DISCUSSÃO

6. DISCUSSÃO

6. DISCUSSÃO

As polimixinas constituem, frequentemente, a única opção terapêutica para o tratamento de infecções causadas por P. aeruginosa e A. baumannii resistentes aos carbapenens. Embora a resistência às polimixinas ainda seja baixa nessas espécies, ela tem se tornado mais frequente em amostras de K. pneumoniae produtoras de KPC e a compreensão dos seus mecanismos de resistência é de fundamental importância visto que não há, a um curto prazo, nenhuma droga sendo desenvovolvida pela industria farmacêutica que seja efetiva contra esses patógenos (Gales et al., 2011).

Nos últimos anos, diferentes estudos vem tentando determinar o mecanismo de resistência às polimixinas (Cai et al., 2012). Como amostras clínicas de P. aeruginosa e

A. baumannii resistentes à polimixina são raramente isoladas pelos laboratórios de

microbiologia em pacientes que não foram expostos à polimixina, a maioria dos estudos que avalia os mecanismos de resistência às polimixinas se utilizaram de isolados clínicos de A. baumannii sensíveis às polimixinas que tiveram a resistência a este agente induzida in vitro ou em cepas de P. aeruginosa, isoladas de pacientes com fibrose cística, que receberam polimixina por tempo prolongado no tratamento e/ou profilaxia de infecção crônica (Moffat et al., 2010; Arroyo et al., 2011; Beceiro et al., 2011; Moffat et al., 2011; Moskowitz et al., 2012).

Dois fenótipos distintosde resistência às polimixinas tem sido observado, sendo o primeiro decorrente da indução pela presença da droga e um segundo fenótipo de resistência “natural”, não correlacionado com a exposição prévia às polimixinas. Geralmente, isolados com resistência induzida às polimixinas atingem CIMs elevadas, acima de 128 µg/mL. Diferente disso, o fenótipo de resistência apresentado por isolados que não foram expostos à polimixina, possui CIMs próximas ao ponto de corte de resistência estabelecido pelo CLSI, ≥ 8 µg/mL (CLSI, 2012). Os isolados selecionados para este estudo possuíam essas características. O isolado com resistência induzida (A027) apresentou CIM > 64 µg/mL à polimixina B, enquanto o isolado com resistência “natural” (A009) apresentou uma CIM de 16 µg/mL para esse antimicrobiano. O isolado

clínico de A. baumannii que apresentou resistência à polimixina B, foi selecionado por apresentar sensibilidade aos outros antimicrobianos e, também por ter sido isolado de um paciente que não havia recebido previamente polimixinas em seu tratamento e, desta maneira, minimizar a chance de que tivesse havido indução de resistência às mesmas.

Em nosso estudo, o isolado clínico de A. baumannii sensível à polimixina B (A027) apresentou, inicialmente, resistência aos β-lactâmicos, aminoglicosídeos e quinolonas. Além da polimixina B, esse isolado apresentou sensibilidade somente à tigeciclina. De acordo com estudos do programa de vigilância “SENTRY antimicrobial surveillance programme”, esse isolado representa o perfil de sensibilidade encontrado em muitas regiões do mundo entre isolados de A. baumannii (Yau et al., 2009; Gales et al., 2011).

Em nosso estudo, a resistência à polimixina B induzida no isolado A027ind se mostrou estável, já que, mesmo após vários subcultivos em meio de cultura sem a adição de sulfato de polimixina B a resistência foi mantida. Resultados semelhantes foram observados em isolados clínicos de A. baumannii in vivo, durante terapia com colistina e mesmo após diversos cultivos na ausência do antimicrobiano, seu fenótipo de sensibilidade também não foi recuperado. (Rodrigues et al., 2009). Diferente do fenômeno que ocorre com isolados de A. baumannii, Moskowitz et al. (2012) mostrou que isolados de P. aeruginosa que foram submetidos ao cultivo na presença de colistina, reverteram seu fenótipo de sensibilidade quando cultivados na ausência da droga.

Em nosso estudo foi observado que, ao mesmo tempo em que a resistência à polimixina B foi desenvolvida pela indução devido à pressão seletiva exercida pelo antimicrobiano, o isolado mutante resultante dessa indução, A027Ind, passou a apresentar sensibilidade a outros antimicrobianos aos quais era, anteriormente, resistente, entre eles os β-lactâmicos e os aminoglicosídeos. Assim como o desenvolvimento de resistência à polimixina B, o perfil de sensibilidade aos β-lactâmicos também foi estável no isolado A027Ind, sugerindo uma desestruturação irreversível da parede celular, que poderia ter facilitado a ação dos outros antimicrobianos. Essa mudança no perfil de sensibilidade pode fazer com que essas amostras não sejam

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detectadas nos laboratórios de microbiologia, pois esses pacientes geralmente utilizam outros antimicrobianos em associação com polimixinas.

Estudos clínicos têm sugerido a associação de polimixina B com outros antimicrobianos para o tratamento de infecção por A baumannii multirresistentes (MDR). Relatos de sucesso terapêutico em casos, onde houve a utilização de colistina em associação com rifampicina ou amicacina para infecções respiratórias e de corrente sanguínea por A. baumannii MDR levaram foram publicados e incentivaram ainda mais estudos de sinergismo entre esses antimicrobianos (Fulnecky et al., 2005; Petrosillo et

al., 2005; Biancofiore et al., 2007; Bassetti et al., 2008; Song et al., 2008). Estudos mais

recentes têm descrito a associação dos carbapenens, imipenem, meropenem e, mais recentemente, doripenem, além de tigeciclinacom colistina com boa resposta clínica para o tratamento de infecções por A. baumannii multirresistentes (Principe et al., 2009; Candel et al., 2010; Pankuch et al., 2010; Rodriguez et al., 2010; Hornsey et al., 2011; Santimaleeworagun et al., 2011; Sheng et al., 2011; Shields et al., 2011; Peck et al., 2012). A desestruturação observada no isolado A027ind poderia justificar em parte o sucesso do sinergismo entre as polimixinas e outras classes de antimicrobianos. Essa desestruturação da parede poderia favorecer a entrada dos outros antimicrobianos. Entretanto, em nosso estudo não foi observada redução nas CIM para quinolonas no isolado A027Ind, possivelmente pelo fato de que o mecanismo de ação e resistência a esses agentes são relacionados à síntese de DNA bacteriano e não com a parede celular (Sheng et al., 2009).

Além da restituição da sensibilidade aos carbapenens, estudos têm demonstrado que bactérias Gram negativas com resistência induzida às polimixinas podem tornar-se sensíveis até mesmo a antimicrobianos aos quais apresenta resistência intrínseca, entre eles a vancomicina (Gordon et al., 2010), devido ao aumento da permeabilidade do envoltório celular, facilitando o acesso da vancomicina ao seu sítio de ligação na membrana celular interna bacteriana.

O isolado A027 apresentou resistência aos β-lactâmicos devido à produção de carbapenemase OXA-23, provavelmente associada a ISAbaI. Mesmo após a indução de resistência à polimixina B e a alteração do fenótipo de sensibilidade aos β-lactâmicos, esses genes ainda estavam presentes no isolado A027Ind, o que indica que essa reversão de sensibilidade aos diversos antimicrobianos não foi devido à perda de plasmídios ao longo dos vários subcultivos para indução de resistência à polimixina B, mas, possivelmente pela perda da integridade da parede celular bacteriana. Outra observação realizada em nosso estudo e que reforça essa hipótese, é o fato de que somente o isolado A027Ind não conseguiu sobreviver em meio hipotônico, sugerindo uma fragilidade maior em sua parede celular após o cultivo na presença de polimixina B.

Moffat et al. (2010) sugerem a diminuição da integridade da parede celular de isolados de A. baumannii submetidos à indução de resistência à colistina em laboratório devido à perda total de LPS, por meio de espectrometria de massa. Mutações nos genes que catalisam a síntese do LPS foram observadas, o que justificaria a perda total do LPS bacteriano nesses isolados. Em outro estudo, esses mesmos autores descreveram uma seqüência de inserção ISAba11 nos genes que codificam a síntese de LPS, lpxA e lpxC, que justificaria os resultados obtidos no primeiro estudo (Moffat et al., 2011). Esses autores também relacionam a inativação desses genes com a alteração do perfil de sensibilidade aos outros antimicrobianos. Mais experimentos são necessários para determinar se nossos isolados resistentes à polimixina B sofreram mutações nos genes que codificam o LPS.

Pela metodologia de MET, foi observada uma deposição de “grânulos” na porção intracelular da membrana interna em ambos isolados submetidos à indução de resistência à polimixina B. Por essa metodologia não foi possível observar diferenças na integridade da parede celular no isolado A027Ind, que possam ter provocado as alterações observadas no perfil de sensibilidade. Entretanto, foi observado um espessamento de parede celular no isolado com resistência “natural” à polimixina B. Essa

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observação sugere que o mecanismo observado no fenótipo de resistência “natural” às polimixinas é diferente do mecanismo observado no fenótipo de resistência induzida a esses antimicrobianos.

Em estudos anteriores, experimentos com microscopia eletrônica de varredura e microscopia de força atômica mostraram diferenças na topografia e rugosidade da superfície celular de A. baumannii em isolados com resistência in vitro à colistina (Gordon

et al., 2010; Soon et al., 2011a). Soon et al. (2009) observaram que a natureza e o grau

de dano na parede celular de isolados de A. baumannii submetidos ao tratamento com colistina foi similar na fase estacionária e logarítmica da curva de crescimento bacteriano. Esses autores analisaram a superfície celular desses isolados em baixas (4 µg/mL) e elevadas (32 µg/mL) concentrações de colistina. O tratamento com 4 µg/mL de colistina promoveu o aparecimento de pequenas cavidades ao longo da superfície celular bacteriana e aumento da rugosidade, mas a forma celular foi mantida. Eles também observaram diferenças na topografia celular e presença de debris ao longo de algumas células após o tratamento com colistina. Na presença de 32 µg/mL, os isolados de A.

baumannii apresentaram uma superfície mais lisa à inspeção visual. Além disso, o

número de células foi reduzido e apresentaram uma tendência em formar “clusters”. Moffat et al. (2011) também observaram diferenças na integridade das membranas de isolados sensíveis e resistentes in vitro à colistina, utilizando provas de fluorescência para superfícies hidrofóbicas, sugerindo a modificação estrutural da parede celular bacteriana após o contato com o antimicrobiano.

A molécula de polimixina B é carregada positivamente e, por isso, possui alta afinidade pela superfície celular bacteriana negativa. A redução nessa carga diminui a afinidade desses agentes antimicrobianos pela célula bacteriana, desenvolvendo resistência aos mesmos. O mecanismo de espessamento de parede é conhecido em isolados de Staphylococcus aureus quando apresenta resistência à vancomicina, um antimicrobiano da classe dos glicopeptídeos que age na parede celular, se ligando à porção D-Ala-D-Ala dos resíduos de mureína, inibindo a síntese do peptideoglicano pelas

PBPs presentes na membrana interna da célula bacteriana. A parede mais espessa age como uma barreira para a vancomicina atingir seu sítio alvo (Sanyal e Greenwood, 1993; Norazah et al., 2009). No entanto, não foi encontrada na literatura a relação entre espessamento de parede e resistência às polimixinas. Devido ao mecanismo de ação das polimixinas ser por alteração eletrostática na parede celular bacteriana, sugerimos que o espessamento de parede observado no isolado resistente à polimixina B poderia ter levado a uma redução da carga negativa da membrana celular de A. baumannii ou uma maior dificuldade para o antimicrobiano em atingir o LPS bacteriano. Segundo Nikaido et

al. (2003), microrganismos com hiperprodução de cápsula polissacarídica podem não

apresentar a porção antígeno O do LPS na parede celular bacteriana, dessa forma, a parede celular poderia apresentar uma superfície com carga menos negativa.

Diversos estudos tem demonstrado a participação de sistemas de dois componentes na regulação do desenvolvimento de resistência às polimixinas (Adams et

al., 2010; Arroyo et al., 2005; Moskowitz et al., 2004). Em isolados de A. baumannii é

encontrado o sistema PmrAB que envolve a participação da proteína PmrC para adição de fosfoetanolamina no lipídio A, promovendo modificações no LPS bacteriano e consequente alteração no sítio de ligação das polimixinas (Miller et al., 2011; Beceiro et

al., 2011; Moskovitz et al., 2012).

Estudos mais recentes demontraram que mutações no gene pmrB tem levado ao desenvolvimento de resistência às polimixinas em isolados de A. baumannii e P.

aeruginosa (Adams et al., 2011; Moskowitz et al., 2012). Nossos isolados de A. baumannii foram submetidos ao sequenciamento dos genes que compõe o sistema de

dois componentes PmrAB e foram encontradas alterações no gene pmrB no isolado A027Ind, com resistência induzida. Essas alterações não foram observadas no isolado com resistência “natural”.

Para verificar alterações que possam ser promovidas por essa mutação, realizamos análise da transcrição desses genes por qRT-PCR. Foram detectados diferentes níveis de transcrição entre o isolado que apresentou resistência induzida e

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àquele que já apresentava resistência “natural”. Quando o isolado sensível foi submetido ao cultivo na presença de polimixina B (A027Ind), foi observado um aumento da transcrição do gene pmrA, que foi ativado pelo sensor quinase pmrB, que, por sua vez, apresentou uma redução da transcrição após a indução. A proteína PmrB é a mais externa do sistema e tem função de sensor quinase, que reconhece fatores ambientais e desencadeia a expressão do sistema, neste caso, a presença da polimixina B no meio (Miller et al., 2011). Essa redução da transcrição de pmrB pode ter sido devido à desestruturação da parede celular bacteriana em decorrência da localização dessa proteína ou mesmo devido à auto-regulação do sistema de dois componentes. Os resultados de transcrição de PmrAB nos isolados sensível e seu mutante com resistência induzida à polimixina B estão de acordo com resultados já observados por Baceiro et al. (2011).

Diferente do isolado A027Ind, a transcrição de pmrB no isolado com resistência “natural” à polimixina B, A009, estava elevada em relação ao isolado sensível A027. No entanto, a transcrição desse gene não resultou na ativação de pmrA nesse isolado, nem em seu respectivo mutante induzido, reforçando nossa hipótese de que a resistência “natural” às polimixinas envolve outro mecanismo de regulação gênica. Não foi observada mutação no gene pmrA, que pudesse justificar a dimiuição da transcrição nesse isolado.

Em um estudo de Adams et al. (2011), a deleção do gene pmrB, promoveu a perda do perfil de resistência induzida à colistina. No entanto, Moskowitz et al. (2012) afirmam que a resistência à colistina mediada por PmrB é dependente de PmrA, pois a indução de resistência não foi capaz de ser atingida no isolado com deleção do gene

pmrA, mesmo após ativação de pmrB. Dessa forma, podemos afirmar que a resistência

observada no isolado A009 não estava sendo regulada pelo sistema PmrAB, diferente do observado com o isolado A027Ind. Entretanto, mais estudos são necessários para determinar o mecanismo que está envolvido no fenótipo de resistência “natural” à polimixina B (Andrews et al., 2002; Arroyo et al., 2011; Miyazaki et al., 2009; Moskowitz et

Alterações no LPS da parede celular bacteriana, com adição de 4-aminoarabinose e fosfoetanolamina no lipídio A tem sido descritas (Miller et al., 2011; Moskowitz et al., 2011; Arroyo et al., 2011). Segundo Adams et al. (2011), essas alterações modificam a natureza do LPS, tornando-o mais hidrofílico. As polimixinas são antimicrobianos detergentes, dessa forma, possuem natureza lipofílica. Essas alterações promovidas pela indução de resistência promovem diminuição da interação da droga com as membranas celulares bacterianas. O mecanismo de ação das polimixinas envolve interação com as cargas negativas da parece celular bacteriana. De acordo com Soon et al. (2011b), os isolados clínicos de A. baumannii, assim como ATCC 19606, apresentaram diminuição na carga negativa da membrana quando foram submetidos ao cultivo na presença de polimixina B e colistina, reduzindo a interação do antimicrobiano pela superfície celular. Dessa forma, experimentos de mensuração de cargas de superfície ainda são necessários para esclarecimento das alterações sofridas pelos isolados de A. baumannii avaliados neste estudo. Esses mecanismos de resistência descritos até o momento correspondem ao fenótipo adaptativo de resistência às polimixinas.

Como a desestruturação da parede celular poderia interferir com o mecanismo de ação e resistência de outros antimicrobianos que agem na síntese de parede celluar, avaliamos os mecanismos de resistência a beta-lactâmicos nos isolados expostos à polimixina B, estudamos mecanismos de resistência conhecidos, envolvidos com a parede celular bacteriana. Por experimentos de qRT-PCR, foi observada uma redução na expressão do sistema de efluxo AdeABC no isolado induzido A027Ind em relação à sua cepa parental sensível. O sistema de efluxo atua na resistência aos β-lactâmicos por ejetar da célula bacteriana os antimicrobianos e, também, as enzimas β-lactamases produzidas no espaço periplasmático da mesma, as quais vão atuar sobre o antimicrobiano e reduzir sua atividade na célula (Rosenfeld et al., 2012). Estudos sugerem que a enzima OXA-23 atue em associação com a hiperexpressão do sistema de efluxo AdeABC, para que sua ação seja significativa no perfil de resistência aos carbapenens em isolados de A. baumannii (Lee et al. 2010). Dessa forma, a diminuição

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da expressão desse sistema de efluxo pode estar associada com perfil de sensibilidade aos carbapenens observado no isolado A027Ind, após a indução de resistência à polimixina B.

Análises de porinas mostraram alterações em suas transcrições nos isolados de

A. baumannii, antes e após a indução de resistência à polimixina B. Vila et al. (2007) citou

em seu estudo que os resultados observados sugeriam a modificação na expressão da porina OmpW em isolados mutantes de A. baumannii com resistência à polimixina B induzida em laboratório. Essa observação foi confirmada em nosso estudo pelos experimentos de qRT-PCR e SDS-PAGE de proteínas de membrana externa. A porina OmpW teve uma redução na sua expressão após o cultivo na presença de polimixina B. A porina OmpW possui natureza hidrofóbica e é relacionada à osmorregulação bacteriana (Xu et al., 2005; Berg et al., 2004). Hong et al. (2006) observaram uma alta afinidade de uma molécula detergente, utilizada na extração de proteínas de membrana externa, pela porina OmpW. A molécula de polimixina possui natureza detergente, dessa forma, a diminuição da expressão de OmpW, pode contribuir para a redução da afinidade de antimicrobianos dessa classe pela superfície celular bacteriana, contribuindo para o aumento da resistência. Já a diminuição da expressão da porina CarO tem sido relacionada com o aumento da resistência aos carbapenens (Vila et al., 2007). O isolado com resistência induzida à polimixina, A027Ind, que se tornou sensível aos β-lactâmicos após a indução de resistência à polimixina B, apresentou aumento da expressão das porinas OmpA e CarO após à exposição ao antimicrobiano. Esse aumento de expressão, assim como a diminuição da expressão do sistema de efluxo AdeABC, pode ter contribuído para o perfil de sensibilidade exibido por esse isolado após a indução de resistência à polimixina B. Os outros resultados de transcrição de porinas por qRT-PCR e expressão dessas proteínas no gel de SDS-PAGE não puderam ser relacionados, provavelmente, por alguma particularidade das técnicas que não foram controladas em nosso estudo. Esses resultados necessitam de maiores análises posteriores.

Para verificar o mecanismo utilizado para promover o espessamento de parede observado no isolado com resistência “natural” à polimixina B, estudamos possíveis alterações nas PBPs dos isolados de A. baumannii. As PBPs são proteínas presentes na membrana interna da parede celular bacteriana e são responsáveis pela síntese e organização do peptideoglicano na parede celular, promovendo a manutenção da forma celular por gerações seguintes (Sauvage et al., 2008). Em nosso estudo, foram sequenciados os genes que codificam as PBPs de alto peso molecular, de classe A, PBP1a e PBP1b, que exercem função de transpeptidases e transglicosilases. Também foram sequenciadas as PBPs de classe B, PBP2 que desempenha o papel de elongase e PBP3 que está envolvida no processo de divisão celular (Sauvage et al., 2008).

As PBPs de classe A, 1a e 1b, possuem função de transglicosilação, catalisando a polimerização de cadeias de glicano e, função de transpeptidação promovendo a ligação cruzada entre as cadeias de glicano através das cadeias laterais de pentapeptídeo (Sauvage et al., 2008). Sauvage et al. (2008) afirmam que na inativação de uma das duas proteínas, a outra substitui sua função na síntese de peptideoglicano para manutenção da atividade da célular bacteriana. As PBPs de classe B, PBP3 e PBP4 possuem função de elongase e divisão celular, respectivamente. É sabido que alterações nessas PBPs promovem redução da afinidade da superfície celular por β-lactâmicos, levando à resistência aos mesmos (Sauvage et al., 2008).

Yun et al. (2011) relata a participação da PBP1a, PBP3 e PBP5 de A. baumannii, associada com outros mecanismos de resistência como hiperexpressão de sistemas de efluxo AdeABC e AdeIJK, além de produção de β-lactamases, na diminuição da sensibilidade dessa especíe aos β-lactâmicos. No entanto, não existe na literatura relatos da relação entre modificações de PBPs e perfil de resistência às polimixinas. Cayô et al. (2011) observaram que a maioria das mutações encontradas nos genes que codificavam as PBPs de alto peso molecular foram silenciosas não gerando alterações de aminoácido. Estes autores observaram que estas mutações sempre ocorriam nas mesmas posições (prováveis “Hot Spot Mutations”) e estavam mais relacionadas ao perfil

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clonal do que a resistência aos β-lactâmicos, uma vez que essas mesmas mutações também estavam presentes nas cepas sensíveis. O mesmo foi observado para a cepa sensível e seu mutante induzido em nosso estudo. Entretanto, um grande número de mutações foi observado para a cepa resistente e seu mutante induzido, incluindo alterações no “frame” de leitura no final da PBP1a, além de uma mutação ocorrida no quinto motivo conservado do sítio de transpeptidação da PBP1b dessas cepas. Tais

No documento Dedico este estudo aos meus pais Valcir Girardello e Maria Rossi (páginas 78-91)