eletroforese horizontal em gel de agarose (Técnica Permatron Ltda, São Paulo, SP, Brasil.
Centrifuga refrigerada 5804 R obtido da Eppendorf (Brasil).
Centrifuga refrigerada, modelo CR 21 da Hitachi Koki Co. Ltda (Tóquio, Japão). Cloreto de sódio fornecido pela Vetec Química (RJ).
Enzima de proteólise PROLAV 750, adquirida pela Prozyn Indústria e comércio Ltda. Espectrofotômetro obtido da FEMTO Ltda (São Paulo, SP, Brasil).
Filtro de Seringa de 0,45µm foi obtido da FLUKA (Switzerland).
Fluxo laminar foi cedido em colaboração com o laboratório BIOPOL (UFRN), originado da Pachane Pa300 (Piracicaba, SP, Brasil).
Fonte de corrente contínua regulável. Técnica Permatron Ltda (São Paulo, Brasil). Incubadora de CO2 com desinfecção UV cedido em colaboração com o laboratório
BIOPOL (UFRN), originado da Brookhaven (USA).
Leitor de microplaca de ELISA obtido da Epoch – Bioteck (California, USA). Liofilizador FreeZone 4.5 obtido da Labcon.
Medidor de pH modelo FTP 125 da IMPRINT do Brasil Ltda.
Meio de Cultura DMEM, estreptomicina, penicilina, soro fetal bovino e soluções de tripsina/EDTA adquiridas pela Cultilab (SP).
Microscópio de contagem Olympus CX 25.
MTT – Brometo de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolium (Sigma Aldrich, USA).
Purificador de água Milli-Q Water System da empresa Millipore Corp. (EUA). Resina de troca iônica Lewatit originado da empresa Bayer (São Paulo, Brasil).
3.2 Material biológico
3.2.1 Vísceras da tilápia
O material usado como fonte de extração do condroitim sulfato foram as vísceras de
Oreochromis niloticus (Figura 3), comercializadas na feira de São José, que ocorre no
município de Natal/RN, referente à criadouros existentes na região. As vísceras foram armazenadas sob refrigeração até o momento de seu processamento.
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Figura 3: Oreochromis niloticus (Tilápia do Nilo). Disponível em: <http://snoticias.ambientebrasil.com.brdivulgacao20180927146832-mais-competitividade-para-tilapia.html> acesso em 15/09/2019.
3.2.2 Células usadas nos experimentos
A linhagem de células escolhida para realização dos testes de citotoxicidade e quantificação de ROS foi a RAW 264.7, devido sua capacidade em reproduzir processos inflamatórios e oxidantes, ao exemplo do estresse oxidativo formado pelos radicais superóxido, estas células foram cultivadas em meio de cultura Modified Eagle Medium (DMEM), contendo 10% de soro fetal bovino e antibióticos, sendo mantidos a 36ºC, sob 5% de CO2 (Wu et al. 2017). Toda a cultura foi realizada em frascos estéreis.
Para tanto, os experimentos em cultura foram realizados em parceria com o Laboratório de Biotecnologia de Polímeros Naturais (BIOPOL), que forneceram a sala, equipamentos, células e manutenção para desenvolvimento dessa pesquisa.
3.3 Extração dos glicosaminoglicanos do Oreochromis niloticus
Inicialmente, cerca de 7kg de vísceras (in natura) de tilápia foram homogeneizadas em solução de cloreto de sódio NaCl (0,5 M) pH 8,0 e submetidas à proteólise pela ação da enzima chamada PROLAV 750 (adquirida da Prozyn indústria e Comércio Ltda), durante aproximadamente 40 horas numa temperatura de 60ºC. Ao final desse tempo a mistura proteolisada foi filtrada para separação de restos teciduais e adicionou-se a resina de troca iônica Lewatit para complexação com os glicosaminoglicanos. Esse processo foi mantido sob
agitação constante durante 24 horas em temperatura ambiente na presença de uma camada fina de tolueno, para evitar proliferação bacteriana (Andrade et al. 2013).
Ao final desse tempo, a resina foi recuperada por filtração e submetida à eluição sob agitação com concentrações crescentes de NaCl (0,5M; 0,6M; 1,0M e 3,0M) em temperatura ambiente, seguido de precipitação com 2 volumes de metanol, por 24 h à 4ºC. Em seguida, o extrato bruto de GAGs foi separado por centrifugação (8000g durante 20 minutos). A fração escolhida para futuros processos foi a que sofreu eluição com 3,0M de NaCl, descrita como a fração com maior quantidade de GAGs, resultado da forte ligação destas moléculas com a resita, por suas cargas negativas, o que torna necessário o uso de molaridades de sal mais elevadas para sua descomplexação, como mostrado por Pinto (2015), as outras frações (0,5M a 1,0M), que comportam maior quantidade de compostos contaminantes foram então descartadas.
Essa eluição deu origem a um extrato de GAG bruto denominado F-3,0M que foi submetido a outros processos de purificação. A eficácia desse procedimento foi verificada utilizando a precipitação com ácido tricloroacético (TCA) antes e após complexação, além de eletroforese em gel de agarose, que teve seu resultado comparado com o padrão de Heparina (HEP) (Andrade et al. 2013)
3.4 Purificação dos GAGs obtidos do Oreochromis niloticus
3.4.1 Fracionamento dos GAGs
Para iniciar a purificação, a F-3,0M foi inicialmente submetida ao processo de fracionamento com concentrações crescentes de acetona, onde inicialmente foi adicionado volume de acetona correspondente a 0,5:1 (v/v), seguido de precipitação sob 4ºC por 18 horas e coleta desse precipitado com centrifugação, dando origem à fração 0,5VA. Em seguida, o sobrenadante da etapa anterior recebeu adição de acetona até alcançar o volume correspondente a 0,6:1 (v/v), que foi seguido pela repetição dos procedimentos anteriores e deu origem a fração 0,6VA. Esse procedimento foi realizado também para obtenção das frações 0,7VA, 0,8VA e 1,0VA (Figura 4). Todas as amostras obtidas tiveram, posteriormente, seu perfil avaliado por eletroforese em gel de agarose sob tampão PDA (1,3 diaminopropano acetato) (Andrade et al. 2013).
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Figura 4: Esquema representativo do fracionamento com acetona. Fonte: autor.
É importante ressaltar que em todos os processos de purificação ocorrem perdas de massa das frações, isso é decorrente tanto da eliminação de contaminantes quanto pela própria metodologia.
3.4.2 Cromatografia de troca iônica
Com o intuito de isolar o condroitim sulfato, a fração de interesse 0,8VA foi inicialmente centrifugada (8000g por 20 minutos) para retirada de componentes insolúveis e em seguida submetida à cromatografia de troca iônica, utilizando a resina DEAE-Sephacel. As frações obtidas após eluição com concentrações crescentes de NaCl, respectivamente, 0,5M; 0,8M e 1,0M, foram chamadas de F:0,8VA-0,5M; F:0,8VA-0,8M e F:0,8VA-1,0M. Os eluatos obtidos foram monitorados por dosagem de urônico, seguindo o protocolo de Dische (1947), onde o carbazol gera uma reação colorimétrica mensurável por espectrofotometria sob 525nm. O padrão usado para essa reação foi o ácido D-glucurônico.
O resumo de todo o processo de extração e purificação está representado no fluxograma da Figura 5.
Figura 5: Fluxograma sobre os procedimentos de extração e purificação. Imagem própria.
3.5 Eletroforese em gel de agarose
A eletroforese é um método que discrimina os diferentes tipos de GAGs através da ordem decrescente de sua mobilidade eletroforética. Em cada uma das etapas de obtenção e purificação dos compostos, a identificação dos GAGs foi realizada através de eletroforese em gel de agarose 0,6% sob o tampão PDA, 1,3 diaminopropano acetato (Jaques, et al. 1968; Dietrich & Dietrich, 1976). Neste experimento, o perfil de migração das moléculas obtidas é comparado com uma mistura de GAGs contendo condroitim sulfato, dermatam sulfato e heparam sulfato. Nesse caso, alíquotas de 5µL foram adicionadas ao gel e submetidas à eletroforese por aproximadamente 1 hora. Em seguida o gel foi fixado em solução de brometo de centiltrimetilamônio 0,1% (CTV) seco em fluxo quente de ar e corado com azul de
35 toluidina (0,1% de ácido acético e 50% de etanol), seguidos pela descoloração com a mesma solução na ausência do azul de toluidina (Dietrich, et al. 1977).
3.6 Degradação com enzimas
Seguindo o protocolo de Yagamata e colaboradores (1968), a determinação da composição do condroitim sulfato extraído da tilápia foi realizada em parceria com a UNIFESP, sendo realizada por um método de degradação enzimática seguida pela comparação com o CS-Abovino. Para isso, 2mg/mL de CS foram digeridos com 10µL de condroitinases AC (que degradam, respectivamente, CS sulfatados nas posições 4 e 6 da galactosamina) em 40µL de tampão Tris-HCL 50mM, contendo 60mM de acetato de sódio, pH 8,0. A mistura foi incubada por 37ºC durante 18h. Após esse período a reação foi encerrada por aquecimento da mistura sob 100ºC por 2 minutos e os produtos originados dessa reação foram analisadas por SAX-HPLC, nesse caso os Δ-dissacarídeos foram eluídos com um gradiente linear de NaCl (0 - 1M) num período de 30 minutos com fluxo de 1mL.min-1 e detectados por UV a 232 nm.
3.7 Teste de citotoxicidade
Com o intuito de verificar o quanto o CS pode ser citotóxico, células RAW 264.7 (macrófagos murinos) foram usadas em teste de MTT (brometo de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolium). Elas foram cultivadas em placas estéreis (96 poços) em meio de cultura Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino, estreptomicina e penicilina. As placas foram incubadas na estufa de CO2 (5%) à 37ºC durante período suficiente para que as células estejam devidamente aderidas.
Em seguida, o meio foi removido e os resíduos celulares lavados com PBS. Então, as células (exceto do controle) foram tratadas com diferentes concentrações dos condroitim sulfato extraído da tilápia (20, 40, 100, 200, 400, 1000 e 2000 µg/mL) por 24 horas, com o objetivo de observar o efeito dessas concentrações na sobrevivência das células RAW264,7. Após esse período, a viabilidade das células foi avaliada utilizando o método de MTT, como designado por Mosman (1983). O meio foi desprezado e acrescentado 100μL de meio contendo MTT (concentração final de 5mg/mL) em cada poço. As placas foram novamente incubadas à 37°C por 4 horas. O sobrenadante foi removido e 100μL de etanol adicionados
em cada poço para solubilização dos cristais de formazan. A análise espectrofotométrica foi realizada em um leitor de microplacas de ELISA (absorbância de 570nm).
3.8 Ensaios de atividade antioxidante
3.8.1 Redução do estresse oxidativo intracelular
Para medir a geração e inibição de espécies reativas de oxigênio (ROS) intracelular em cultura de células RAW 264,7, foi realizado o ensaio com 2,7-diclorofluoresceína diacetato (DCFH-DA), específico para esse tipo de molécula, como citado por Gao (2019). Nesse experimento as células cultivadas em meio DMEM foram incubadas com LPS (2µg/mL) por 18 horas a 37ºC, em seguida o meio foi aspirado e ocorreu a adição das amostras nas concentrações de 20, 40, 100 e 200µg/mL, mantendo-se por 4 horas a 37ºC, seguindo o mesmo protocolo. Por fim os poços foram lavados com PBS e incubados com o composto DCFH-DA por uma hora, com redução de luz.
De acordo com a quantidade de ROS presentes no meio, a reação dará origem a uma maior quantidade de fluorescência, que pode ser detectado por um leitor de fluorescência no comprimento de onda azul (485nm a 535nm). Por fim, a seguinte fórmula é aplicada para determinação da porcentagem de inibição de espécies reativas:
Quantidade de ROS (%) = [(Ab2 – Ab1)/Ab1] x100
Onde Ab1 é a absorbância do controle tratado apenas com LPS e Ab2 é a absorbância das células expostas ao LPS e tratadas com compostos.
Para este experimento, as células tratadas com CS foram comparadas com um controle negativo (CN) que refere as células que não foram tratadas com LPS nem CS, não recebendo um aumento da quantidade de radicais oxidantes, e um controle-LPS, onde as células tinham os níveis de espécies reativas aumentados, porém não foram tratadas com nenhuma concentração de CS. Além disso, nesse teste e em todos os outros ensaios antioxidantes, o CS adquirido da tilápia foi também comparado com o CS de origem bovina (CS-Abovino).
37 Para verificar o tipo de espécies reativas de oxigênio que o CS é capaz de reduzir, foram feitos os testes de redução dos radicais aniônico superóxido e hidroxila.
Nesse caso, a atividade de quelação do radical hidroxil foi mensurada de acordo com o método reportado por Smirnoff (1985), com algumas modificações. Nesse caso, os poços da placa receberam adição de 50µL de sulfato ferroso 9mM (FeSO4), 50µL dos CS (nas concentrações de 20 a 200µg/mL) e 50µL de peróxido de hidrogênio 8,8mM. Para finalizar a reação, houve o acréscimo de 50µL de ácido salicílico-etanol 9mM, que permitiu que a reação fosse lida em espectrofotometria, sob absorbância de 510nm. Nesta situação, o ácido ascórbico foi usado como controle positivo e uma triplicata de poços sem a adição de CS foram utilizadas como controle negativo. A fórmula utilizada para calcular a inibição do radical hidroxila foi:
Sequestro Hidroxila (%) = [AbB-(Ab2-Ab0)]/AbB x100
Onde Ab0 é a Absorbância do controle negativo, Ab2 é a absorbância da amostra e AbB é a absorbância do Branco.
3.8.3 Sequestro do radical aniônico superóxido
Para realização do teste de sequestro de radical superóxido foi seguido o protocolo descrito por Nishikimi e colaboradores (1972), que leva em consideração a redução do tetrazólio nitroazul (NBT).
Nesse caso, a mistura da reação foi feita contendo 156µM de Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo, o tetrazólio nitroazul 156µM e metasulfato de fenazina (PMS), além das diversas concentrações de CS (20µg/mL até 200 µg/mL), totalizando 200µL em cada um dos poços, que teve sua absorbância mensurada sob 560nm. Nesse experimento, o ácido ascórbico foi usado como controle positivo novamente e um poço sem tratamento com CS foi denominado de controle negativo. A fórmula utilizada para calcular a inibição do radical superóxido foi:
Sequestro superóxido (%) = (Ab0 – Ab2)/(Ab0-AbB)
Onde Ab0 é a absorbância do controle negativo, Ab2 é a absorbância das amostras e AbB é absorbância do branco.
3.8.4 Avaliação da peroxidação lipídica
Por fim, para verificar o quanto o CS pode inibir danos causados pelas ROS às estruturas celulares, tal como as membranas lipídicas, foi feito o teste de peroxidação lipídica.
Nesse caso, o teste de inibição da peroxidação lipídica foi montado seguindo o relato de Devasagayam e colaboradores (2003). Onde foi orquestrado um sistema, em microplaca, de suspensão de gema de ovo, 10% de tampão PBS (pH: 7,4), 25µL de sulfato ferroso 0,07M. Em seguida foi feito a adição de 250µL de solução contendo concentrações de condroitim sulfato (20 a 200µg/mL) seguido de incubação por 30 min sob 37ºC. Também, a mistura recebeu adição de mais 750µL de ácido tricloroacético 20% e 750µL de ácido tiobartitúrico 0,8%, aquecendo-a por mais 15 minutos em 100ºC. Por fim a mistura foi centrifugada sob 5600g por 10 minutos e a leitura foi feito com espectrofotometria a 532nm. A fórmula usada para calcular a inibição da peroxidação lipídica foi:
Inibição Peroxidação Lipídica (%) = [1-(Ab2-Ab0)] x100
Onde Ab0 é a Absorbância do controle negativo e Ab2 é a absorbância das amostras.
3.8.5 Capacidade quelante do íon ferroso
Com o intuito de observar por qual mecanismo o CS inibe a formação das ROS (por inibição da reação de Haber-Weiss ou alguma via alternativa) foram feitos os testes de quelação dos íons metálicos que participam da reação de Haber-Weiss.
A capacidade do condroitim em quelar o íon Fe2+ foi feita através da detecção de ferrozina descrito (Borg, 1993; Wang et al. 2003). Para esse experimento, foram adicionados 100µL do CS nas concentrações de 20 µg até 200µg, em seguida houve a adição de 100µL do sulfato ferroso 0,1M. Após 5 minutos houve a adição de 100µL de ferrosina a 0,25mM, seguido pela incubação por 10 minutos, para consequente leitura sob 562nm. O controle positivo utilizado neste teste foi o EDTA 20µg/mL. Para calcular a quantidade de quelação do íon Fe2+, foi aplicada a seguinte fórmula:
Quelação de Fe2+ (%) = [Ab0-(Ab2-AbB)]/Ab0 x100
Onde Ab0 é a absorbância do Controle negativo; Ab2 é a absorbância das amostras e AbB é absorbância do Branco.
39 3.8.6 Capacidade quelante do íon cúprico
A redução do íon Cu2+ foi feita seguindo o protocolo de Megias e colaboradores (2009), esse teste se baseia na associação do cobre com o violeta de pirocatecol, que confere uma coloração acompanhável por espectrofotometria, na absorbância de 632nm. Sendo que a quantidade de cobre livre retirado da solução é proporcional à atividade redutora da molécula testada. O teste foi realizado com várias concentrações de CS (20 a 200µg/mL) e a fórmula utilizada para calcular a quelação do íon cúprico foi:
Quelação de Cu2+ (%)= [(Ab0-Ab2)/Ab0] x100
Onde Ab0 é a absorbância do controle negativo e Ab2 é a absorbância das amostras.
3.9 Análise estatística
Os dados foram inseridos no software GraphPad Prism, versão 6.0 (GraphPad Software Inc., EUA), e submetidos à Análise de Variância Univariada (ANOVA – Two Way), que foi usada para a determinação das diferenças estatísticas entre os tratamentos. Para todas as análises, os valores de P< 0,05 foram considerados estatisticamente significativos.
4 RESULTADOS
4.1 Extração e purificação do CS do Oreochromis niloticus
Os glicosaminoglicanos das vísceras de tilápia obtidos após a proteólise, complexação com resina Lewatit e descomplexação com 3,0M de NaCl (F:3,0M) foram analisados em eletroforese em gel de agarose em tampão de PDA, como mostrado na figura 6, enquanto que as frações que receberam menores molaridades de NaCl, durante a descomplexação, foram descartadas.
O perfil eletroforético mostrou compostos com migração semelhante aos três padrões de glicosaminoglicanos utilizados: condroitim sulfato (CS), dermatam sulfato (DS) e heparam sulfato (HS/Hep). Desta forma foi possível observar a obtenção de um extrato bruto de glicosaminoglicanos que em seguida, foi submetido a processos de purificação para obtenção do condroitim sulfato.
Figura 6: Perfil eletroforético de GAGs obtidos de Oreochromis inloticus. Eletroforese em sistema de tampão PDA onde a fração 3,0M de NaCl foi eluída após processo de complexação e descomplexação com resina Lewatit. OR – Origem; HS – Heparam sulfato; DS – Dermatam sulfato; CS – Condroitim sulfato e HEP – Heparina.
41 7kg, desse total, a maior parte dessa massa corresponde a água presente no organismo do peixe (aproximadamente 85%), dessa forma, cerca de 6kg são eliminados na forma de líquido, e 1,05kg correspondem a massa seca, desse total, aproximadamente 814mg correspondem à massa de glicosaminoglicanos, na F:3,0M (Tabela 3).
A F:3,0M foi submetida ao processo de fracionamento com acetona que deu origem às novas frações: F:0,5VA; F:0,6VA; F:0,7VA; F:0,8VA e F:1,0VA. Todas elas tiveram seu perfil de migração avaliado, como observado na figura 7. A partir da observação da eletroforese, foi possível evidenciar que todas as frações tiveram seu perfil de migração semelhante aos dos GAGs (CS, DS e HS). A fração F:0,8VA anteriormente estudada por Pinto (2015), apresentou maior rendimento entre as demais sub-frações sendo escolhida para seguir as etapas de purificação.
Figura 7: Eletroforese das frações obtidas após o fracionamento com acetona. Sendo possível observar as frações F:0,5VA; F:0,6VA; F:0,7VA; F:0,8VA; F:1,0VA. OR – Origem; HS – Heparam sulfato; Hep – Heparina; DS – Dermatam sulfato; CS – Condroitim sulfato.
A massa total das frações obtidas após o fracionamento com acetona foi de 675mg. Foi possível observar que a fração F:0,8VA mostrou o maior rendimento com cerca de 319mg (42%), sendo usada para os próximos testes de purificação (Tabela 3).
A F:0,8VA foi inicialmente centrifugada, eliminando uma massa insolúvel denominada como rejeito e em seguida submetida a cromatografia de troca iônica usando a DEAE-sephacel, sendo eluída nas concentrações de 0,5M, 0,8M e 1,0M de NaCl, dando
origem às frações F:0,8VA-0,5M; F:0,8VA-0,8M e F:0,8VA-1,0M. Todas elas tiveram seu perfil eletroforético comparados com os padrões de GAGs e com o padrão de condroitim sulfato extraído de traqueia bovina (CS-Abovino), como observado na figura 8. É possível evidenciar que as frações obtidas apresentaram um comportamento de migração eletroforética entre os padrões de CS e DS. Porém, o rendimento da F:0,8VA-0,8M (~77%) foi muito superior ao das demais frações , F:0,8VA-0,5M (~6%) e F:0,8VA-1,0M (~17%). Portanto, a fim de analisar a composição química e as propriedades antioxidantes do CS isolado de Tilápia, a fração isolada neste estudo, foi conduzida aos ensaios subsequentes.
Figura 8: Eletroforese das frações obtidas após a cromatografia por DEAE-sephacel. OR – Origem; HS – Heparam sulfato; Hep – Heparina; DS – Dermatam sulfato; CS – Condroitim sulfato.
A massa total obtida pela soma de todas as frações adquiridas após a cromatografia de troca iônica foi de 90mg. Entre essas amostras, a que se encontra em maior quantidade é a F:0,8VA-0,8M, que alcançou 69mg (77%) (Tabela 3).
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Tabela 3: Rendimentos da extração e purificação de GAGs das vísceras do Oreochromis niloticus. Os valores entre parênteses indicam o rendimento percentual em relação a soma total da massa obtida em cada etapa, fracionamento com acetona ou cromatografia de troca iônica.
4.2 Análise da composição dissacarídicas do CS das vísceras de tilápia
A análise dos produtos de degradação enzimática com condroitinases AC realizada sobre a F:0,8VA-0,8M revelou uma maior prevalência de dissacarídeos com sulfatação no carbono 4 da galactosamina (ΔDi4S), correspondente a 59,6% da composição total do CS das vísceras da tilápia, 36,6% de sulfatação no carbono 6 da galactosamina (ΔDi6S) e 3,4% de unidades dissacarídicas não sulfatadas (ΔDi0S), como observado na Figura 9.
Figura 9: Degradação enzimática do condroitim sulfato das vísceras da tilápia. Análise feita através de SAX-HPLC. ΔDi0S – Dissacarídeo não sulfatado; ΔDi4S – Dissacarídeo com sulfatação no carbono 4 da
galactosamina; ΔDi6S – Dissacarídeo com sulfatação no carbono 6 da galactosamina.
A partir de sua caracterização por degradação enzimática, foi possível observar que a fração F:0,8VA-0,8M é composta por em maioria por dissacarídeos sulfatados apenas na posição 4 da galactosamina, dessa forma ela foi nomeada de CS-Atilapia, visto que ela pode ser classificada como CS do tipo A. em seguida a amostra foi encaminhada para os testes de citotoxicidade e antioxidante.
4.3 Viabilidade Celular
Para verificar o efeito citotóxico do CS-Atilapia sobre as células RAW 264.7, foi realizado o ensaio de MTT em microplaca utilizando várias concentrações do composto (20, 40, 100, 200, 400, 1000 e 2000µg/mL). Quando comparado com o controle negativo, foi possível observar que o condroitim sulfato da tilápia não apresentou citotoxicidade para as células tratadas até a concentração de 200µg/mL (Figura 10), mantendo a sobrevivência celular próxima de 95%. Por outro lado, as concentrações de 400, 1000 e 2000µg/mL resultaram numa redução da taxa de viabilidade para 61, 68 e 67%, respectivamente (p<0,001).
Figura 10: Avaliação da citotoxicidade em cultura de células RAW 264.7. CS-Atilapia: Condroitim sulfato da
tilápia, CN- controle negativo (células + meio de cultura). As letras significam diferença estatística (p<0,001) pela ANOVA.
Por esse motivo, foi definido que os experimentos futuros seriam focados nas concentrações com baixo efeito citotóxico para às células RAW 264.7 (20, 40, 100 e 200µg/mL), enquanto que as concentrações mais altas seriam excluídas dos testes subsequentes.
45 4.4.1 Inibição das espécies reativas de oxigênio em células
O ensaio do DCFH-DA quantifica o nível de quaisquer espécies reativas de oxigênio produzida na célula e o quanto uma determinada amostra pode alterar esse balanço. O parâmetro usado para expressar o resultado deste teste foi a quantidade de fluorescência presente no meio onde estão as células, visto que ela é diretamente proporcional a quantidade ROS naquele poço de cultura. Para isso foi observado o quanto as amostras são capazes de inibir a expressão de ROS nas concentrações de 20, 40, 100 e 200µg/mL, comparando este resultado com o controle negativo (CN) e com o Controle-LPS, que são células que sofreram estímulo estressante, porém sem nenhum tratamento com CS. Para construção do gráfico, o Controle-LPS foi tratado como 100% da expressão de ROS no sistema (Figura 11).
Figura 11: Inibição das espécies reativas de oxigênio em meio intracelular. Realizada em cultura de células RAW 264,7. CS-Atilapia: condroitim sulfato da tilápia, CS-Abovino: condroitim sulfato bovino, CN: Controle
Negativo (células e meio de cultura) e Controle-LPS: Células tratadas com o LPS. As letras indicam diferenças estatísticas pelo teste ANOVA (p<0,001).
O CS-Abovino também teve sua atividade mensurada e comparada com o CS-Atilapia nos testes antioxidantes, com o objetivo de observar as diferentes atividades entre essas duas origens de condroitim sulfato.
Por intermédio dos dados obtidos foi possível evidenciar que tanto o CS-Atilapia quanto o CS-Abovino foram capazes de inibir significantemente a expressão de ROS intracelular em todas as concentrações testadas, diferindo do controle-LPS (p<0,001), alcançando níveis de
