O estudo do desenvolvimento cardíaco na transição da condição de feto à vida extra-uterina é bastante explorado, tendo em vista todas as adaptações anatômicas e fisiológicas nesta fase. O entendimento destes processos de maneira aprofundada poderá contribuir nos estudos que analisam a capacidade regenerativa do miocárdio. Para tanto se optou pelo estudo imunoistoquímico em cardiomiócitos de natimortos e neomortos como subsídio à compreensão das alterações apoptóticas, proliferativas e de diferenciação celular, que ocorrem durante esta fase de transição.
Esta pesquisa adotou como população do estudo os natimortos e neomortos pela diferente condição hemodinâmica que estes dois grupos apresentam durante o desenvolvimento cardíaco. Pois, de acordo com Lahmers et al (2004), nesta fase de transição de feto para neomorto, ocorrem alterações no padrão das proteínas sarcoméricas, levando a mudanças nas características contráteis dos cardiomiócitos, bem como alterações no padrão de apoptose e de proliferação celular dos mesmos. Vale ressaltar que as proteínas arquiteturais do citoesqueleto e algumas moléculas de adesão também passam por modificações estruturais e funcionais, e todas estas alterações tem influência direta na maturação e função dos cardiomiócitos na vida extra- uterina.
Os critérios de inclusão adotados levaram em conta o sofrimento fetal crônico, pois tal condição interfere nas características anátomo-funcionais dos cardiomiócitos. Segundo Mariani Neto (2002), o sofrimento fetal é o conjunto de manifestações clínicas decorrentes de hipóxia e/ou acidose fetal, culminando com o retardo de crescimento. Assim, o sofrimento fetal crônico, que está relacionado à hipóxia, manifesta-se durante a gestação, já o sofrimento fetal agudo decorre da hipóxia intraparto. Sendo assim, foi considerado critério de exclusão o sofrimento fetal crônico, evitando casos cujo crescimento cardíaco estivesse alterado pelo retardo do crescimento intra-uterino.
Foi determinado que os casos da pesquisa teriam como critério de inclusão a idade gestacional entre 38 e 42 semanas, isto é, fetos e neomortos a termo. A idade gestacional média no grupo de natimortos e neomortos foi de 39 semanas. De acordo com Galletta (2005) o feto a partir de 37 semanas encontra-se praticamente maduro e
sai do período de prematuridade. A partir deste momento, a mortalidade e morbidade desse recém-nascido serão mínimas, motivo pelo qual se considera como sendo esse o período ideal de parturição.
Além disso, foram excluídos os casos macerados grau II e III a fim de minimizar os graus acentuados de autólise o que prejudicaria as técnicas de imunoistoquímica. Apenas os macerados grau I, com até 24 horas de retenção e autólise foram incluídos na pesquisa.
Os casos do estudo foram divididos em três grupos: natimortos, neomortos com até dois dias de vida e neomortos entre três e dez dias. Isto foi feito a fim de respeitar as fases fisiológicas das modificações dos cardiomiócitos que coincidem com o fechamento do canal arterial. Segundo Field (2000), o crescimento cardíaco durante a vida fetal é caracterizado pela multiplicação dos cardiomiócitos e logo após o nascimento, a atividade cíclica é reduzida consideravelmente. O grupo dos natimortos foi estruturado, a fim de se observar a fase de multiplicação descrita por Field (2000). Já o grupo até dois dias de vida foi estruturado na tentativa de verificar as possíveis modificações dos cardiomiócitos neste curto período de transição, já que se observa o fechamento do canal arterial nas primeiras 48 horas de vida, de acordo com Kliegman (2004) e Guyton & Hall (2002). O último grupo, neomorto com mais de dois dias de vida, foi criado a fim de se observar a fase hipertrófica, de crescimento e diferenciação celular, que segundo Cortius et al (2005) e MacLellan & Schneider (2000), ocorre após o fechamento do canal arterial com conseqüente diminuição da multiplicação celular (fase hiperplásica).
Os tecidos cardíacos estavam conservados em blocos de parafina no banco de necropsias pediátricas e perinatais, o que levou o pesquisador a adotar a técnica de imunoistoquímica como método de análise, mais apropriada para materiais fixados em formol e emblocados em parafina. Mazzieri & Ebaid (2000) descrevem a imunoistoquímica como uma importante ferramenta na expansão dos conhecimentos sobre a expressão protéica e, conseqüentemente, as alterações de crescimento e diferenciação encontradas no desenvolvimento do coração na vida intra e extra-uterina.
No que se refere ao estudo em questão, a imunoistoquímica apresentou algumas vantagens, como técnica escolhida na investigação destes tecidos. De acordo com Werner et al (2005) este método é tecnicamente simples e seu resultado é influenciado por alguns fatores como o tipo de fixação e processamento, escolha dos anticorpos, reações propriamente ditas e a interpretação das lâminas. A imunoistoquímica é amplamente utilizada em materiais parafinados pela sua capacidade de expressão
mesmo frente a uma qualidade precária do tecido em estudo, principalmente depois do advento dos métodos mais acurados de detecção, como os polímeros de dextrana, e de técnicas mais agressivas no que concerne a recuperação antigênica, como altas temperaturas e soluções recuperadoras. Este fato pôde ser notado neste estudo, onde o material analisado se tratava de necropsia dos natimortos e neomortos, as quais passaram por um período de aproximadamente 6 horas sem fixação (período legal de espera antes da realização do ato de necropsia), acarretando certo grau de autólise. Este aspecto ainda é agravado pelo fato de que o grupo dos natimortos apresenta tempo de autólise ainda maior, uma vez que o óbito ocorre no intra-útero, sendo que o tempo médio de retenção do concepto neste estudo poderia chegar a 24 horas. Além disso, o tempo médio de 30 dias para finalização do laudo anatomopatológico destes casos acarreta um tempo de fixação em formol 10% relativamente longo, quando comparado ao ideal que seria de 48 a 72 horas. Este fato dificulta sobremaneira a realização de boas reações imunoistoquímicas, uma vez que o formol é responsável pela formação de pontes de hidrogênio que ocluem os epitopos de ligação dos anticorpos primários. As técnicas modernas de recuperação antigênica, como as empregadas neste estudo (temperatura e imunoretriever) são responsáveis pela abertura destas pontes e pela implementação técnica das reações antigênicas. Vale lembrar que este material de necropsia utilizado no estudo também apresenta certo problema no que concerne ao tempo de armazenamento dos blocos de parafina (máximo de 15 anos neste estudo), o que produz deterioração protéica, acarretando perdas na imunorreatividade do material.
É notório o avanço de métodos de investigação da biologia molecular como a extração de DNA empregando reação em cadeia da polimerase (PCR), bem como a extração do RNA. Entretanto, tais técnicas foram descartadas neste estudo tendo em vista algumas características específicas. Os tecidos do estudo foram fixados em formol 10%, que é um método prático e eficiente para sua preservação. Contudo, de acordo com Isola et al (1994), este tipo de fixação resulta no enovelamento de proteínas nucleares, na formação de ligações entre as proteínas e DNA e na fragmentação do DNA, o que dificulta a extração dessa classe de moléculas de tecidos fixados. Segundo Simonato et al (2007), atualmente existem métodos de extração do DNA de material parafinado para amplificação em PCR. Entretanto, com sérias restrições técnicas e financeiras, tendo em vista que o sistema apresenta um elevado custo e uma baixa qualidade do DNA extraído devido aos fatores já acima descritos. Dificuldades similares podem ser observadas com o RNA, pois Cronin et al (2004) afirmam que o RNA começa
a se degradar logo após a retirada do tecido pela ação de RNAses presentes no ambiente. Outro grande desafio é apontado por Masuda et al (1999), que evidencia as modificações químicas ocorridas no RNA pela ação do formol 10%, caracterizadas pelas ligações cruzadas do RNA com proteínas e adição de um grupo monometilol aos grupos amino das quatro bases do RNA. Por isto, tem sido proposta a utilização, em laboratórios de patologia, de outros fixadores em substituição à formalina 10%. Em vista disso, o material disponível não seria adequado para este tipo de estudo, uma vez que foi submetido a certo tempo de autólise e foi fixado em formol a 10% por tempo longo sem proteção de RNAase ou tamponamento.
Para a confecção das lâminas histológicas com múltiplas amostras foi utilizado o
Tissue Microarray Artesanal (TMA), técnica com ampla aceitação e validado pela
comunidade científica mundial. Segundo Andrade et al (2007) e Sapino et al (2006) o uso do bloco de TMA apresenta vantagens em relação aos cortes tradicionais; entre as quais se observa: a grande economia de reagentes, que no caso da imunoistoquímica é um importante fator para minimizar os custos, diminuição no tempo para a realização das reações e facilidade na interpretação comparativa dos casos de uma pesquisa, pela uniformização das reações. Descrevem ainda, como vantagens desta técnica, a possibilidade de repetição das reações em múltiplos níveis do bloco e a simplificação do trabalho das linhas de pesquisa pela utilização do bloco em mais de um estudo.
Para analisar as mudanças fenotípicas dos cardiomiócitos foram utilizados doze anticorpos primários, sendo seis (Ki67, PCNA, Fas, FasL, Bcl2 e PTEN) ligados à proliferação celular e seis (E-caderina, Beta-catenina, desmina, actina 1 a 4, HHF35 e actina sarcomérica) à diferenciação. A escolha destes anticorpos primários foi baseada nos artigos de Cortius et al (2005), MacLellan & Schneider (2000) e Pasumarthi & Field (2002), que defendem a passagem dos cardiomiócitos de um fenótipo proliferativo (hiperplásico) intra-útero para um de crescimento e diferenciação (hipertrófico) logo após o nascimento.
Na leitura das lâminas da imunoistoquímica foram determinados os seguintes métodos: qualitativo, quantitativo simples e morfométrico. Tais métodos de leitura levaram em conta a expressão destes reagentes no tecido do estudo, bem como a sua imunolocalização celular; isto é, se a estrutura subcelular corada pelo anticorpo era nuclear, citoplasmática ou de membrana. As lâminas dos anticorpos Fas, FasL, E- caderina e Beta-catenina foram analisadas através do método qualitativo, tendo em vista as suas características de imunolocalização, que é na membrana celular, conforme
observado no quadro 2 do capítulo metodologia, bem como a intensidade da reação imunoistoquímica. As lâminas dos anticorpos Ki67, PCNA, Bcl2 e PTEN foram analisados através do método quantitativo simples, tendo em vista os sítios dos marcadores, que foram o núcleo celular (Ki67, PCNA, PTEN) e perinuclear (Bcl2), conforme apresentado no quadro 3 do capítulo metodologia. As lâminas dos anticorpos desmina, actina 1 a 4, HHF35 e actina sarcomérica foram analisadas através do método quantitativo morfométrico, tendo em vista as suas características de imunolocalização, que é citoplasmática, conforme observado no quadro 4 do capítulo metodologia, bem como a intensidade da reação imunoistoquímica.