RAQUEL GIRARDELLO
AVALIAÇÃO DOS MECANISMOS DE RESISTÊNCIA À POLIMIXINA B EM ISOLADOS CLÍNICOS DE Acinetobacter baumannii
Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo - Escola Paulista de Medicina, para obtenção do Título de Doutor em Ciências.
São Paulo 2012
RAQUEL GIRARDELLO
CARACTERIZAÇÃO DOS MECANISMOS DE RESISTÊNCIA À POLIMIXINA B EM ISOLADOS CLÍNICOS DE Acinetobacter baumannii
Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo - Escola Paulista de Medicina, para obtenção do Título de Doutor em Ciências.
Orientadora: Professora Dra. Ana Cristina Gales
São Paulo 2012
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA
DISCIPLINA DE INFECTOLOGIA
Chefe do Departamento:
Professor Dr. Álvaro Nagib Atala
Coordenador do curso de Pós-graduação:
Professor Dr. Ricardo Sobhie Diaz
São Paulo 2012
RAQUEL GIRARDELLO
CARACTERIZAÇÃO DOS MECANISMOS DE RESISTÊNCIA À POLIMIXINA B EM ISOLADOS CLÍNICOS DE Acinetobacter baumannii
Presidente da Banca:
Profª Drª Ana Cristina Gales
Banca Examinadora:
Prof. Dr. Alexandre Prehn Zavascki Profª Drª Silvia Figueiredo Costa
Prof. Dr. Guilherme Henrique Campos Furtado Prof. Dr. Nilton Lincopan
Suplentes:
Prof. Dr. Antônio Carlos Campos Pignatari Profª Drª Anna Sara Shafferman Levin
São Paulo 2012
Girardello, Raquel
Avaliação dos mecanismos de resistência à polimixina B entre isolados clínicos de Acinetobacter baumannii. Raquel Girardello - São Paulo, 2012. vi. 137 f.
Tese (Doutorado) - Universidade Federal de São Paulo. Escola Paulista de Medicina. Programa de Pós-graduação em Ciências Básicas em Infectologia.
Título em inglês: Evaluation of mechanisms of resistance to polymyxin B in Acinetobacter baumannii clinical isolates.
1. Polimixinas; 2. Acinetobacter baumannii; 3. Lipopolissacarídeo; 4. Two component systems; 5. Parede celular.
DEDICATÓRIA DEDICATÓRIA DEDICATÓRIA DEDICATÓRIA
Dedico este estudo aos meus pais Valcir Girardello e Maria Rossi
Girardello pela imensa dedicação e auxílio para minha formação pessoal e
profissional e, em agradecimento por acreditarem sempre, independente de
qualquer dificuldade, no meu crescimento e sucesso.
AGRADECIMENTOS
Agradeço à minha orientadora Drª Ana Cristina Gales, pela oportunidade oferecida e pelo exemplo de dedicação, inteligência e esforço que levarei comigo para o resto de minha vida.
Agradeço a toda a minha família, em especial meus pais Valcir Girardello e Maria Rossi Girardello e meu irmão e cunhada Ricardo Girardello e Susana Vassoller por estarem sempre de braços abertos a espera toda vez que eu precisar. Vocês são a força que me faz seguir em frente cada vez mais.
Agradeço à Professora Drª Maria Cristina Brognharo Tognin pela confiança e pelo auxílio e indicação ao laboratório ALERTA, essenciais para que este trabalho tenha sido realizado.
Agradeço ao Professor Dr. Antonio Carlos Campos Pignatari pelo grande exemplo de vida que nos oferece sempre nos lembrando da importância de nossos estudos na vida de pacientes com os quais ele e outros médicos convivem diariamente pelos hospitais do Brasil e do mundo.
Agradeço a Tiago Massao Yamanaka pelo grande auxílio durante a realização desta tese, na parte experimental e na formatação deste documento, além da pronta disponibilidade para suporte em todos os momentos durante o decorrer da minha formação.
Um agradecimento especial ao colega de laboratório e amigo Rodrigo Cayô, pela dedicação e auxílio técnico e científico nos experimentos desta tese, em especial os experimentos de PBPs e porinas.
Agradeço aos colegas de laboratório Talita Trevizani Rocchetti, Paulo José Martins Bispo e Liana Carballo de Menezes pelo grande auxílio nos experimentos de PCR em Tempo Real.
Agradeço à Cecilia Godoy Carvalhaes e André Mario Doi pelas correções deste trabalho e pela amizade e sempre pronta disponibilidade.
Agradeço ao Centro de Microscopia Eletrônica da UNIFESP, em especial aos funcionários André Aguillera e Márcia Tanakai e à Professora Drª Edna Haapalainen pelos experimentos de microscopia eletrônica de transmissão deste estudo.
Agradeço a toda a família LEMC-ALERTA pela convivência nesses quatro anos de estudos, de confraternizações, alegrias e tristezas, muitas risadas e muito trabalho e, principalmente, muitas amizades criadas. Levarei todos vocês sempre no meu coração.
Agradeço à secretária do laboratório Rosana Capecce pela amizade e auxílio em diversos momentos.
Agradeço à Professora Dra Halha Ostrensky Saridakis por todo cuidado e ensinamentos durante a realização do mestrado, na Universidade Estadual de Londrina.
E, por fim, mas não menos importante, um agradecimento muito especial aos meus orientadores de iniciação científica, durante a graduação na Universidade de Passo Fundo, Professor Dr. Luiz Carlos Kreutz e Professora Dra. Laura Beatriz Rodrigues por me ensinarem o caminho da microbiologia, ensinamentos esses que carrego comigo até hoje e nunca serão esquecidos.
SUMÁRIO
Índice de Tabelas... i
Índice de Figuras... ii
RESUMO... iv
ABSTRACT... vi
1. INTRODUÇÃO... 01
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA... 04
2.1 Acinetobacter baumannii... 05
2.2 Opções terapêuticas e mecanismos de resistência... 06
2.2.1 β-lactâmicos... 06
2.2.1.1 Produção de enzimas β-lactamases... 07
2.2.1.2 Alteração de porinas... 09
2.2.1.3 Hiperexpressão de sistemas de efluxo... 10
2.2.1.4 Alterações de PBP... 12
2.2.2 Polimixinas... 14
2.2.2.1 Mecanismos de resistência às polimixinas... 17
3. OBJETIVOS... 26
4. MATERIAL E MÉTODOS... 28
4.1 Fluxograma... 29
4.2 Seleção dos isolados bacterianos... 30
4.3 Indução de resistência à polimixina B... 31
4.4 Estabilidade da resistência induzida à polimxina B... 32
4.5 Análise da similaridade genética por PFGE... 32
4.6 Teste de sensibilidade aos antimicrobianos... 33
4.7 Microscopia eletrônica de transmissão... 36
4.8 Cultivo em meio hipotônico... 36
4.9 Sequenciamento do sistema de dois componentes PmrAB... 37
4.10 PCR em Tempo Real para quantificação da transcrição do sistema de dois componentes PmrAB... 38
4.10.1 Extração de RNA Total e síntese de cDNA... 38
4.10.2 Quantificação relativa da transcrição gênica... 39
4.10.3 Análise da quantificação relativa da transcrição gênica... 39
4.11 Associação de resistência às polimixinas com mecanismos de resistência relacionados à parede celular bacteriana... 40
4.11.1 Avaliação de proteínas de membrana externa... 40
4.11.1.1 Extração de proteínas de membrana externa... 40
4.11.1.2 Avaliação do perfil de proteínas de membrana externa por SDS-PAGE... 41
4.11.1.3 Quantificação relativa da transcrição dos genes que codificam porinas... 42
4.11.2 Quantificação relativa da transcrição do gene adeB, que codifica a proteína estrutural do sistema de efluxo AdeABC... 42
4.11.3 Sequenciamento dos genes que codificam as PBPs... 42
5. RESULTADOS... 45
5.1 Caracterização dos isolados de A. baumannii... 45
5.2 Perfil de sensibilidade aos antimicrobianos... 46
5.3 Estabilidade da indução de resistência à polimixina B... 48
5.4 Análise da similaridade genética... 48
5.5 Microsopia Eletrônica de Transmissão (MET)... 49
5.6 Cultivo em meio hipotônico... 50
5.7 Sequenciamento dos genes que compõem o sistema regulatório de dois componentes PmrAB... 51
5.8 Quantificação relativa da transcrição do sistema regulatório de dois
componentes PmrAB... 51
5.9 Avaliação da influência de resistência à polimixina B em mecanismos relacionados à parede celular bacteriana... 52
5.9.1 Expressão de Proteínas de Membrana Externa... 52
5.9.2 Quantificação relativa da transcrição da bomba de efluxo AdeABC.... 55
5.9.3 Alterações nas PBPs... 56
6. DISCUSSÃO... 59
7. CONCLUSÕES... 72
8. REFERÊNCIAS... 74
9. ANEXOS... 98
i ÍNDICE DE TABELAS
Tabela 1. Sequências de oligonucleotídeos iniciadores utilizados para as reações de PCR e sequenciamento... 43 Tabela 2. Seqüências de oligonucleotídeos iniciadores utilizados para reações PCR em tempo real... 44 Tabela 3. Padronização da curva de melting para cada gene submetido à PCR
em tempo real... 44 Tabela 4. Isolados sensíveis e resistentes à polimixina B, selecionados para o
estudo, antes e após o cultivo na presença de polimixina B... 46 Tabela 5. Perfil de sensibilidade de isolados A. baumannii sensíveis e resistentes às polimixinas, antes e após a indução de resistência com sulfato de polimixina
B... 47 Tabela 6. Perfil de sensibilidade à polimixina B durante o cultivo na ausência da droga, após a indução de resistência... 48 Tabela 7. Mutações dos genes que codificam as PBP de alto peso molecular nos isolados de A. baumannii antes e após o cultivo na presença de sulfato de
polimixina B... 58
ii ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Estrutura química das moléculas de polimixinas... 15 Figura 2. Estrutura química do sulfato de colistina e colistimetato de sódio... 16 Figura 3. Desenho esquemático da parede celular bacteriana de bactérias Gram negativas... 18 Figura 4. Esquema da regulação do desenvolvimento de resistência às
polimxinas por isolados de Enterobactérias controlado por sistemas de dois
componentes... 21 Figura 5. Desenho esquemático do sistema de dois componentes que regula o
desenvolvimento de resistência à polimixinas em isolados de A. baumannii... 23 Figura 6. Desenho esquemático das passagens de subcultivos na presença de concentrações crescentes de sulfato de polimixina B para a indução de
resistência à mesma, nos isolados de A. baumannii... 32 Figura 7. Desenho esquemático da distribuição das concentrações de polimixina B na placa de microdiluição em caldo... 36 Firgura 8. Desenho esquemático da placa de microdiluição em caldo (TREK
Diagnostics) utilizada para avaliação da sensibilidade aos antimicrobianos... 36 Figura 9. Perfil de similaridade genética pela metodologia de PFGE... 50 Figura 10. Microscopia eletrônica de transmissão de isolados clínicos de A.
baumannii, cultivados na presença e ausência de polimixina B... 51 Figura 11. Quantificação relativa da transcrição dos genes do sistema regulatório de dois componentes PmrAB nos isolados de A. baumannii... 53 Figura 12. Quantificação relativa da transcrição dos genes que codificam as
porinas dos isolados de A. baumannii antes e após o cultivo na presença de polimixina B...
55
iii Figura 13. Gel de SDS-PAGE das proteínas de membrana externa (OMPs) dos
isolados clínicos e os mutantes induzidos de A. baumannii... 56 Figura 14. Quantificação da transcrição relativa do gene adeB para os isolados de A. baumannii, antes e após o cultivo na presença de polimixina B... 57
iv RESUMO
A. baumannii é um agente etiológico frequente de infecções relacionadas à assistência à saúde no Brasil, pois possui grande capacidade em sobreviver em condições adversas e desenvolver ou adquirir mecanismos de resistência aos antimicrobianos. As altas taxas de resistência juntamente com a falta de novas opções terapêuticas disponibilizadas pelas indústrias farmacêuticas atualmente, tem levado à necessidade de incluir novamente na prática clínica, drogas antigas como as polimixinas que, atualmente, constituem uma das últimas opções terapêuticas em casos de infecções por bacilos Gram negativos multirresistentes. Neste estudo foram analisados os fenótipos de resistência “natural” e induzida à polimixina B em isolados clínicos de A. baumannii.
Um isolado sensível e outro resistente às polimixinas foram submetidos ao cultivo em concentrações crescentes de polimixina B para a indução de resistência às mesmas. Os isolados clínicos de A. baumannii foram analisados por microscopia eletrônica de transmissão, antes e após o cultivo na presença de polimixina B. Foram realizados o sequenciamento e qRT-PCR do sistema de dois componentes PmrAB, relacionado com o surgimento de resistência às polimixinas em A. baumannii. Análises dos mecanismos de resistência relacionados à parede celular bacteriana foram realizadas para estudar a associação destes ou não com os fenótipos de resistência às polimixinas. O isolado sensível à polimixina reverteu o perfil de sensibilidade aos β-lactâmicos e aminoglicosídeos após a indução de resistência à polimixina B. Esse perfil de sensibilidade foi estável, mesmo após o cultivo na ausência do antimicrobiano. Esse mesmo isolado não conseguiu sobreviver em meio hipotônico, sugerindo uma diminuição da integridade da parede celular bacteriana. Essas alterações no perfil de sensibilidade não foram observadas no isolado com resistência “natural” quando cultivado na presença de polimixina B. Nesse isolado, diferente do isolado sensível, foi observado um espessamento na parede celular, mesmo antes da exposição ao antimicrobiano. O sequenciamento do sistema de dois componentes PmrAB mostrou duas mutações no
v gene pmrB, somente no isolado com resistência induzida à polimixina B. Para esses genes, também foram observados diferentes níveis de transcrição entre o isolado com resistência induzida e com resistência “natural”, sugerindo que esse segundo fenótipo não seja regulado pelo sistema PmrAB. A diminuição da expressão da porina OmpW foi relacionada ao surgimento de resistência induzida às polimixinas nos isolados de A.
baumannii. As mutações nas PBPs de alto peso molecular observadas nos isolados com resistência “natural” à polimixina podem ser responsáveis pelo fenômeno de espessamento da parede celular e, consequentemente, pelo fenótipo de resistência. A concentração dos íons presentes no meio de cultura deve ser avaliado antes da realização dos testes de sensibilidade às polimixinas, para garantir a confiabilidade e reprodutibilidade dos testes.
vi ABSTRACT
A. baumannii is a common pathogen associated to health care infections in Brazil, due to its capacity to survive in adverse conditions and develop resistance to broad spectrum antimicrobial agents. The high resistance rate combined to together with the absence of new antimicrobial options turned polymyxins the last line antimicrobial drugs to treat Gram negative MDR infections. In this study both, an in vitro induced and a non- induced polymyxin-resistant phenotype in A. baumannii clinical isolates were analyzed.
The in vitro induced and the non-induced A. baumannii isolates were subcultured in progressive polymyxin B concentration. The transmission electron microscopy was performed previous or not the polymyxin B exposure. The PmrAB two component regulatory system were analyzed by sequencing and qRT-PCR. The polymyxin resistance determinants associated with the bacterial cell wall were studied. A modification on the susceptibility testing profile of the induced isolate was observed after polymyxin B exposure, mainly due to a reduction on the β-lactam and aminoglycosides MICs values.
This susceptibility profile was stable after subculturing the strain in the absence of antimicrobial pressure. Moreover, this isolate could not survive in a hypotonic environment suggesting a rupture on the cell wall integrity. This phenomenon was not observed in the
“natural” polymyxin resistant isolate when exposed to polymyxin B pressure. In the non- induced polymyxin resistant isolate, unlike the induced one, a cell wall thickness was observed, comparing to the same strain previously drug exposure. The PmrAB sequencing showed two mutations in the pmrB gene, only in the induced resistant isolate.
Different transcription rates between the induced and the non-induced polymyxin B resistant isolates was also observed when evaluating the two component system genes suggesting that the non-induced phenotype was not regulated by this system. In addition, a decrease in the OmpW expression was observed in the induced polymyxin B resistant strain but not in the non-induced one. The mutations observed in high molecular weight
vii PBPs of non-induced polymyxin B resistant isolate may be responsible to the thickness in the cell wall presented by this isolate.
Introdução
1
1.
1.
1.
1. INTRODUÇÃO INTRODUÇÃO INTRODUÇÃO INTRODUÇÃO
2 1. INTRODUÇÃO
Microrganismos resistentes aos antimicrobianos constituem um dos principais problemas enfrentados por hospitais do mundo inteiro, incluindo os brasileiros. Infecções causadas por bacilos Gram negativos, como Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa e Klebsiella pneumoniae eram, até a algumas décadas, tratadas com diversos antimicrobianos, principalmente os beta-lactâmicos. No entanto, ao longo dos anos, esses microrganismos tem desenvolvido, cada vez mais, diferentes mecanismos de resistência a esta classe de antimicrobianos, sendo eles, a produção de β-lactamases, a hiperexpressão de sistemas de efluxo, a perda ou a redução da expressão de porinas e alterações nas proteínas ligadoras de penicilinas (PBPs), tornando esses antimicrobianos ineficazes contra infecções causadas por esses microrganismos.
A espécie A. baumannii está normalmente envolvida como agente etiológico de infecções relacionadas à assistência à saúde, como infecções do sistema respiratório ou de corrente sanguínea e são, frequentemente, responsáveis por surtos hospitalares de difícil controle. A capacidade de sobreviver em condições adversas, em desenvolver ou adquirir mecanismos de resistência aos antimicrobianos, aliado a sua resistência intrínseca, torna as infecções causadas por esses microrganismos de difícil tratamento.
As altas taxas de resistência juntamente com a ausência de novas opções terapêuticas disponibilizadas pelas indústrias farmacêuticas atualmente, tem levado à necessidade de incluir novamente na prática clínica, drogas antigas como as polimixinas, que estavam em desuso desde a década de 70, devido à nefrotoxicidade e à neurotoxicidade relacionadas ao seu uso.
Segundo um estudo do Sentry Antimicrobial Surveillance Program, as polimixinas permanecem ativas contra a maioria dos microrganismos não fermentadores pertencentes às espécies A. baumannii e P. aeruginosa. Apesar disso, embora raro, relatos de resistência a essas drogas já vem sendo observados em amostras clínicas,
Introdução
3 porém mais frequentemente em mutantes laboratoriais que apresentam resistência induzida às polimixinas. Os diversos estudos que tentaram elucidar os mecanismos de resistência às polimixinas não conseguiram esclarecer ainda o aparecimento dos dois distintos fenótipos de resistência às polimixinas, observados na clínica, um mecanismo, denominado “natural”, intrínseco ao isolado e, outro fenótipo, que é observado quando há a exposição da bactéria à polimixina. Cada um dos fenótipos de resistência é, provavelmente, regulado por diferentes sistemas, o que ainda necessita ser extensivamente estudado.
Este estudo teve por objetivo avaliar as diferenças nos mecanismos de resistência
“natural” e induzida à polimixina B em isolados clínicos de A. baumannii e sua associação com outros mecanismos de resistência aos betalactâmicos. Desta maneira, por meio da compreensão dos distintos mecanismos bacterianos envolvidos na resistência às polimixinas, esperamos entender como podemos menos favorecer a seleção de resistência às polimixinas.
4
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Revisão Bibliográfica
5 2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Acinetobacter baumannii
Microrganismos pertencentes ao gênero Acinetobacter spp. são coco-bacilos Gram negativos que apresentam metabolismo oxidativo, sendo portanto, classificados como parte do grupo dos não-fementadores. Dentre as espécies já descritas pertencentes ao gênero Acinetobacter, A. baumannii é a espécie de maior importância clínica, pois apresenta maior taxa de resistência aos antimicrobianos disponíveis, como aminoglicosídeos, fluoroquinolonas e beta-lactâmicos (Vila et al., 2007’; Yau et al., 2009;
Gales et al., 2011). A. baumannii é um patógeno oportunista responsável por uma variedade de infecções, como as do trato respiratório e de corrente sanguínea no ambiente hospitalar, e, especialmente, em unidades de terapia intensiva (UTI) (Monterrubio-Villar et al., 2009). Sua capacidade de sobreviver em superfícies inertes (Jawad et al., 1998), bem como sua habilidade para trocar material genético e adquirir determinantes de resistência aos antimicrobianos pode ter contribuído para o sucesso e a longevidade deste microrganismo no ambiente nosocomial, e consequente disseminação causando surtos de difícil controle (Higgins et al., 2010), já que geralmente os clones responsáveis por esses surtos tornam-se endêmicas nas unidades acometidas.
Vila et al. (2007) descreve alguns fatores que favorecem a persistência de Acinetobacter spp. no ambiente hospitalar, entre eles, a habilidade desses isolados em sobreviver em ambientes com diferentes temperaturas e valores de pH, além de suas necessidades nutricionais mínimas. Devido a sua maior persistência, a aquisição de elementos genéticos móveis como plasmídios, transposons e integrons, que são responsáveis pela transmissão de genes de resistência é favorecida entre diferentes indivíduos pertencentes à mesma espécie ou não. Esses fatores limitam ainda mais as opções terapêuticas disponíveis.
6 2.2 Opções terapêuticas e mecanismos de resistência
Devido ao fenótipo de multirresistência apresentado por isolados de A. baumannii, as opções terapêuticas, como quinolonas e aminoglicosídeos, já não são mais eficazes frente estes patógenos em muitos centros médicos mundiais. Os carbapenens são, normalmente, os antimicrobianos de primeira escolha para o tratamento dessas infecções. No entanto, desde o início da década de 90, surtos causados por isolados de A. baumannii resistentes aos carbapenems tem sido descritos com maior frequência (Wang et al., 2007; Giannouli et al., 2010).
Para isolados com resistência aos carbapenens, geralmente a tigeciclina e/ou as polimixinas podem constituir opções terapêuticas disponíveis ou os únicos antimicrobianos disponíveis para tanto. Embora a tigeciclina tenha sido somente aprovada pela “Food and Drug Administration” (FDA) para o tratamento de infecções de pele e partes moles, infecções intra-abdominais complicadas e pneumonia comunitária (Tygacil, bula do medicamento, 2007), esse antimicrobiano tem sido frequentemente utilizado no tratamento de infecções causadas por A. baumannii (Curcio et al., 2008).
Porém, devido à sua farmacocinética e ao mecanismo bacteriano responsável pela sua resistência, hiperexpressão de sistemas de efluxo, estar presente no cromossomo bacteriano, relatos de resistência à tigeciclina em A. baumannii tem surgido com uma frequência cada vez maior (Peleg et al., 2007, Navon-Venezia et al., 2007; Horsey et al., 2010; Al-Sweih et al., 2011). Desta maneira, as polimixinas e a associação de ampicilina/sulbactam representam as principais opções terapêuticas empregadas no tratamento das infecções causdas por A. baumannii resistentes aos carbapenens (Oliveira et al., 2008).
2.2.1 ββββ-Lactâmicos
No Brasil, os isolados de A. baumannii, em geral, apresentam taxas de resistência aos carbapenems entre 25% a 45% (Levin et al., 1999). Entretanto, um estudo conduzido por Prates et al. (2011) mostrou que a taxa de resistência aos carbapenenens isolados de
Revisão Bibliográfica
7 A. baumannii em uma UTI de um hospital terciário no sul do país aumentou de 29,4% em 2006 para 78% em 2008, muito acima da média nacional. O mesmo estudo mostrou que a incidência de A. baumannii resistente aos carbapenens foi de 3,78/1000 pacientes-dia durante o período de estudo (1,49 pacientes-dia em 2006 para 5,45 em 2008) e a mortalidade observada nesses pacientes foi de 69,7%.
Os mecanismos de resistência aos β-lactâmicos em isolados clínicos de A.
baumannii incluem: (i) produção de β-lactamases (Poirel et al., 2010); (ii) impermeabilidade de membrana externa associado à perda ou à diminuição da expressão de porinas (Mussi et al., 2005) e, (iii) hiperexpressão de sistemas de efluxo (Huang et al., 2008). No entanto, há informações limitadas sobre o papel das modificações nas proteínas ligadoras de penicilina (PBPs) na resistência aos β- lactâmicos em A. baumannii (Gehrlein et al., 1991; Obara & Nakae, 1991; Fernández- Cuenca et al., 2003; Cayô et al.; 2010).
2.2.1.2 Produção de β-lactamases
A produção de β-lactamases é o principal mecanismo de resistência aos β- lactâmicos em A. baumannii e em outros bacilos Gram negativos. Estas enzimas se encontram armazenadas no espaço periplásmico, por onde os β-lactâmicos precisam atravessar para chegar até o seu sítio alvo que são as PBPs, localizadas na membrana interna da célula bacteriana. Isolados clínicos de A. baumannii já foram descritos carreando uma grande variedade de β-lactamases. As β-lactamases da classe C de Ambler codificada pelo gene blaAmpC é cromossomal e, portanto, intrínseca em A.
baumannii. Distintamente do que ocorre em outros bacilos Gram negativos, que também possuem as enzimas AmpC cromossomais, o gene blaAmpC não é induzível em A.
baumannii. Entretanto, a presença da sequência de inserção ISAba1 a montante deste gene leva à sua hiperexpressãoe, consequentemente, resistência às cefalosporinas de amplo espectro (Bush & Jacoby, 2010; Lee et al., 2011).
8 Outro grupo de β-lactamases também descrito em A. baumannii, são as pertencentes a classe A de Ambler e ao grupo funcional 2be, conhecidas como β- lactamases de espectro ampliado (ESβL) e por conferirem a resistência às cefalosporinas de amplo espetro. Em A. baumannii já foram descritas ESβL do tipo TEM (Peleg et al., 2008), SHV (Peleg et al., 2008), CTX-M (Peleg et al., 2008), PER (Opazo et al., 2012) e GES (Bogaerts et al., 2010). Embora relatos já tenham sido descritos, acredita-se que a prevalência de ESβL em isolados de A. baumannii seja relativamente baixa, quando comparada àquelas apresentadas por isolados de enterobactérias e de P. aeruginosa.
As metalo-β-lactamases (MβLs), pertencentes à classe B de Ambler, são capazes de degradar todos os antimicrobianos β-lactâmicos com exceção do aztreonam, e são muito frequentes em isolados clínicos de P. aeruginosa. As MβLs também foram descritas em isolados clínicos de A. baumannii, sendo o segundo grupo de carbapanemases mais frequente nestes microrganismos. Os grupos de MβLs descritos até o momento em A. baumannii foram do tipo IMP (Yamamoto et al., 2011), VIM (Huang et al., 2008), SIM (Lee et al., 2005), e NDM-1 (Bogaerts et al., 2012). A carbapenemase de classe A do tipo KPC, inicialmente descrita em isolados de K. pneumoniae nos Estados Unidos, em 2001, se disseminou mundialmente, não somente para outras espécies de enterobactérias, como também para isolados de P. aeruginosa e A baumannii (Robledo et al., 2010). Outra carbapenemase pertecente a classe A de Ambler também já foi descrita em A. baumannii, sendo esta do tipo GES (Bonnin et al., 2011).
Felizmente, essas enzimas ainda são restritas a determinadas regiões geográficas.
Dentre todas as β-lactamases produzidas por isolados de A. baumannii, as mais importantes e prevalentes são aquelas pertencentes ao grupo das oxacilinases com atividade frente aos carbapenems, conhecidas como CHDLs. As oxacillinases constituem um grupo de β-lactamases com propriedades estruturais e bioquímicas heterogêneas (Poirel et al., 2010), pertecentes a classe D de Ambler. Estas enzimas variam desde β- lactamases de espectro limitado, capazes de hidrolisar somente a oxacilina, até β- lactamases do tipo ESβL, com capacidade de hidrolisar também as cefalosporinas de
Revisão Bibliográfica
9 amplo espectro, e as CHDLs que hidrolisam os carbapenens menos eficientemente que as MβLs. Em Acinetobacter spp., as oxacilinases do tipo ESβL são menos frequentemente detectadas que as CHDLs, sendo que estas estão divididas em cinco clusters principais. O cluster OXA-51, que está presente no cromossomo de A.
baumannii, podendo também ser encontrada concomitantemente em plasmídeos em algumas regiões na Ásia (Lee et al., 2012). Nessa região, inclusive o plasmídeo carreando o gene blaOXA-51 foi transferido para a espécie A. nosocomialis (Lee et al., 2012). Os outros quatro clusters principais de CHDL são: o cluster OXA-23 (Paton et al., 1993), o cluster OXA-24 (Bou et al., 2000), o cluster OXA-58 e o cluster OXA-143, que podem estar localizados tanto no plasmídeo como no cromossomo bacteriano (Bush e Jacoby, 2010; Poirel et al., 2010). No Brasil, a resistência aos carbapenens em isolados clínicos de A. baumannii está principalmente associada à produção de OXA-23 (Dalla- Costa et al., 2003), seguida pela produção de OXA-143 (Antonio et al., 2011; Werneck et al., 2011a; Mostachio et al., 2012) e da MβL IMP-1 (Gales et al., 2003). Esporadicamente, isolados produtores de OXA-58 e de OXA-72 (variante do cluster OXA-24) foram relatados no Brasil (Antonio et al., 2011; Werneck et al., 2011b). Assim como ocorre para o gene blaAmpC, a expressão dos genes blaOXA-51-like, blaOXA-23-like e blaOXA-58-like também está associada à presença de sequências de inserção. Diferente do que ocorre com as MβL, os carbapenems não são seu substrato preferencial e não apresentam atividade frente às cefalosporinas de amplo espectro (Poirel et al., 2010).
2.2.1.3 Alteração de porinas
Porinas são proteínas de membrana externa que formam canais para o transporte de moléculas através das membranas, pois essas apresentam baixa permeabilidade aos solutos hidrofílicos (Vila et al., 2007). Assim como ejeção do antimicrobiano por meio de sistemas de efluxo, a redução da permeabilidade celular, por perdas ou modificações de porinas pode desempenhar papel significativo no desenvolvimento de resistência aos diversos antimicrobianos. A superfície celular de A. baumannii é menos permeável em
10 relação à superfície de outros bacilos Gram negativos, devido ao menor número e tamanho das suas porinas (Obara et al., 2001; Sato e Nakae, 1991; Lee et al., 2011). A proteína de membrana externa mais expressa em A. baumannii é a OmpHMP, de 35,6 kDa que é homóloga à porina OmpA e OprF de enterobactérias e P. aeruginosa, respectivamente. Porinas pertencentes à família da OmpA permitem a penetração de antimicrobianos β-lactâmicos e sacarídeos de até 800 Da (Gribum et al., 2003; Nitzan et al., 1999).
Isolados de A. baumannii resistentes a imipenem apresentam perda ou diminuição da expressão das porinas 33-36 kDa; CarO (29 kDa) e uma proteína de 43 kDa homóloga à OprD de P. aeruginosa (Vila et al., 2007). Vila et al. (2007) sugere que as porinas CarO e OprD-like possam funcionar como canais inespecíficos e específicos, respectivamente, para entrada de carbapenens na célula de A. baumannii. Dois estudos brasileiros avaliaram a associação entre a produção de β-lactamases e a alteração de porinas no fenótipo de resistência aos carbapenens em isolados clínicos de A. baumannii (Costa et al., 2000; Mostachio et al., 2012). O estudo de Costa et al. (2000) avaliou a indução da resistência in vivo a imipenem em três pacientes após a terapia com este antimicrobiano.
Foram isolados de cada paciente duas cepas sendo uma antes e a outra após a terapia com imipenem. Eles obervaram que em um dos pacientes houve a perda de uma porina de 31-36 kDa (correspondente à porina 33-36 kDa) no isolado resistente, quando este era comparado ao isolado sensível. Um estudo recente, Mostachio et al. (2012) verificaram que na maioria dos isolados com altos níveis de resistência ao meropenem havia tido a perda de uma porina de 43 kDa. O mesmo estudo verificou também a perda da porina 33-36 kDa. Nesses isolados os autores verificaram uma alta prevalência da OXA-143, seguido de OXA-23 e IMP-1.
2.2.1.4 Hiperexpressão de sistemas de efluxo
Associada à produção de enzimas, a hiperexpressão de sistemas de efluxo tem sido relacionada a altos níveis de resistência aos β-lactâmicos em isolados de A.
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11 baumannii. A hiperexpressão do sistema de efluxo AdeABC pertencente à família RND (“Resistance-Nodulation-Division”) promove a resistência aos aminoglicosídeos, aos β- lactâmicos, ao cloranfenicol, à eritromicina,à tetraciclina, à tigeciclina e às fluoroquinolonas (Magnet et al., 2001; Resenfeld et al., 2012), O sistema AdeABC é composto por três proteínas: AdeA, uma proteína de fusão de membrana; AdeB, a proteína que faz o transporte e; AdeC, a proteína de membrana externa. Esse sistema de efluxo é o mais descrito em espécies de Acinetobacter spp. e tem sido relacionado com níveis mais elevados de resistência aos carbapenens em isolados produtores de OXA-23 (Lee et al., 2010; Lee et al., 2011). A hiperexpressão deste sistema é regulada pelos genes adeR e adeS (Coyne et al., 2010; Marchand et al., 2004).
O sistema de efluxo AdeFGH possui como substrato os antimicrobianos cloranfenicol, clindamicina, fluoroquinolonas, trimetoprim, tetraciclina, tigeciclina e sulfonamidas (Coyne et al., 2010). O aumento da expressão desse sistema de efluxo é devido à mutação do gene adeL, localizado à montante do gene adeFGH que codifica a proteína reguladora transcricional LysR (Coyne et al., 2010).
Outro sistema de efluxo AdeIJK está presente em todos os isolados de A.
baumannii e promove resistência à ticarcilina, às cefalosporinas, ao aztreonam, às fluoroquinolonas, à tetraciclina, à tigeciclina, às lincosamidas, à rifampicina, ao cloranfenicol, ao cotrimazole, à novobiocina e ao ácido fusídico. O sistema regulatório da hiperexpressão desse sistema de efluxo foi descrito recentemente por Rosenfeld et al.
(2012) e envolve o gene adeN que atua reprimindo a expressão de AdeIJK.
A família de sistemas de efluxo MFS (“Major Facilitator Superfamily”) também é encontrada em A. baumannii. O sistema de efluxo Tet é responsável pela resistência à tetraciclina em bactérias Gram negativas e seus genes podem estar presentes em transposons que estão inseridos em plasmídios normalmente conjugativos. Esse sistema de efluxo é regulado pela presença da tetraciclina. Na ausência dessa droga, a proteína repressora bloqueia a transcrição dos genes estruturais do sistema de efluxo (Chopra e Robertz, 2001). Em isolados de A. baumannii os principais sistemas dessa família são
12 TetA que confere resistência à tetraciclina e TetB que confere resistência à tetraciclina e à minociclina. A tigeciclina não é afetada por esses sistemas de efluxo; porém, é ejetada pelo sistema AdeABC (Martí et al., 2006).
A família MATE (“Multidrug and toxic compound extrusion”) inclui o sistema de efluxo AbeM que confere resistência à norfloxacina, à ciprofloxacina, à gentamicina, à canamicina, à eritromicina, ao cloranfenicol, ao trimetoprim, além de alguns antissépticos.
Esse sistema utiliza a força próton-motriz para ejetar os antimicrobianos da célula bacteriana (Su et al., 2005).
2.2.1.5 Alterações de PBPs
Na membrana interna da parede celular bacteriana estão localizadas as PBPs, que são responsáveis pela síntese do peptideoglicano e constituem o alvo de ação dos antimicrobianos β-lactâmicos. O peptidioglicano é composto por cadeias de glicano formadas alternadamente pelo ácido acetilglicosamina e pelo ácido acetilmurâmico. Cinco aminoácidos são ligados ao ácido acetilmurâmico. (Ghuysen et al., 1968; Schleifer e Kandler, 1972; Vollmer et al., 2004; Vollmer et al., 2008). Na transglicosilação, as PBPs catalizam a polimerização de cadeias de glicano e, na transpeptidação, essas proteínas promovem a ligação cruzada entre as cadeias laterais de peptideoglicano. Dessa forma, essas proteínas são responsáveis por determinar a forma da célula bacteriana e assegurar que essa seja mantida por gerações seguintes. O peptideoglicano celular intacto permite à célula bacteriana resistir a danos devido às pressões intracelular e extracelular (Sauvage et al., 2008).
As PBPs são divididas em duas categorias, as PBPs de alto peso molecular e as PBPs de baixo peso molecular. As PBPs de alto peso molecular são PBPs multifuncionais responsáveis pela polimerização do peptídioglicano e inserção do mesmo na parede celular pré-existente (Goffin e Ghuysen, 1998; Born et al., 2006). Dependendo de sua estrutura e atividade catalítica do seu domínio N-terminal elas são pertencentes às classes A ou B. Nas PBPs de classe A de Escherichia coli, chamadas PBP1a, PBP1b
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13 e PBP1c, o domínio N-terminal é responsável pela atividade de glicosiltransferase, catalizando a elongação de cadeias de glicano não ligadas. Nas PBPs de classe B, chamadas PBP2 e PBP3, o domínio N-terminal desempenha papel na morfogênese celular e não possuem atividade de glicosiltransferase (Höltje et al., 1998; Zapun et al., 2008). Em ambas as classes A e B, o domínio C-terminal cataliza a ligação cruzada entre as duas cadeias de glicano através da atividade de transpeptidase (Sauvage et al., 2008).
As PBPs 1a e 1b, são as principais transpeptidases e transglicosilases da célula bacteriana. Entretanto, a deleção de apenas uma dessas duas proteínas não é letal para a célula bacteriana. A função da PBP1c ainda não foi completamente elucidada até o momento, e não está presente em todos os bacilos Gram negativos. Ela não sofre alteração pela maioria dos antimicrobianos β-lactâmicos e sua hiperexpressão não supre a ausência da PBP1a e da PBP1b. As PBPs de classe B são transpeptidases monofuncionais, onde a PBP2 tem função de elongase, enquanto a PBP3 está envolvida no complexo de divisão celular.
As PBPs de baixo peso molecular ou de classe C podem ser subdivididas nas subclasses C1, C2 e C3 (Sauvage et al., 2008). Essas proteínas estão envolvidas na separação celular, maturação e reciclagem do peptideoglicano. A PBP4 e PBP7 são endopeptidases que clivam as ligações cruzadas entre as duas cadeias de glicano, entretanto, parecem que a PBP4 não é encontrada no genoma de A. baumannii (Cayô et al., 2011). A PBP5 é a principal carboxipeptidase e é responsável pela clivagem do domínio terminal D-Ala-D-Ala tornando a cadeia de peptídio disponível para a transpeptidação (Spratt e Strominger, 1976). Em E. coli, as PBP6 e PBP6b possuem sequencias homólogas à sequencia da PBP5 e, assim como ela, também possuem ação de carboxipeptidase. Em isolados de Acinetobacter spp. somente a PBP6 é idêntica à PBP5 (Cayô et al., 2011). As outras PBPs de baixo peso moleculas já descritas PBP4b e AmpH possuem função desconhecida (Sauvage et al., 2008).
As PBPs possuem variado grau de afinidade pelos β-lactâmicos e, dessa forma, alterações nessas proteínas são responsáveis pelo desenvolvimento de resistência à
14 esses antimicrobianos (Sauvage et al., 2008). Ainda existem poucos estudos em relação à participação de PBPs na resistência aos β-lactâmicos em isolados de A. baumannii (Gehrlein et al., 1991; Obara & Nakae, 1991; Fernández-Cuenca et al., 2003; Cayô et al.;
2011). Gehrhein et al. (1991) associou alterações nas PBPs de isolados clínicos de A.
baumannii com resistência à imipenem nesses isolados.
2.2.2 Polimixinas
As polimixinas são antimicrobianos polipeptídicos descobertos em 1947 como produto do microrganismo de solo Paenibacillus (Bacillus) polymyxa. Esses antimicrobianos são utilizados na prática clínica nas formas de polimixina B e E, essa última também chamada de colistina. A estrutura química das duas polimixinas se diferencia pela presença de um único aminoácido na mesma posição, D-Leucina na molécula de colistina e D-Fenilalanina na molécula de polimixina B (Bergen et al., 2006), conforme mostrado na Figura 1. O sulfato de colistina é utilizada somente na formulação tópica, enquanto que o colistimetato de sódio é uma preparação para uso parenteral e seus principais componentes são colistina A e colistina B (Figura 2), que diferem em sua composição pelo resíduo de ácidos graxos (Landman et al., 2008). Desde sua descoberta até a década de 1960, essas drogas eram opções terapêuticas frequentemente usadas para o tratamento de infecções graves por bacilos P. aeruginosa. A partir da década de 1970, as polimixinas foram gradativamente substituídas pelas cefalosporinas de amplo espectro e pelos aminoglicosídeos, que apresentavam o espectro de atividade, semelhante, mas com menor toxicidade. Até a década de 1990, as polimixinas eram utilizadas somente em formulações tópicas ou inalatórias no tratamento de infecções não graves ou na prevenção da colonização por P. aeruginosa em pacientes com fibrose cística, respectivamente (Li et al., 2006a).
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A molécula de polimixina consiste de uma cadeia lateral de ácidos graxos ligada a um anel peptídeo policatiônico composta de dez aminoácidos.
catiônicos, as polimixinas possuem alta afinidade por superfícies carregadas negativamente, como o lipopolissacarídeo (
antimicrobianos dessa classe agem bacteriana, deslocando as
promovendo o aumento da permeabilidade
da mesma forma com a membrana interna da célula, promovendo a componentes celulares, lev
Figura 1: Estrutura química das moléculas de polimixina B: Molécula de colistina. Adaptado de Bergen
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A molécula de polimixina consiste de uma cadeia lateral de ácidos graxos ligada a um anel peptídeo policatiônico composta de dez aminoácidos. Por serem compostos as polimixinas possuem alta afinidade por superfícies carregadas
lipopolissacarídeo (LPS) da membrana externa bacteriana.
icrobianos dessa classe agem na membrana celular externa
deslocando as moléculas de cálcio e magnésio que estabilizam
promovendo o aumento da permeabilidade celular. Logo após, essas drogas interagem da mesma forma com a membrana interna da célula, promovendo a
componentes celulares, levando à morte celular bacteriana (Hancock, 1997
Estrutura química das moléculas de polimixinas. A: Molécula de polimixina B;
Adaptado de Bergen et al., 2006.
15 A molécula de polimixina consiste de uma cadeia lateral de ácidos graxos ligada a Por serem compostos as polimixinas possuem alta afinidade por superfícies carregadas da membrana externa bacteriana. Os externa da parede celular léculas de cálcio e magnésio que estabilizam o LPS, celular. Logo após, essas drogas interagem da mesma forma com a membrana interna da célula, promovendo a liberação dos
Hancock, 1997).
Molécula de polimixina B;
16 Figura 2: Estrutura química da colistina - A e do colistimetato de sódio - B (Li et al., 2006b).
Atualmente, as taxas de infecção causada por bactérias Gram negativas resistentes à maioria dos antimicrobianos utilizados comumente na clínica tem aumentado com grande rapidez, restringindo cada vez mais as opções terapêuticas.
Associado a esse fato, a indústria farmacêutica não tem produzido novos antimicrobianos, para os quais as bactérias ainda não tenham desenvolvido mecanismo de resistência. Dessa forma, as polimixinas foram novamente introduzidas na prática clínica, em alguns casos, como a última opção terapêutica ainda efetiva.
As polimixinas possuem um amplo espectro de ação contra bactérias Gram negativas, com algumas exceções, como, Proteus spp. Burkholderia spp., Serratia spp., Morganella morgannii e Providencia spp., que apresentam resistência intrínseca a esse agente antimicrobiano. A resistência às polimixinas ainda é rara entre microrganismos não fermentadores, como Acinetobacter spp. e P. aeruginosa (Gales et al., 2001; Gales et al., 2006). Um estudo recente do Sentry Antimicrobial Surveillance Program apontou
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17 que polimixina B ainda apresenta excelente atividade contra bactérias Gram negativas, incluindo aquelas que apresentam resistência aos carbapenens. No entanto, esses autores observaram uma tendência a um aumento da resistência às polimixinas entre os isolados de K. pneumoniae de hospitais localizados na América Latina. Esses isolados apresentam concentrações inibitórias mínimas (CIMs) de polimixina B e colistina mais elevadas do que as observadas entre isolados não fermentadores que apresentam esse fenótipo (Gales et al., 2011; Sader et al., 2011).
2.2.2.1 Mecanismos de resistência às polimixinas
O mecanismo de resistência às polimixinas não está completamente elucidado até o momento. Em geral, são observados dois fenótipos de resistência, o primeiro, denominado resistência natural, provavelmente resultante de mutação no genoma bacteriano e que promove baixo grau de resistência com CIMs próximas aos pontos de corte para mudança de categoria de sensibilidade. O segundo fenótipo de resistência às polimixinas é denominado mecanismo adaptativo, no qual a bactéria, inicialmente sensível, desenvolve resistência às polimixinas após à exposição cem concentrações crescentes de polimixinas. Esse último mecanismo pode levar a CIMs bem mais elevadas, acima de 128 µg/mL e pode ser um fenótipo reversível, dependendo da espécie bacteriana, na ausência da pressão seletiva estabelecida pela droga (Skiada et al., 2011). Dessa forma, a utilização do antimicrobiano em doses não suficientes para erradicação do patógeno pode contribuir para o surgimento do fenótipo adaptativo de resistência às polimixinas.
A parede celular de bactérias Gram negativas é formada por uma membrana interna que separa o conteúdo intracelular do espaço periplasmático onde estão presentes as betalactamases, seguida por uma camada fina de peptideoglicano. Esses microrganismos possuem a membrana externa fosfolipídica envolvendo a célula. A
parede celular bacteriana é ancorada por moléculas de LPS
total da superfície celular bacteriana, com exceção dos espaços ocupados pelas porinas (Nikaido, 2003). O LPS é composto
por um lipídio A, na porção central extremidade mais externa, por um antígeno O
Figura 3. Desenho esquemático da parede celular bacteriana de bactérias Gram negativas (Adaptado de Brock, 2003).
Lipídio A é a porção que ancora o LPS composto por fosfolipídios
endotoxina bacteriana, responsável por Like 4, desencadeando a resposta inflamatória Whitfield, 2002; Koch et al., 2012
parede celular bacteriana é ancorada por moléculas de LPS que cobre
bacteriana, com exceção dos espaços ocupados pelas porinas O LPS é composto por três regiões, em sua extremidade mais
na porção central por um core de oligossacarídeo e, em sua , por um antígeno O (Figura 3).
Desenho esquemático da parede celular bacteriana de bactérias Gram Brock, 2003).
Lipídio A é a porção que ancora o LPS na superfície da membrana s baseados em moléculas de glicosamina.
endotoxina bacteriana, responsável por ativar os receptores do sistema imunológico Toll a resposta inflamatória, que pode levar ao choque tóxico
., 2012; Triantafilou et al., 2012). Devido à grande afinidade da
18 cobrem a área externa bacteriana, com exceção dos espaços ocupados pelas porinas , em sua extremidade mais interna, arídeo e, em sua
Desenho esquemático da parede celular bacteriana de bactérias Gram
na superfície da membrana interna e é glicosamina. O lipídio A é a ativar os receptores do sistema imunológico Toll-
choque tóxico (Raetz e . Devido à grande afinidade da
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19 molécula de polimixina pelo lipídio A, cuja carga é negativa, essa droga também apresenta atividade anti-endotoxina (Chen et al., 2010).
O core de oligossacarídeo é uma pequena porção central do LPS dividida em core externo e core interno (lipídio A proximal), esse último é composto por heptose e resíduos de ácido 3-deoxi-D-manno-oct-2-ulosonico (KDO). Assim como o lipídio A, o core de oligossacarídeo é uma região altamente conservada e desempenha papel crucial na estabilização das funções de barreira da membrana externa bacteriana (Heinrichs et al., 1998; Nikaido, 2003). Durante sua formação, o core de oligossacarídeo é agregado a um lipídio A pré-formado, por transferência sequencial do radical glicosil a partir de precursores de açúcares. Esse processo envolve um complexo de glicosiltransferases associadas à membrana, agindo na face interna da membrana celular interna. Após a síntese do LPS, o MsbA, um transportador do tipo ABC, é responsável por lançar o lipídio A através da membrana (Heinrichs et al., 1998; Nikaido, 2003).
A porção do antígeno-O é a mais externa da molécula de LPS e, dessa forma, define as propriedades da superfície celular em espécies que não produzem cápsula.
Essa porção do LPS é importante para fugir do ataque do sistema imunológico do hospedeiro. Para isso, essa porção é menos conservada do que o lipídio A e o core de oligossacarídeo. Microrganismos produtores de cápsula podem não possuir o core de oligossacarídeo em seu LPS, ou esse não estar aparente na superfície celular (Nikaido, 2003).
Estudos em Salmonella enterica foram os primeiros a demonstrar a associação entre alterações no LPS bacteriano e diminuição da sensibilidade às polimixinas. A principal alteração encontrada foi uma adição de 4-amino-arabinose na porção do lipídio A do LPS (Castelli et al., 2000; Navarre et al., 2005). Logo após os estudos com S.
enterica, essas alterações de LPS também foram descritas em outras espécies, inclusive entre microrganismos não fermentadores (Gunn et al., 1998; Moskowitz et al., 2004;
Winfield et al., 2005). Em geral, alterações no LPS bacteriano são descritas como
20 responsáveis por alterações na carga de superfície da célula bacteriana e redução na afinidade do antimicrobiano pela parede celular.
A regulação gênica do desenvolvimento de resistência às polimixinas, por meio de alterações no LPS conhecida até o momento, é realizada pelos sistemas de dois componentes (“Two Component Systems”). Esses sistemas são ativados por fatores ambientais, como, presença de ferro, concentrações elevadas de cálcio ou baixas de magnésio, ou ainda, alterações do pH no meio. A presença de polimixinas no meio também desencadeia a ativação desses sistemas (Groisman et al., 1997, Moskowitz et al., 2012).
Esses sistemas de dois componentes são sistemas globais de regulação gênica, utilizados por diversas espécies bacterianas para regulação da expressão de diferentes fatores de resistência e também de virulência. Eles são constituídos por uma proteína sensor de histidina quinase que percebe estímulos ambientais, sofrendo uma reação de autofosforilação, ativando uma segunda proteína citoplasmática, por uma reação de transfosforilação. A segunda proteína, então, promove a ativação ou a repressão dos genes alvo, desencadeando a resistência às polimixinas (Gooderhan e Hancock, 2009).
Estudos com isolados de K. pneumoniae mostraram a participação dos sistema PhoPQ e PmrAB em diferentes condições ambientais para o desenvolvimento de resistência às polimixinas (Mitrophanov et al., 2008, Mitrophanov e Groisman, 2008).
Mitrophanov et al. (2008) observaram que em baixas concentrações de magnésio, o sistema PhoPQ é ativado promovendo a expressão do gene pmrD. Tanto a expressão de pmrD, quando a presença de ferro estimulam a ativação do sensor quinase pmrB, que promove a ativação de PmrA, que por sua vez, leva a modificações no LPS bacteriano em K. pneumoniae e à resistência às polimixinas. O mesmo grupo de pesquisa, em estudos anteriores avaliando outras enterobactérias como S. enterica e E. coli, mostraram a participação desses dois sistemas. No entanto, nessas duas espécies, tanto
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o sistema PhoPQ quanto o sistema PmrAB ativa Kato et al., 2003; Kato et al.,
Figura 4. Esquema da regulação do desenvolvimento de resistência às polim isolados de Enterobactérias controlado por sistemas de dois componentes.
regulatório em S. enterica.
2008).
A resistência às polimixinas em isolados de rede de sistemas de dois componentes.
sistemas com resistência às polimixinas
mais recentemente, o sistema ParR/S (Barrow e Kwon, 2009; Fernández Miller et al., 2011; Moskowitz
mutações no gene pmrB, associado à expressão dependente de
importantes mecanismos de regulação de resistência às polimixinas (Barrow e Kwon, 2009; Moskowitz et al., 2012). O sistema PhoP
A do LPS de bactérias Gram
do gene phoQ e contribuem para o desenvolvimento de altos níveis de resistência às polimixinas (Barrow e Kwon, 2009; Miller
PhoPQ, promovem modificações na expressão do operon
adição de 4-amino-arabinose no lipídio A, que leva à alteração no fenótipo de resistência
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o sistema PhoPQ quanto o sistema PmrAB ativaram diretamente o gene et al., 2007).
Esquema da regulação do desenvolvimento de resistência às polim isolados de Enterobactérias controlado por sistemas de dois componentes.
S. enterica. B. Sistema regulatório em K. pneumoniae (Mitrophanov
A resistência às polimixinas em isolados de P. aeruginosa envolve rede de sistemas de dois componentes. Até este momento, o envolvimento de sistemas com resistência às polimixinas foram descritos, o sistema
mais recentemente, o sistema ParR/S (Barrow e Kwon, 2009; Fernández ., 2011; Moskowitz et al., 2012). Alterações no sistema PmrA
, associado à expressão dependente de pmrA
importantes mecanismos de regulação de resistência às polimixinas (Barrow e Kwon, ., 2012). O sistema PhoPQ está envolvido na modificação do lip A do LPS de bactérias Gram negativas, devido à mutações que levam a perda de função
e contribuem para o desenvolvimento de altos níveis de resistência às limixinas (Barrow e Kwon, 2009; Miller et al., 2011). Ambos os sistemas, PmrAB e Q, promovem modificações na expressão do operon arnBCADTEF responsável pela arabinose no lipídio A, que leva à alteração no fenótipo de resistência 21 m diretamente o gene pmrD (Figura 4,
Esquema da regulação do desenvolvimento de resistência às polimixinas por isolados de Enterobactérias controlado por sistemas de dois componentes. A. Sistema (Mitrophanov et al.,
envolve uma complexa Até este momento, o envolvimento de três destes , o sistema PmrAB, PhoPQ e, mais recentemente, o sistema ParR/S (Barrow e Kwon, 2009; Fernández et al., 2010;
ções no sistema PmrAB, por meio de pmrA, representam importantes mecanismos de regulação de resistência às polimixinas (Barrow e Kwon, Q está envolvido na modificação do lipídio negativas, devido à mutações que levam a perda de função e contribuem para o desenvolvimento de altos níveis de resistência às os sistemas, PmrAB e BCADTEF responsável pela arabinose no lipídio A, que leva à alteração no fenótipo de resistência
22 às polimixinas. O sistema de dois componentes ParRS foi o último descrito até o momento em isolados de P. aeruginosa com resistência adaptativa às polimixinas. Esse sistema foi relacionado a mutações no operon arnBCADTEF na presença de concentrações subinibitórias de polimixina, que levaram à modificações no LPS e conseqüente resistência à mesma (Fernández et al., 2010).
Em A. baumannii, somente o operon pmrCAB foi descrito, até o momento, como relacionado à resistência às polimixinas. Seus genes compõem um sistema de dois componentes, onde o pmrB é o sensor de histidina quinase e o pmrA é a proteína reguladora da resposta. Esse sistema controla a expressão do gene pmrC o qual é responsável pela adição de fosfoetanolamina ao lipídio A do LPS da parede celular bacteriana levando à resistência bacteriana (Figura 5). Mutações nos genes pmrA ou pmrB também promovem diminuição da sensibilidade às polimixinas (Adams et al., 2009;
Arroyo et al., 2011).
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Figura 5: Desenho esquemático do sistema de dois componentes que regula o desenvolvimento de resistência à polimixinas em isolados de
PmrCAB (B). Adaptado de Mitrophanov
Em 2010, Moffat et al A. baumannii com resistência gene que codifica o LPS, bacteriana. Moffat et al. (2010)
uma parede celular na ausência de LPS para sobreviver às pressões externas e internas.
Esses autores afirmaram que a perda do LPS promoveu
parede celular bacteriana e, consequentemente levou a mudanç sensibilidade dos isolados de
perfil de sensibilidade com reversão da resistência aos antimicrobianos, incluindo aqueles
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Desenho esquemático do sistema de dois componentes que regula o desenvolvimento de resistência à polimixinas em isolados de A. baumannii
Adaptado de Mitrophanov et al., 2008.
et al. relataram a perda total do LPS bacteriano em isolados de com resistência in vitro à colistina. Esses autores observaram
gene que codifica o LPS, lpxA, que levou a perda total do LPS da parede celular (2010) ainda sugerem que esses isolados conseguiram elaborar uma parede celular na ausência de LPS para sobreviver às pressões externas e internas.
m que a perda do LPS promoveu a diminuição da integridade da parede celular bacteriana e, consequentemente levou a mudanç
sensibilidade dos isolados de A. baumannii. Alguns estudos descrevem a mudança do perfil de sensibilidade com reversão da resistência aos antimicrobianos, incluindo aqueles 23 Desenho esquemático do sistema de dois componentes que regula o A. baumannii (A). Operon
bacteriano em isolados de à colistina. Esses autores observaram a mutação no , que levou a perda total do LPS da parede celular ados conseguiram elaborar uma parede celular na ausência de LPS para sobreviver às pressões externas e internas.
a diminuição da integridade da parede celular bacteriana e, consequentemente levou a mudanças no perfil de . Alguns estudos descrevem a mudança do perfil de sensibilidade com reversão da resistência aos antimicrobianos, incluindo aqueles
24 para os quais os isolados de Acinetobacter spp. são intrinsecamente resistentes (Gordon et al., 2010; Cai et al., 2012). Alguns autores sugerem, tanto em estudos in vivo quanto in vitro, o uso da associação sinérgica de polimixinas a outros antimicrobianos como carbapenens, tigeciclina, vancomicina, rifampicina, ampicilina/sulbactam ou amicacina, para tratamento de infecções graves causadas por A. baumannii (Fulnecky et al., 2005;
Biancofiore et al., 2007; Pantopoulou et al., 2007; Bassetti et al., 2008; Song et al., 2008;
Principe et al., 2009; Candel et al., 2010; Pankuch et al., 2010; Rodriguez et al., 2010;
Hornsey et al., 2011; Santimaleeworagun et al., 2011; Sheng et al., 2011; Shields et al., 2011; Peck et al., 2012).
Além de alterações no LPS bacteriano, a produção de cápsula polissacarídica já foi relacionada com a diminuição da sensibilidade às polimixinas em isolados de K.
pneumoniae (Llobet et al., 2008; Cheng et al., 2010). Cheng et al. (2010) observaram que amostras mutantes para o gene ugd, responsável pela biossíntese de cápsula apresentavam maior sensibilidade às polimixinas em relação à cepa selvagem, o que demonstra que, nessa espécie, a produção de cápsula também está envolvida com resistência às polimixinas.
A membrana externa da parede celular de bactérias Gram negativas permite a passagem de moléculas de nutrientes pequenas e lipofílicas. No entanto, sua natureza hidrofóbica dificulta a entrada de solutos hidrofílicos por ela, como a maioria dos nutrientes celulares. Sendo assim, a parede celular bacteriana possui canais formados por proteínas que permitem a entrada dessas moléculas e a saída de moléculas tóxicas para a célula. Essas proteínas são denominadas porinas e servem de porta de entrada para os antimicrobianos hidrofílicos na célula bacteriana. Dessa forma, a perda ou a diminuição na expressão de porinas contribuem para a resistência. A regulação da expressão de porinas em resposta à presença de antimicrobianos é uma estratégia de sobrevivência desenvolvida por bactérias de diferentes espécies (Nikaido, 2003). Um estudo conduzido por Vila e colaboradores (2007) observou que a redução na expressão
Revisão Bibliográfica
25 da porina OmpW (21 kDa) foi observada em isolados mutantes resistentes à colistina de A. baumannii selecionados in vitro, demonstrando um possível papel dessa porina na resistência a essa classe de antibióticos (Vila et al., 2007; Lee et al., 2011).
Em 2006, Li et al. (2006b) descreveram o aparecimento de heterorresistência à colistina em isolados de A. baumannii. Heterorresistência é denominada quando é detectado o surgimento de uma subpopulação resistente em uma população de isolados sensíveis à colistina. Após esse estudo, outros relatos de heterorresistência à colistina começaram a ser publicados em todo o mundo (Ko et al., 2007; Yau et al., 2009;
Rodriguez et al., 2009; Chang et al., 2012). Entretanto, o conceito de heterorresistência ainda não é concenso entre pesquisadores. Ainda não se sabe se a base para essa resistência é a presença de uma população de indivíduos geneticamente distintos ou se a variação no sistema regulatório entre indivíduos idênticos pode ser suficiente para a expressão de resistência às polimixinas (Adams et al., 2009). Segundo Cai et al. (2012), a prévia exposição à colistina contribui para o desenvolvimento de heterorresistência, selecionando isolados com CIMs mais elevadas, o que pode levar a falha terapêutica. O uso inapropriado do antimicrobiano é um fator de risco tanto para o surgimento de heterorresistência quanto para o aparecimento dos fenótipos de indução de resistência nos isolados clínicos. Hawley et al. (2008) observaram em seu estudo que, dos pacientes com infecções por A. baumannii que estavam recebendo polimixina em seu tratamento, eram isoladas cepas com CIMs para polimixinas extremamente elevadas, acima dos pontos de corte para mudança de categoria de sensibilidade. Esses autores ressaltam a importância em monitorar a emergência de resistência durante o uso prolongado de polimixinas para evitar falha terapêutica em tratamento por infecções causadas por A.
baumannii multirresistentes. Lopez-Rojaz et al. (2011) sugerem que as taxas de resistência às polimixinas ainda são baixas devido à um custo energético sofrido pelo isolado bacteriano para o desenvolvimento do fenótipo de resistência, reduzindo seu fitness. Entretanto, Rolain et al. (2011) afirmam que essas taxas de resistência
26 aumentarão assim que o uso da droga se tornar mais comum, levando ao desenvolvimento de resistência por adaptação à pressão seletiva exercida pela droga. Al- Sweih et al. (2011) prevê grandes problemas clínicos assim que a atividade das polimixinas for reduzida e não existirem outras opções terapêuticas disponíveis para o tratamento de infecções por bacilos Gram negativos multirresistentes.
Objetivos
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