PONTIFÍCIA UNIVERSIDADE CATÓLICA DO PARANÁ
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE
DOUTORADO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
TARCÍSIO FULGÊNCIO ALVES DA SILVA
A EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS DE PROLIFERAÇÃO E
DIFERENCIAÇÃO CELULAR EM CARDIOMIÓCITOS
DURANTE A TRANSIÇÃO DA CIRCULAÇÃO
FETAL A VIDA EXTRA-UTERINA
CURITIBA
2009
TARCÍSIO FULGÊNCIO ALVES DA SILVA
A EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS DE PROLIFERAÇÃO E
DIFERENCIAÇÃO CELULAR EM CARDIOMIÓCITOS
DURANTE A TRANSIÇÃO DA CIRCULAÇÃO
FETAL A VIDA EXTRA-UTERINA
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, da Pontifícia Universidade Católica do Paraná, como requisito à obtenção do título de Doutor.
Orientadora: Prof. Dra. Lúcia de Noronha
CURITIBA
2009
TARCÍSIO FULGÊNCIO ALVES DA SILVA
A EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS DE PROLIFERAÇÃO E
DIFERENCIAÇÃO CELULAR EM CARDIOMIÓCITOS
DURANTE A TRANSIÇÃO DA CIRCULAÇÃO
FETAL A VIDA EXTRA-UTERINA
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, da Pontifícia Universidade Católica do Paraná, como requisito à obtenção do título de Doutor.
COMISSÃO EXAMINADORA
DEDICATÓRIA
Aos alicerces da minha vida dedico essa vitória:
Deus, o Mestre dos Mestres, sempre presente em todos os momentos, dando-me força, ânimo e iluminando minha caminhada.
Meus pais, Loiola e Fátima, Doutores na arte de ensinar virtudes, que pela firmeza de caráter e espírito, sempre apontaram caminhos dignos a serem trilhados.
A meus irmãos, Tibério, Taíza e Tairone, fiéis companheiros, que me deram todo o apoio necessário, permitindo-me, desta forma, paz e coragem para que pudesse seguir meu caminho.
AGRADECIMENTOS
Aos docentes do Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde da PUCPR, e em especial a minha orientadora Dra. Lúcia de Noronha, que sempre demonstrou a sabedoria necessária, não só para a estruturação de uma tese, mas na construção de um cidadão, profissional de saúde e docente. Por todos estes fatores, evidencio a minha eterna admiração e gratidão.
Aos profissionais que contribuíram para a efetivação deste trabalho não apenas com o auxílio técnico, mas também com o importante apoio e um permanente sorriso. Dessa forma, não posso deixar de agradecer a Ana Paula Martins, Marina Viola de Azevedo, Alcione Slugovieski e todas as pessoas que, durante estes quatro anos, convivi no Laboratório de Patologia Experimental da PUCPR.
Ao Diretor Geral da Faculdade de Pato Branco – FADEP, Eliseu Miguel Bertelli, que contribuiu sobremaneira para este momento tão especial na minha formação.
A Bruna Antonelli, minha eterna companheira, com quem compartilhei todos os momentos de dificuldades e angústias e, que com sua presença, auxílio e palavras de apoio, foi fundamental para o sucesso e a concretização deste sonho.
RESUMO
A passagem da condição de feto à vida extra-uterina exige adaptações anatômicas e fisiológicas fundamentais à sobrevivência. O estudo das alterações cardíacas nesta fase transitória vem sendo explorado por inúmeras pesquisas, que buscam compreender este processo de maneira mais aprofundada. Durante a gestação, o coração dos mamíferos opera sob condições de cargas hemodinâmicas muito diferentes daquelas na vida extra-uterina, e os mecanismos moleculares responsáveis por esta transição não são bem conhecidos. As novas descobertas e avanços na compreensão da regulação do ciclo celular dos cardiomiócitos favorecem a existência de um crescimento regenerativo do miocárdio. O objetivo deste estudo é avaliar as alterações na diferenciação e crescimento celular em cardiomiócitos, ocorridas durante a transição da circulação intra e extra-uterina através da análise imunoistoquímica de proteínas envolvidas com processos como apoptose, adesão celular, proliferação, filamentos intermediários do citoesqueleto e contração muscular, em amostras de miocárdio de natimortos e neomortos a termo. Para a elaboração deste trabalho foram utilizadas necropsias de natimortos e neomortos a termo em material parafinado. Os critérios de inclusão visaram à obtenção de uma amostra onde o sofrimento fetal crônico, antes do nascimento ou da morte intra-uterina, fosse mínimo. Os casos foram classificados em três grupos: neomortos a termo com no máximo 2 dias de vida (10 casos), neomortos a termo entre 2 e 10 dias de vida (14 casos) e natimortos a termo (17 casos). Foram selecionados os blocos teciduais parafinados contendo as amostras de coração de todos os casos do estudo. A técnica que foi realizada consistiu no tissue microarray artesanal para a confecção de lâminas histológicas com múltiplas amostras, a fim de realizar técnicas imunoistoquímicas. Os anticorpos utilizados na pesquisa foram o Fas, FasL, E-caderina, Beta-catenina, Ki67, PCNA, PTEN, Bcl2, actina 1 a 4, desmina, HHF35 e actina sarcomérica. Após análise, foi encontrada diferença estatisticamente significativa com o Bcl2, HHF35 e actina sarcomérica, principalmente, quando se analisam os grupos de neomortos com mais de dois dias e os natimortos, sendo que o primeiro apresenta aumento da expressão do Bcl2, da HHF35 e da actina sarcomérica em relação ao segundo. Os dados coletados demonstraram que os cardiomiócitos apresentam uma característica proliferativa no grupo natimorto, e que esta segue uma linha temporal, sendo substituída por um caráter de diferenciação no grupo de neomortos com mais de dois dias. Isto parece estar de acordo com a substituição da característica proliferativa hiperplásica deste tecido na vida intra-uterina, por uma característica mais hipertrófica, isto é, de diferenciação celular na vida extra-uterina.
ABSTRACT
The passage from the fetal condition to the extra-uterine life demands physiological and anatomic adaptations, which are fundamental to the life. The study of cardiac alterations in this transitory phase has been explored in several researches, which aim to understand this process in a more in-depth way. During the gestation, the mammal’s heart work in very different hemodynamic loading conditions from those in the extra uterine life, and the molecular mechanisms responsible for this transition are not so well-known. The new discoveries and advances in the comprehension of the cellular cycle regulation of cardiomyocytes, favour the existence of a myocardium regenerative growth. The aim of this study is to evaluate changes in cell growth and differentiation into cardiomyocytes, during the transition from the intra to extra uterine, by immunohistochemical analysis of proteins involved in processes like apoptosis, cell adhesion, proliferation, intermediate filaments of the cytoskeleton and muscle contraction, in samples stillborns and neonate’s myocardium. For the realization of this study, necropsies of stillborns and neonates in a paraffin solution were used. The criteria of inclusion aimed to obtain a sample where-by the chronic fetal suffering before the birth or intra-uterine death was minimal. The cases were classified in three groups; neonates with a maximum of two days of life (10 cases), neonates with 2 to 10 days of life (14 cases) and stillborns (17 cases). The tissue blocks in the paraffin embedded were selected containing the heart samples of all study cases. For the conception of these multiple samples histological the artisanal tissue microarray was used to achieve immunohistochemical technique. The antibodies used in this research were the Fas, FasL, E-caderin, Beta-catenin, Ki67, PCNA, PTEN, Bcl2, actin 1 to 4, desmin, HHF35, and sarcomeric actin. After the analysis, a significative statistical difference was found with the Bcl2, HHF35 and sarcomeric actin, mainly when the neonate groups over 2 days old were analyzed, and the stillborns, as the first one presented an increase in the expression of Bcl2, of HHF35, and of sarcomeric actin in relation to the second. The collected data showed that the cardiomyocytes present a proliferative characteristic in the stillborn group, and that this follows a temporal line, being replaced by a differentiation character in the neonate group over two days old. This seems to be according to the replacement of the hyperplasic proliferative characteristic of this tissue in the intra-uterine life to a more hypertrophic characteristic, which means, cellular differentiation, in the extra uterine life.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Tecido muscular cardíaco ... 18
Figura 2 – Representação do aparelho contrátil ... 19
Figura 3 – Representação da circulação fetal ... 21
Figura 4 – Circulação neonatal ... 22
Figura 5 – Ciclo dos cardiomiócitos ... 25
Figura 6 – Ação do PTEN no ciclo celular ... 28
Figura 7 – Interação do PTEN com o p53 ... 29
Figura 8 – Atividade anti-apoptose do Bcl2 ... 31
Figura 9 – Atividade do Fas e FasL ... 32
Figura 10 – Ilustração do sistema caderina-catenina ... 34
Figura 11 – Esquema de confecção das lâminas ... 39
Figura 12 – Aquecimento do Punch ... 40
Figura 13 – Retirada da amostra ... 40
Figura 14 – Caixa identificadora ... 40
Figura 15 – Bloco-doador ... 40
Figura 16 – Colocação da amostra na caixa identificadora ... 40
Figura 17 – Blocos-receptores ... 40
Figura 18 – Esquema de lâmina ... 41
Figura 19 – Esquema da classificação da área avaliável ... 44
Figura 20 – Corte histológico com o anticorpo Beta-catenina ... 46
Figura 21 – Corte histológico com o anticorpo Bcl2 ... 47
Figura 22 – Corte histológico com o anticorpo PTEN ... 47
Figura 23 – Corte histológico com o anticorpo HHF 35 ... 48
Figura 24 – Fluxograma da metodologia proposta ... 50
Figura 25 – Cortes histológicos dos anticorpos segundo grupos das amostras ... 59
LISTA DE QUADROS E TABELAS
Quadro 1 – Critérios de inclusão e exclusão da amostra ... 38
Tabela 1 – Número de casos selecionados por grupos das amostras ... 38
Quadro 2 – Especificidades dos anticorpos Fas, FasL, E-caderina e Beta-catenina ... 45
Quadro 3 – Especificidades dos anticorpos Ki67, PCNA, Bcl2 e PTEN ... 45
Quadro 4 – Especificidades dos anticorpos desmina, actina 1 a 4, HHF35 e actina sarcomérica ... 46
Tabela 2 – Número de casos e amostras analisados no estudo ... 51
Tabela 3 – Perfil dos grupos das amostras segundo sexo, idade e causa do óbito ... 51
Tabela 4 – Percentual de casos por fração da amostra avaliável ... 52
Tabela 5 – Percentual de casos pela qualidade da reação ... 52
Tabela 6 – Resultado da análise dos grupos da amostra com o anticorpo Fas e o percentual referente a intensidade da reação ... 53
Tabela 7 – Resultado da análise estatística dos grupos dois a dois ... 53
Tabela 8 – Resultado da análise dos grupos da amostra com o anticorpo FasL e o percentual referente a intensidade da reação ... 53
Tabela 9 – Resultado da análise estatística dos grupos dois a dois ... 54
Tabela 10 – Resultado da análise dos grupos da amostra com o anticorpo E-caderina e o percentual referente a intensidade da reação ... 54
Tabela 11 – Resultado da análise estatística dos grupos dois a dois ... 54
Tabela 12 – Resultado da análise dos grupos da amostra com o anticorpo Beta-catenina e o percentual referente a intensidade da reação ... 55
Tabela 13 – Resultado da análise estatística dos grupos dois a dois ... 55
Tabela 14 – Resultado da análise quantitativa dos anticorpos PCNA, Ki67, PTEN e Bcl2 ... 56
Tabela 15 – Resultado da análise estatística dos grupos dois a dois ... 56
Tabela 16 – Resultado da análise morfométrica das áreas positivas dos anticorpos HHF35, actina sarcomérica e actina 1 a 4 ... 57
Tabela 17 – Resultado da análise estatística na comparação dos grupos dois a dois
para os anticorpos HHF35 e actina sarcomérica ... 58 Tabela 18 – Resultado da análise na comparação dos três grupos no que se refere às
áreas positivas para o anticorpo desmina ... 58
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
BNPP – Banco de Necropsias Pediátricas e Perinatais BTCP – Banco de Tecidos Cardiopediátricos
DNA – Ácido Desoxirribonucléico HCl – Ácido Clorídrico
LSD – Diferença Mínima Significativa Neo -2 – Neomorto até 2 dias de vida
Neo +2 – Neomorto com mais de dois dias de vida NK – Natural Killer
NM – Natimorto
PCNA – Antígeno Nuclear de Proliferação Celular RNA – Ácido Ribonucléico
RNAm – Ácido Ribonucléico mensageiro TMA – Tissue Microarray Artesanal UFPR – Universidade Federal do Paraná
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ... 14
2 REVISÃO DE LITERATURA ... 16
2.1 ASPECTOS GERAIS DO CORAÇÃO HUMANO ... 16
2.1.1 Aspectos Relevantes da Embriologia, Anatomia e Fisiologia do coração ... 16
2.1.2 Aspectos Relevantes da Histologia e Ultra-estrutura do Miocárdio ... 17
2.2 PASSAGEM DA CIRCULAÇÃO FETAL À CIRCULAÇÃO EXTRA-UTERINA ... 20
2.2.1 Aspectos Hemodinâmicos e Anatômicos ... 20
2.2.2 Aspectos Histológicos e Ultra-estruturais ... 23
2.3 ASPECTOS MOLECULARES DA PROLIFERAÇÃO (CRESCIMENTO E APOPTOSE) E DIFERENCIAÇÃO DOS CARDIOMIÓCITOS ... 24
2.3.1 Ciclo Celular (Proliferação Celular) ... 24
2.3.2 Apoptose (Morte Celular) ... 30
2.3.3 Diferenciação dos Cardiomiócitos ... 33
2.3.3.1 Moléculas de Adesão Celular ... 33
2.3.3.2 Microfilamentos e Filamentos Intermediários ... 34
2.3.3.3 Proteínas Contráteis ... 35
3 METODOLOGIA ... 37
3.1 MÉTODO DE LEITURA DOS ANTICORPOS DE INVESTIGAÇAO DA APOPTOSE E ADESÃO CELULAR... 44
3.2 MÉTODO DE LEITURA DOS ANTICORPOS DE INVESTIGAÇAO DO CICLO CELULAR ... 45
3.3 MÉTODO DE LEITURA DOS ANTICORPOS DE INVESTIGAÇAO DOS FILAMENTOS INTERMEDIÁRIOS, MICROFILAMENTOS E PROTEÍNAS CONTRÁTEIS ... 45
3.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA ... 48
4.1 RESULTADOS DAS REAÇÕES IMUNOISTOQUIMICAS PARA OS ANTICORPOS
DE INVESTIGAÇAO DA APOPTOSE E ADESÃO CELULAR ... 52
4.2 RESULTADOS DAS REAÇÕES IMUNOISTOQUIMICAS PARA OS ANTICORPOS DE INVESTIGAÇAO DO CICLO CELULAR ... 55
4.3 RESULTADOS DAS REAÇÕES IMUNOISTOQUIMICAS PARA OS ANTICORPOS DE INVESTIGAÇAO DOS FILAMENTOS INTERMEDIÁRIOS, MICROFILAMENTOS E PROTEÍNAS CONTRÁTEIS ... 57
5 DISCUSSÃO ... 61
5.1 DISCUSSÃO DO MÉTODO ... 61
5.2 DISCUSSÃO DOS RESULTADOS ... 65
5.2.1 Fração da Amostra ... 65
5.2.2 Qualidade da reação ... 65
5.2.3 Discussão dos resultados das reações imunoistoquímicas para os anticorpos de investigação da apoptose (Fas e FasL) ... 66
5.2.4 Discussão dos resultados das reações imunoistoquímicas para os anticorpos de investigação da adesão celular (E-caderina e Beta-catenina)... 67
5.2.5 Discussão dos resultados das reações imunoistoquímicas para os anticorpos de investigação do ciclo celular (Ki67, PCNA, PTEN e Bcl2) ... 67
5.2.6 Discussão dos resultados das reações imunoistoquímicas para os anticorpos de investigação dos microfilamentos e filamentos intermediários (Actina 1 a 4 e Desmina) ... 70
5.2.7 Discussão dos resultados das reações imunoistoquímicas para os anticorpos de investigação das proteínas contráteis (Actinas Musculares) ... 70
6 CONCLUSÕES ... 72
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 73
ANEXO A - AUTORIZAÇÃO DA CHEFIA DO SERVIÇO DE ANATOMIA PATOLÓGICA DO HOSPITAL DE CLÍNICAS DA UFPR ... 78
ANEXO B - APROVAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA EM SERES HUMANOS DO HOSPITAL DE CLÍNICAS DA UFPR ... 80
ANEXO C - AUTORIZAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA DA PONTIFÍCIA UNIVERSIDADE CATÓLICA DO PARANÁ ... 82
1 INTRODUÇÃO
De acordo com Kliegman (2004) e Guyton & Hall (2002) a transição da circulação que ocorre durante os períodos fetal final e neonatal precoce envolve a remoção da circulação de baixa resistência da placenta, o início da respiração de ar, a redução da resistência arterial pulmonar e o fechamento dos shunts utilizados intra-útero.
Durante o desenvolvimento cardíaco, os cardiomiócitos passam por numerosas mudanças fenotípicas. Estas alterações ocorrem durante o ciclo celular, passando segundo MacLellan & Schneider (2000) de um fenótipo proliferativo intra-útero (hiperplásico) para um de crescimento e diferenciação celular extra-útero (hipertrófico). Para Cortius et al (2005) no início da vida fetal o crescimento dos cardiomiócitos é, principalmente, hiperplásico.
Segundo Anversa & Nadal-Ginard (2002) estas células têm que passar por uma transição de hiperplásica para hipertrófica, o que propiciaria um aumento importante da função cardíaca. Durante a fase hipertrófica do desenvolvimento cardíaco, nos cardiomiócitos ventriculares ocorre uma diminuição da síntese de DNA e aumento do tamanho total das células. Durante este tempo, os cardiomiócitos ventriculares mudam de uma forma redonda ou oval para uma forma clássica de fuso. A formação da importante adesão célula-célula e célula-matriz extracelular também ocorrem durante a fase hipertrófica do desenvolvimento cardíaco.
No entanto, o mecanismo molecular que é responsável pela regulação desta transição não é bem conhecido de acordo com Evans et al (2003). O delineamento destes mecanismos é particularmente importante no objetivo de regeneração funcional do miocárdio, através de células primitivas indiferenciadas. É de fundamental importância o conhecimento da proliferação intrínseca e do potencial cardiomiogênico, pois isto poderá acarretar em benefícios clínicos.
Como já descrito, o aumento da massa cardíaca antes do nascimento é fruto da divisão dos cardiomiócitos, enquanto que depois do nascimento, o crescimento se dará pelo aumento do volume das células cardíacas e uma maior diferenciação do citoesqueleto e aparato contrátil. É difícil imaginar como os cardiomiócitos podem lidar com estes processos altamente dinâmicos, que são a divisão celular e a produção das miofibrilas, no curto espaço de tempo em que ocorre o fechamento do canal arterial.
A hipótese deste estudo se baseia no fato de que os cardiomiócitos podem mudar seu fenótipo mais hiperplásico na vida intra-uterina para um fenótipo mais hipertrófico na vida pós-natal precoce, e que algumas moléculas proliferativas, apoptóticas, de adesão celular, de microfilamentos, filamentos intermediários e contráteis podem sofrer modificações na sua expressão durante estas fases. O objetivo deste trabalho é avaliar as alterações na diferenciação e crescimento celular em cardiomiócitos, ocorridas durante a transição da circulação intra e extra-uterina através da análise imunoistoquímica de proteínas envolvidas com processos como apoptose, adesão celular, proliferação, microfilamentos e filamentos intermediários do citoesqueleto e contração muscular, em amostras de miocárdio de natimortos e neomortos a termo.
Para se atingir este objetivo foi traçado os seguintes objetivos específicos:
- analisar a expressão imunoistoquímica de marcadores da apoptose (Fas e FasL) em miocárdio de natimortos e neomortos a termo;
- analisar a expressão imunoistoquímica de marcadores da adesão celular (E-caderina e Beta-catenina) em miocárdio de natimortos e neomortos a termo;
- analisar a expressão imunoistoquímica de marcadores do ciclo celular (Ki67, PCNA, PTEN e Bcl2) em miocárdio de natimortos e neomortos a termo;
- analisar a expressão imunoistoquímica de filamentos intermediários, microfilamentos e de proteínas contráteis (desmina, actina 1 a 4, HHF35 e actina sarcomérica) em miocárdio de natimortos e neomortos a termo.
2 REVISÃO DE LITERATURA
De acordo com Schmitt et al (2007) a homeostasia dos tecidos biológicos requer um equilíbrio cuidadosamente orquestrado entre a proliferação, envelhecimento e morte celular. A proliferação, através do ciclo celular, é regulada pela atividade das quinases. O envelhecimento celular é um programa de proteção que limita a competência de proliferação de células em organismos vivos. E a apoptose elimina células indesejáveis através de uma atividade coordenada de produtos gênicos que regulam e executam a morte celular.
Este equilíbrio tem sido cada vez mais pesquisado no tecido cardíaco, pois, segundo Pasumarthi e Field (2002), os mecanismos que regulam o ciclo dos cardiomiócitos ainda permanecem obscuros frente, principalmente, ao rápido progresso observado em muitas áreas da cardiologia molecular.
2.1 ASPECTOS GERAIS DO CORAÇÃO HUMANO
2.1.1 Aspectos Relevantes da Embriologia, Anatomia e Fisiologia do Coração
O coração é uma bomba muscular que impele sangue para todos os sistemas orgânicos. Segundo Brook (2004), o coração começa a se desenvolver no embrião e produz circulação de sangue a partir da terceira semana de desenvolvimento. De acordo com Bernstein (2005), o processo pelo qual as células totipotentes do embrião em fase inicial se tornam comprometidas com linhagens celulares específicas é chamado de diferenciação. As células mesodérmicas pré-cardíacas se diferenciam em células musculares cardíacas com um complemento apropriado de elementos contráteis cardíaco-específicos, proteínas regulatórias, receptores e canais iônicos. A diferenciação nessas células mesodérmicas primordiais é regulada por sinais provenientes do endoderma anterior, um processo conhecido como indução.
Segundo Brook (2004), o coração inicialmente é um tubo estreito sem valvas. Como o tubo cardíaco cresce mais rápido que os órgãos ao seu redor, ele se curva e a medida que o coração se divide em quatro câmaras, as valvas também se desenvolvem. De acordo com Moore & Dalley (2001), as paredes das quatro câmaras que constituem o coração são compostas de três lâminas: endocárdio, miocárdio e epicárdio, sendo preponderante a presença do miocárdio espesso, principalmente nos ventrículos. Quando os ventrículos se contraem, produzem um movimento de torcedura em virtude da orientação em espiral das fibras musculares cardíacas, e é este movimento que propele o sangue.
No que se referem às características da musculatura cardíaca, pode-se distingui-la em três grupos: músculo atrial, ventricudistingui-lar e fibras muscudistingui-lares especializadas excitatórias e condutoras. De acordo com Guyton & Hall (2002), os músculos do tipo atrial e ventricular contraem-se de maneira similar aos músculos esqueléticos, diferenciando-se pela duração de contração. As fibras miocárdicas excitatórias e condutoras contraem-se muito fracamente e exibem ritmicidade e velocidade de condução variável, formando um sistema excitatório, que controla o ritmo da contração cardíaca.
2.1.2 Aspectos Relevantes da Histologia e Ultra-estrutura do Miocárdio
Conforme relata Sedmera (2005), a organização anatômica do miocárdio tem sido estudada através dos séculos; entretanto a interpretação dessa complexa arquitetura permanece com controvérsias. O ponto de discordância encontra-se na interpretação do padrão de organização das fibras do miocárdio; todavia um consenso refere-se à forma helicoidal desta estrutura.
O tecido contrátil cardíaco é composto por células individuais, os cardiomiócitos. De acordo com Tskhovrebova & Trinick (2003), para assegurar as funções desta célula, dois complexos multiprotéicos do citoesqueleto, as miofibrilas e os discos intercalares, têm que estar unidos corretamente, como pode ser observado na figura 1.
Figura 1 – Tecido muscular cardíaco Fonte: Gartner & Hiatt, 2007
Conforme Alberts et al (2007) outros componentes do citoesqueleto são fundamentais à organização espacial das células, tais como os filamentos intermediários e os microfilamentos (desmina e actina). A desmina proporciona força mecânica e resistência para enfrentar o estresse, enquanto os microfilamentos de actina determinam a forma da superfície celular e são fundamentais à locomoção da célula como um todo. Isoladamente estes filamentos são absolutamente ineficientes.
De acordo com os mesmos autores, a funcionalidade de uma célula depende de um grande número de moléculas de adesão, por exemplo, a Beta-catenina e E-caderina, que tanto interligam os filamentos entre si quanto os conectam aos outros componentes celulares. Esse grupo de proteínas é essencial para o controle da montagem dos filamentos do citoesqueleto em locais definidos e inclui as proteínas motoras, que tanto podem mover organelas ao longo dos filamentos quanto podem movimentar os próprios filamentos.
De acordo com Alberts et al (2007), as junções celulares, que são constituídas por moléculas de adesão, são classificadas em bloqueadoras, comunicantes e de ancoramento. Esta última conecta mecanicamente as células (e seu citoesqueleto) às células vizinhas ou à matriz extracelular e está amplamente distribuída no tecido cardíaco, tendo em vista que é mais abundante nos tecidos sujeitos a estresse mecânico. Os mesmos autores classificam as junções de ancoramento em duas formas funcionais que são as junções aderentes e as adesões focais. As junções aderentes mantêm as células unidas e são formados por moléculas de adesão transmembranas tais como as caderinas. Já as adesões focais unem as células à matriz extracelular. As
M – Miofibrila N – Núcleo
junções aderentes se apresentam na forma de pequenos pontos ou linhas que, indiretamente, conectam os filamentos de actina cortical, abaixo da membrana plasmática, entre duas células vizinhas.
Para Tskhovrebova & Trinick (2003), as miofibrilas consistem de filamentos de actina e miosina que são organizados de maneira a assegurar a máxima força de contração. Sua unidade básica é o sarcômero, que está definida entre duas linhas conhecidas como linhas Z. No sarcômero encontra-se o filamento delgado da actina e o espesso da miosina. Um terceiro filamento protéico encontrado é a titina que é extremamente elástico, atuando como arcabouço, que reveste os filamentos de actina e miosina, a fim de produzir a maquinaria contrátil para o trabalho do sarcômero, conforme a figura 2. Segundo Perriard et al (2003), os discos intercalares são locais especializados que asseguram a comunicação intercelular, integração mecânica e transmissão de força entre cardiomiócitos vizinhos, garantindo uma perfeita contração do tecido cardíaco.
Figura 2 – Representação do aparelho contrátil Fonte: Gartner & Hiatt, 2007
O tecido muscular cardíaco, que embora apresente na sua ultra-estrutura aspectos similares ao tecido esquelético estriado, apresenta característica de contração involuntária. Entretanto, Cormack (2001) demonstra que as miofibrilas cardíacas variam de diâmetro e se anastomosam, em vez de serem cilíndricas e separadas como as
Lâmina basal Túbulo T
Retículo Sarcoplasmático
Glicogênio
Miofibrila Faixa de adesão
Desmossoma Filamento de titina Filamento de Actina Linha M Mitocôndria Linha Z Filamento de miosina
estriadas. Além disso, encontram-se numerosas mitocôndrias entre as miofibrilas e nos pólos dos núcleos, diferente do que é encontrado nos músculos esqueléticos.
O coração apresenta, segundo Moore & Dalley (2001), peculiaridades de bomba muscular, fruto de seu aspecto auto-regulador e pela sua divisão em dois compartimentos (direito e esquerdo). Todavia para atingir este grau de complexidade passa por processos de alterações e desenvolvimento, que ocorrem, principalmente, na transição de feto a neonato.
2.2 A PASSAGEM DA CIRCULAÇÃO FETAL À CIRCULAÇÃO EXTRA-UTERINA
2.2.1 Aspectos Hemodinâmicos e Anatômicos
A passagem da condição de feto à vida extra-uterina exige adaptações anatômicas e fisiológicas fundamentais à sobrevida, de acordo com Kliegman (2004). O estudo do desenvolvimento cardíaco e das adaptações circulatórias nesta fase transitória, tanto em tecidos humanos como em modelos animais, vem há muito tempo sido explorado em inúmeras pesquisas, buscando compreender este processo de maneira mais efetiva e aprofundada.
Os pulmões são praticamente não-funcionais durante a vida fetal, e o fígado funciona parcialmente, o que repercute diretamente na atividade cardíaca, pois não há a necessidade de que o coração bombeie muito sangue para tais órgãos. Todavia, o coração fetal deve bombear uma grande quantidade de sangue à placenta. Dessa forma, arranjos anatômicos são encontrados no sistema cardiovascular no processo de passagem da vida intra-uterina ao neonato, conforme a figura 3.
Figura 3 – Representação da circulação fetal Fonte: Adaptado do Guyton & Hall, 2002
Guyton & Hall (2002) descrevem, inicialmente, sobre o sangue oxigenado que retorna da placenta pela veia umbilical passando pelo canal venoso penetrando pelo átrio direito, proveniente da veia cava inferior seguindo pela face posterior do átrio direito e pelo forâmen oval, diretamente para o átrio esquerdo. Por conseguinte, este sangue bem-oxigenado proveniente da placenta é bombeado pelo ventrículo esquerdo, principalmente, para as artérias da cabeça e dos membros superiores. O sangue que penetra venoso no átrio direito a partir da veia cava superior segue seu curso para baixo, através da válvula tricúspide, ao ventrículo direito. Esse sangue venoso provém da região da cabeça do feto e é bombeado pelo ventrículo direito à artéria pulmonar e, a seguir, em sua maior parte passa pelo canal arterial, para a aorta descendente e pelas duas artérias umbilicais para a placenta, onde o sangue desoxigenado volta a ser oxigenado.
A transição da circulação que ocorre durante o período fetal final e neonatal precoce envolve a remoção da circulação de baixa resistência da placenta, o início da
respiração de ar, a redução da resistência arterial pulmonar e o fechamento dos shunts utilizados intra-útero, como verificado na figura 4.
Figura 4 – Circulação neonatal Fonte: Adaptado de Kliegman, 2004
Segundo Kliegman (2004) e Guyton & Hall (2002), as alterações primárias da circulação por ocasião do nascimento são, em primeiro lugar, a perda do fluxo sanguíneo através da placenta, o que praticamente duplica a resistência vascular sistêmica ao nascimento. Isto ocorre quando o cordão umbilical é pinçado e o sistema de baixa pressão da placenta torna-se inoperante, elevando a pressão arterial sistêmica. Conseqüentemente, ocorre um aumento da pressão aórtica, além das pressões atriais e ventriculares do compartimento esquerdo. Em segundo lugar, a resistência vascular pulmonar diminui acentualmente, em decorrência da expansão pulmonar. O retorno venoso proveniente da placenta se reduz, havendo um decréscimo da pressão atrial direita. Com isso este compartimento cardíaco passa a receber o retorno venoso sistêmico e o compartimento esquerdo passa a desempenhar suas funções sob um sistema de maior pressão. O maior fluxo sanguíneo para os pulmões devido a sua baixa pressão pós-natal resulta no retorno de maior volume de sangue venoso pulmonar para o átrio esquerdo; a elevada pressão atrial esquerda é responsável pelo fechamento do forâmen oval.
De acordo com Bernstein (2005), o principal declínio na resistência pulmonar a partir dos elevados níveis fetais para os níveis baixos no neonato geralmente ocorre nos primeiros dois a três dias, mas pode ser prolongado por até sete dias ou mais.
2.2.2 Aspectos Histológicos e Ultra-estruturais
Para Walker & Tombe (2004), durante a gestação, o coração dos mamíferos opera sob condições hemodinâmicas muito diferentes quando comparadas ao que se observa na vida adulta. Estas grandes mudanças ocorrem na carga hemodinâmica durante o curso do desenvolvimento cardíaco. Conforme Lahmers et al (2004), sabe-se que ocorrem mudanças nas características contráteis do miócito cardíaco, fruto das alterações no padrão de expressão das proteínas sarcoméricas. Pesquisas realizadas a algumas décadas demonstram que a força passiva é maior no miocárdio fetal e decresce progressivamente com o passar da idade. Entretanto, estes trabalhos, não foram levados adiante. Além disso, a base molecular de adaptação da força passiva durante o desenvolvimento cardíaco não é ainda totalmente conhecida.
Segundo Lahmers et al (2004), durante a diferenciação, a arquitetura do citoesqueleto e o sistema contrátil nos cardiomiócitos passam por um desenvolvimento progressivo e maturação estrutural, o qual é acompanhado por uma intensa formação de novas miofibrilas e elementos do citoesqueleto.
No desenvolvimento cardíaco, mudanças na expressão das proteínas dos sarcômeros (miosina, actina e a titina) ocorrem numa relação temporal que geram alterações em suas propriedades funcionais. A partir deste fenômeno, pesquisas foram realizadas buscando compreender este processo. De acordo com Godt et al (1991), a capacidade de geração de força tem demonstrado um acréscimo importante da massa dos músculos cardíacos durante o desenvolvimento embrionário das aves. Já nos músculos cardíacos dos mamíferos este desenvolvimento ocorre principalmente na fase pós-natal, sugerindo um acúmulo de proteínas contráteis.
De acordo com Mazzieri & Ebaid (2000), as técnicas desenvolvidas até o presente momento, incluindo a microscopia eletrônica e a imunoistoquímica, dentre outras, estão expandindo nossos conhecimentos e, poderão auxiliar na elucidação das alterações estruturais, que são encontradas no desenvolvimento do coração na vida intra e
extra-uterina. Os mesmos autores descrevem a importância de compreender quatro processos na expressão morfológica cardíaca, que são: multiplicação, migração, diferenciação e morte celular. Estes processos fazem parte do ciclo celular, que, segundo Cooper (2002), consiste em quatro processos coordenados: crescimento celular, replicação do DNA, distribuição dos cromossomos e divisão citoplasmática. Embora o crescimento celular seja normalmente um processo contínuo, o DNA é sintetizado somente durante uma fase do ciclo celular, e os cromossomos duplicados são distribuídos por uma série complexa de eventos que ocorrem durante a divisão celular. O curso entre estágios do ciclo celular é controlado por sistema regulador conservador, que não só coordena os diferentes eventos do ciclo como também o liga aos sinais extracelulares, que controlam a proliferação celular.
2.3 ASPECTOS MOLECULARES DO CRESCIMENTO (PROLIFERAÇÃO E APOPTOSE) E DIFERENCIAÇÃO DOS CARDIOMIÓCITOS
2.3.1 Ciclo Celular (Proliferação Celular)
Conforme Alberts et al (2002), os eventos do ciclo celular acontecem quando o núcleo se divide na mitose. Este processo compõe a fase M do ciclo celular. O período entre uma fase M e a próxima é denominada interfase, que é um período de atividade celular e é dividido em três fases remanescentes do ciclo celular (G1, S e G2). Durante a fase S (S = síntese), a célula replica seu DNA nuclear, um pré-requisito essencial para a divisão celular. A fase S é ladeada por duas fases onde a célula continua a crescer. A fase G1 (G = intervalo) é o intervalo entre o término da fase M e o início da fase S. A fase G2 é o intervalo entre o término da fase S e o início da fase M.
Segundo Cooper (2002), o curso das células do ciclo celular é regulado por sinais extracelulares do ambiente, assim como sinais internos que monitoram e coordenam os vários processos que acontecem durante as diferentes fases do ciclo celular. A proliferação das células é regulada na fase G1, sendo chamado de ponto de restrição, e esta regulação ocorre pelos fatores de crescimento extracelular que sinalizam à proliferação celular. Na presença de fatores de crescimento apropriados, as células
atravessam o ponto de restrição e entram na fase S. Por outro lado, se os fatores não estão disponíveis em G1, a continuação através do ciclo celular é interrompida no ponto de restrição. Estas células bloqueadas, então, entram em um estágio inativo, chamado G0, no qual permanecem sem proliferação. Ainda assim, nessa fase, as células são metabolicamente ativas, embora parem de crescer e porque reduz seus níveis de síntese protéica.
No que se refere ao ciclo celular dos cardiomiócitos, Kajstura et al (1998), afirmam que persiste um dogma que as células cardíacas são altamente diferenciadas e que a divisão das células é impossível no coração adulto, estando estas na fase G0, como pode ser observado na figura 5. Entretanto, este comportamento não pode ser extrapolado para o coração fetal.
Figura 5 – Ciclo dos cardiomiócitos Fonte: Alberts et al, 2002
O crescimento cardíaco durante a vida fetal é caracterizado pela multiplicação dos cardiomiócitos. De acordo com Field (2004), logo após o nascimento, a atividade cíclica dos cardiomiócitos é reduzida. Aumentos subseqüentes da massa cardíaca acontecem, principalmente, fruto do crescimento hipertrófico de cardiomiócitos pré-existentes, isto é, de sua diferenciação, por acúmulo de proteínas contráteis, moléculas de adesão e filamentos intermediários. No coração dos mamíferos adultos, o nível da atividade do ciclo celular dos cardiomiócitos parece ser aparentemente baixo, refletindo baixa taxa de multiplicação. Segundo Pasumarthi & Field (2002), a capacidade cíclica do cardiomiócito
adulto tem recebido uma considerável atenção. É geralmente aceito que esta célula permanece com alguma capacidade de sintetizar DNA. Entretanto, há um considerável debate em relação à freqüência que isto ocorre e se o reinício da síntese de DNA necessariamente leva à divisão celular.
Durante o curso do desenvolvimento normal do coração, os cardiomiócitos passam por numerosas mudanças fenotípicas. Estas alterações ocorrem durante o ciclo celular, passando, segundo MacLellan & Schneider (2000), de um fenótipo proliferativo intra-útero (hiperplásico) para um de crescimento e diferenciação celular extra-útero (hipertrófico). Para Cortius et al (2005), no início da vida fetal, o crescimento dos cardiomiócitos é, principalmente, hiperplásico. Entretanto, quando ocorre a maturação destes, na fase pré-natal imediata ou logo após o nascimento, há uma mudança para a fase hipertrófica de crescimento. Essa transição, que ocorre logo após o nascimento, foi caracterizada por Pasumarthi & Field (2002) como um aumento da densidade das miofibrilas, aparecimento de discos intercalares e a formação de cardiomiócitos binucleados, que, por sua vez, não se dividem completamente, resultando em células com dois núcleos, onde o DNA está duplicado com a finalidade de se ter altos níveis de transcrição e tradução, resultando em aumento da massa protéica contrátil. Segundo Anversa & Nadal-Ginard (2002), essas células têm que passar por uma transição de hiperplásica para hipertrófica, o que propiciaria um aumento importante da função cardíaca. Durante a fase hipertrófica do desenvolvimento cardíaco, nos cardiomiócitos ventriculares ocorre uma diminuição da síntese de DNA e aumento do tamanho total das células. Durante esse tempo, os cardiomiócitos ventriculares mudam de uma forma redonda ou oval para uma forma clássica de fuso. A implantação das adesões célula-célula e célula-célula-matriz extracelular também ocorre durante a fase hipertrófica do desenvolvimento cardíaco.
De acordo com os estudos realizados em camundongos por Soonpaa et al (1996) há duas fases distintas de síntese de DNA nos cardiomiócitos. A primeira fase ocorre na vida fetal e estava associada exclusivamente com a proliferação dos cardiomiócitos. Já a segunda fase ocorre imediatamente após o nascimento e está associada, principalmente, com a formação de cardiomiócitos binucleares sem divisão, para ocorrer o aumento de massa protéica contrátil. Este fenômeno sugere que a proliferação das células cardíacas cessa antes do nascimento em camundongos e que as proteínas reguladoras da proliferação celular, tais como o Ki67, PCNA, Bcl2 e o PTEN, provavelmente, poderiam estar expressas de forma diferente durante as fases de vida
fetal e neonatal, marcando essa transição. No entanto, o mecanismo molecular que é responsável pela regulação dessa transição não é bem conhecido de acordo com Evans et al (2003). O delineamento desses mecanismos é particularmente importante no objetivo de regeneração funcional do miocárdio, através de células primitivas indiferenciadas. A esperança futura de trazer novas descobertas e avanços na compreensão da regulação do ciclo celular dos cardiomiócitos favorece a capacidade de promover um crescimento regenerativo do miocárdio. É de fundamental importância o conhecimento da proliferação intrínseca e do potencial cardiomiogênico, pois isto poderá acarretar em benefícios clínicos.
Conforme Pasumarthi & Field (2002), culturas de cardiomiócitos dispersos enzimaticamente têm sido amplamente utilizadas para estudar o ciclo celular. Numerosas moléculas reguladoras que controlam o ciclo celular têm sido identificadas. Além disto, moléculas que promovem ou suprimem a síntese de DNA nos cardiomiócitos e/ou proliferação buscam esclarecer todo este processo.
Segundo Soonpaa e Field (1998), durante o desenvolvimento pós-natal, o crescimento cardíaco passa por uma mudança significante, que é representada pelo aumento da massa miocárdica sem ocorrer concomitantemente uma proliferação dos cardiomiócitos. De acordo com Johnatty et al (2000) a resposta ao crescimento, lesão ou aumento na carga de trabalho é restrito ao aumento da massa dos miócitos existentes, principalmente pela hipertrofia dos cardiomiócitos maduros.
De acordo com Tamamori-Adachi et al (2003), os cardiomiócitos de mamíferos perdem irreversivelmente sua capacidade de proliferação logo após o nascimento, entretanto o mecanismo que regula este processo ainda parece obscuro, sendo necessário maior aprofundamento na compreensão do comportamento desta célula específica.
Conforme Tam et al (1995), a diferenciação dos miócitos maduros os retira permanentemente do ciclo celular, ficando os mesmos em G0. Se estrutura, a partir disto, um dogma que os cardiomiócitos adultos são células impossibilitadas de diferenciação. Entretanto, a visão que os cardiomiócitos não podem entrar no ciclo celular tem sido contestada.
Muitas moléculas reguladoras que controlam o ciclo das células nos mamíferos têm sido recentemente identificadas. Segundo Tamamori-Adachi et al (2003), a proteína nuclear Ki67 é expressa no ciclo de proliferação celular em todas as fases, sendo associada com a divisão celular e, dessa forma, não é encontrada na fase G0. Conforme
Beltrami et al (2001), o Ki67 torna-se particularmente evidente no final da fase S e é aumentada na fase G2-M. Embora o Ki67 não seja um marcador específico para o estágio G2-M, os cardiomiócitos que se dividem em condições patológicas apresentam evidências do Ki67 em seus núcleos, sendo este utilizado como índice mitótico.
Tamamori-Adachi et al (2003) relatam que se pode observar no núcleo o antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA), que está presente na mitose de todos os tecidos humanos. De acordo com Warbrick (1995) e Amann et al (1998), o PCNA está mais envolvido na diferenciação celular e sua expressão é encontrada na transição das células do repouso à fase S. Nos cardiomiócitos têm-se observado que o PCNA/RNAm é expressada em todos os estágios do desenvolvimento. Entretanto, o PCNA foi encontrado apenas em cardiomiócitos embrionários e neonatais, mas não em adultos.
Outro anticorpo utilizado na investigação do ciclo celular é o PTEN, que foi descoberto em 1997 como um gene supressor de tumores, e está alterado por mutações somáticas em vários tipos de carcinomas. Segundo Simpson & Parson (2001) e Yamada & Araki (2001), o PTEN está envolvido na regulação de importantes funções celulares, como a progressão do ciclo celular, migração e crescimento celular e na apoptose.
De acordo com Weng et al (2001), o PTEN inibe a progressão do ciclo celular à fase G1 através da inibição das quinases. Este processo ocorre pela associação do PTEN com a proteína Rb, propiciando uma alta concentração do p27 e p21, que são proteínas inibidoras das quinases. O p27 e o p21, quando em altas concentrações, impedem a ativação das ciclinas pelas quinases e, consequentemente, impedem a indução, pelas ciclinas ativadas, da passagem da fase G1 para a fase de síntese protéica, conforme a figura 6.
Figura 6 – Ação do PTEN no ciclo celular Fonte: Pesquisador
Na ausência do PTEN Na presença do PTEN
Inibidores da quinase P21 p27
G0
Os estudos de Mayo et al (2002) demonstram que o PTEN também protege o p53 da degradação proporcionada pelo mediador Mdm2, como pode ser observado nafigura 7. Além disso, há evidências de que o p53 também pode funcionar como fator de transcrição do PTEN, sugerindo que estas duas proteínas possam atuar em cooperação, como em um sistema de feedback positivo, para o controle da resposta celular (apoptose) ao estresse, danos no DNA e câncer. Considerados juntos, estes dados revelam uma complexa rede de interações entre diferentes vias sinalizadoras, sendo que o PTEN pode ser um importante mediador dessas interações.
Figura 7 – Interação do PTEN com o p53 Fonte: Pesquisador
Anversa et al (2002) afirmam que uma idéia defendida há décadas, persiste até os dias de hoje, que os cardiomiócitos são células diferenciadas e o reparo cardíaco por regeneração é completamente inibido logo após o nascimento. Além desses autores, poucos estudos com foco na proliferação dos cardiomiócitos humanos no período perinatal têm sido apresentados.
Para Chen et al (2004), os mecanismos moleculares responsáveis pela diferenciação dos cardiomiócitos, particularmente voltadas ao ciclo celular, são ainda obscuros. Além disso, há também controvérsias sobre a capacidade limitada dos cardiomiócitos adultos reentrar no ciclo celular. A compreensão dos mecanismos moleculares envolvidos no bloqueio da mitose nas células cardíacas durante a vida pós-natal pode facilitar o desenvolvimento de novos tratamentos de desordens
Degradação
p53 Mdm2
PTEN
p53 Mdm2
Células não entram em apoptose Células mais susceptíveis à apoptose
cardiovasculares, baseados na regeneração do miocárdio adulto. Para atingir este objetivo, é essencial identificar e caracterizar as chaves moleculares participantes no crescimento do coração do recém-nascido.
2.3.2 Apoptose (Morte Celular)
A apoptose, ou morte celular programada, segundo Chen et al (2004), é um processo de regulação utilizado para remover excessos ou células somáticas lesadas e é fundamental para o desenvolvimento, manutenção e sobrevivência dos organismos vivos. Entretanto, alterações no controle da apoptose contribuem a uma gama de doenças. Na verdade, marcadores morfológicos e bioquímicos de apoptose identificam uma ampla variedade de doenças cardíacas. Um número de fatores envolvidos na apoptose dos cardiomiócitos são atualmente conhecidos, e incluem o IGF-I, SAPKs e a família do Bcl2 anti-apoptose.
De acordo com Cooper (2002), durante a apoptose, o DNA cromossomal normalmente está fragmentado como resultado da clivagem entre nucleossomos. A cromatina condensa e o núcleo, então, se dissolve em pequenos pedaços (cariólise). Finalmente, a própria célula diminui de volume e dissolve-se em fragmentos inclusos em membrana chamados de corpos apoptóticos (citólise). Tais células e fragmentos são facilmente reconhecidos e fagocitados por macrófagos. Deste modo, células que morrem por apoptose são eficientemente removidas dos tecidos sem inflamação. Em contraste, células que morrem em resultado de lesão aguda aumentam de volume e sofrem lise, liberando seus conteúdos no espaço extracelular e causando inflamação.
Para Alberts et al (2007), a maquinaria intracelular responsável pela apoptose depende de uma família de proteases, denominadas caspases, as quais interagem com outras moléculas envolvidas no processo de apoptose, tais como Bcl2 e Fas. A ativação da via de morte celular, como a entrada em um novo estágio do ciclo celular, é normalmente desencadeada por um modelo de tudo-ou-nada. A cascata de proteases não é somente destrutiva e auto-estimulada, mas também irreversível; uma vez que a célula tenha avançado até um ponto crítico ao longo da via de destruição, ela não pode voltar atrás.
Estudos sobre a apoptose no coração foram desenvolvidos nos tecidos humanos e animais. De acordo com Chen et al (2001) e Brocheriou et al (2000), estes estudos têm demonstrado que os cardiomiócitos passam pela apoptose numa variedade ampla de situações fisiopatológicas, incluindo isquemia, sobrecarga hemodinâmica e falha cardíaca. Em resposta à isquemia do miocárdio, a apoptose frequentemente precede a necrose e a inibição da apoptose por uma variedade de intervenções farmacológicas e genéticas resultam em infartos menores. Estes achados, que têm como foco a apoptose no coração, são de extrema importância, pois proporcionam informações valiosas à compreensão dos tratamentos de proteção cardíaca.
A Bcl2 é uma proteína, segundo Imahashi et al (2004), que apresenta uma característica anti-apoptótica; além disto, tem um importante papel na regulação da função e metabolismo das mitocôndrias, conforme observado na figura 8.
Figura 8 – Atividade anti-apoptose do Bcl2 Fonte: Janenay et al, 2002
Weisleder et al (2004) relatam que, atualmente, muitos esforços em direção ao tratamento dos distúrbios cardíacos estão focados na prevenção da morte celular. E o Bcl2 é de particular interesse à proteção contra a morte dos cardiomiócitos. Embora o Bcl2 seja expressa em baixos níveis nos cardiomiócitos, esse potente modulador da morte celular é um promissor agente terapêutico para distúrbios cardíacos, porque tem demonstrado a capacidade de reduzir a morte celular durante a isquemia, através do bloqueio do p53 e do aumento da capacidade das mitocôndrias para resistir a altos níveis de cálcio. Conforme Itahana et al (2001) & Nakajima et al (2004), a p53 é uma proteína extraordinária que tem a capacidade de regular a proliferação celular e apoptose, observando-se em recentes pesquisas sua relevância na regulação da
Em uma célula normal, o citocromo c está presente
somente na mitocôndria
Quando a morte celular programada é induzida, a mitocôndria incha e vaza, liberando o citocromo c,
que se liga à Apaf-1
O complexo Apaf-1/citocromo
c ativa a caspase, a qual cliva
I-CAD, liberando o CAD para entrar no núcleo
e clivar o DNA
A Bcl2 liga-se à membrana mitocondrial, bloqueando o entumescimento e, portanto,
bloqueando o processo que leva à morte celular
atividade no ciclo dos cardiomiócito, estando relacionada a altas taxas de multiplicação celular.
De acordo com Kang et al (2000), além do Bcl2, observam-se as caspases que previnem a apoptose; entretanto, não bloqueiam a liberação do citocromo c, que é observado na ação do Bcl2. Um importante caminho à ativação das caspases é através de mecanismos independentes da mitocôndria, que utiliza receptores da morte celular, como por exemplo, o Fas. Para Ashkenazi & Dixit (1998), o antígeno Fas é um receptor da superfície celular que pertence à superfamília de fatores de necrose tumoral que ativam a apoptose em células sensíveis. A atividade do Fas envolve uma série de interações proteína-proteína intracelulares que resulta de uma cascata de ativação de proteases, clivagem de substratos celulares e morte celular, conforme a figura 9.
O ligante Fas (FasL) é uma molécula trimétrica. O Fas é
um monômero
A ligação do FasL causa a trimerizacao do Fas, o qual
então se liga às proteínas adaptadoras contendo domínios
de morte
As proteínas adaptadoras recrutam e ativam a caspase
8, que cliva a caspase 3
A caspase 3 ativada cliva o I-CAD, o inibidor do I-CAD, o qual é liberado para entrar no
núcleo e clivar o DNA
Figura 9 – Atividades do Fas e Fas Ligante Fonte: Janenay et al, 2002
Segundo Kalivendi et al (2005), o Fas desenvolve um importante papel na regulação da homeostasia do sistema imune. Subsequentemente, o mecanismo imunológico tem sido observado em algumas patologias cardiovasculares, deixando os cientistas atentos na relação entre a atividade do Fas e estas desordens. Foi encontrada uma associação entre a expressão elevada do Fas induzida pelo exercício intenso em
cardiomiopatias e infarto do miocárdio com o que foi observado também no Fas da apoptose induzida por drogas anti-tumorais.
Conforme Alenzi et al (2005), uma das maiores características da cascata de apoptose é a aliança entre o Fas/CD95 com o FasL/CD95L. O Fas é geralmente expresso numa grande variedade de células, incluindo o fígado, o pulmão, o intestino, o coração, o rim, o ovário, vários linfomas e células leucêmicas. Em contrapartida, a expressão do FasL parece ser mais restrita às células exterminadoras naturais (NK) e linfócitos T.
De acordo com Yang et al (2003), a expressão do Fas deve ser responsável pela hipertrofia do miocárdio não-isquêmico, como conseqüência de uma sobrecarga pressórica e o FasL exerce uma potente ação antiinflamatória nos casos de lesão isquêmica do miocárdio. O Fas, de fato, está envolvido na apoptose, mas a forma pela qual este receptor regula este processo no cardiomiócito induzido pela isquemia deve ser diferente do processo clássico de apoptose pelo Fas.
2.3.3 Diferenciação dos Cardiomiócitos
2.3.3.1 Moléculas de Adesão Celular
A junção célula-célula é constituída, de acordo com Abe & Takeichi (2008), pela caderina, catenina e outras proteínas associadas. As moléculas de caderina ligam-se através dos seus domínios extracelulares, funcionando como um elo físico entre as membranas celulares. A região citoplasmática da caderina liga-se a Beta-catenina formando assim o complexo caderina-catenina. Este complexo interliga-se com os filamentos de actina e esta ligação é fundamental à manutenção da junção celular, como observado na figura 10.
Figura 10 – Ilustração do sistema caderina-catenina Fonte: Cooper, 2002
Os estudos de Goyal et al (2008) demonstram o papel crucial deste complexo na adesão das células epiteliais e na manutenção da arquitetura dos tecidos. Perturbações na expressão ou função deste complexo resultam na perda da adesão intercelular, que poderá ter como conseqüência alterações na morfologia das células e progressão tumoral. Apesar disso, poucos estudos têm investigado simultaneamente a expressão da E-caderina e as cateninas; entretanto, vários marcadores moleculares têm sido utilizados pela imunoistoquímica, contudo com grupos das amostras pequenos.
Segundo Ulrich et al (2005), a atuação deste complexo na junção célula-célula não é estático, mas sim modulado dinamicamente durante vários processos fisiológicos e patológicos, entre os quais podem-se citar a mitose, oncogênese e transições durante o desenvolvimento embrionário.
2.3.3.2 Microfilamentos e Filamentos Intermediários
Segundo Rappaport et al (1998), a rede de organização do citoesqueleto junto com proteínas de adesão celular são essenciais no ajuste da função das mitocôndrias e, particularmente, a permeabilidade da membrana externa mitocondrial.
Em modelos animais de sobrecarga de pressão arterial, Ishibashi et al (1996) afirmam que há evidências de que os filamentos intermediários podem responder ao estresse fisiológico e que as mudanças resultantes podem interferir na função celular.
Junções aderentes Desmossomo Filamento de actina Membrana plasmática Cateninas Caderina Filamentos intermediários
Caderinas Placa Desmoplaquina Lado
externo da célula
A actina, um microfilamento, é a maior proteína estrutural da linha Z que proporciona uma correta orientação e fixação mecânica dos filamentos de actina contrátil dentro dos sarcômeros, sendo indispensável à progressão normal de todos os estágios da miofibrilogênese.
A actina, segundo Abdelwahid et al (2004), realiza um importante papel na regulação do crescimento celular, bem como na apoptose. Evidências para esta afirmação são encontradas em algumas pesquisas, como realizada por White et al (2001), demonstrando que a perda da integridade do filamento de actina correlaciona-se com a indução de apoptose no epitélio de vias aéreas. Yamazaki et al (2000), observaram em sua pesquisa quebra da molécula de actina, quando induziu alterações no DNA no processo do ciclo celular, o que levaria a uma apoptose, bem como a ativação da p53, a chave reguladora deste processo de morte celular.
Na linha Z também se encontra a proteína desmina, que é uma proteína de filamento intermediário que se observa na composição dos músculos e células endoteliais. De acordo com Costa et al (2004), esta proteína é expressa desde a formação inicial dos músculos esqueléticos, cardíacos, lisos e células endoteliais. A desmina e a actina estão presentes em todos os centros de organização de contração nos três tipos de células musculares. A distribuição de ambas as proteínas é, na maioria das vezes, coincidente; entretanto, não restrita ao mesmo local. Em células não musculares, a actina sarcomérica está distribuída ao longo de microfilamentos de actina e os liga à membrana, enquanto que no músculo estriado é importante no processo de miofibrilogênese. Nos cardiomiócitos, tem-se a mais alta proporção de desmina como também o maior número de mitocôndrias.
Segundo Sheh et al (2004), a desmina é responsável pelas propriedades elásticas dos músculos, bem como resistência a força. Se existem muitas funções da desmina, é prudente assumir que ela deve ter diferentes papéis na musculatura esquelética, cardíaca e lisa.
2.3.3.3 Proteínas Contráteis
No desenvolvimento do coração, muitas proteínas miofibrilares demonstram fases específicas no seu padrão de expressão, com a maior mudança ocorrendo no momento
do nascimento. Segundo Carrier et al (1992), no momento do nascimento, tanto a alfa-actina sarcomérica cardíaca (60 a 70%) como a esquelética (30 a 40%) estão presentes no coração de ratos; todavia o miocárdio de um rato adulto apresenta, principalmente, alfa-actina sarcomérica cardíaca (95%). Todas estas mudanças no comportamento das proteínas têm um enorme efeito nas propriedades contráteis do coração após o nascimento. Para Borisov (1991), a alfa-actina sarcomérica é uma das primeiras proteínas detectadas como precursoras na estrutura das miofibrilas. Os movimentos da alfa-actina sarcomérica alongam o eixo de miofibrilas que são a base da formação da linha Z.
De acordo com Lemler et al (2000), o miocárdio neonatal responde ao estresse diferentemente do miocárdio adulto, o que pode ser observado quando se verifica que o ventrículo esquerdo do neomorto tem pequena reserva e, dessa maneira, não consegue manter a contratilidade em resposta à rápida sobrecarga de pressão. Além do mais, no neomorto, os cardiomiócitos são menores, com contração mais lenta, com pequena magnitude e as miofibrilas são menos densas
O coração é o primeiro órgão a funcionar na fase embrionária e qualquer distúrbio de sua função leva à morte precoce. Todavia, o crescimento cardíaco é considerado completo quando desenvolve sua função de bomba sanguínea. Antes do nascimento, o aumento da massa é fruto da divisão dos cardiomiócitos (hiperplasia), enquanto depois do nascimento o crescimento se dará por um aumento do volume das células cardíacas (hipertrofia). É difícil imaginar como os cardiomiócitos podem lidar com processos altamente dinâmicos, que são a divisão celular e a contração das miofibrilas. Através das pesquisas que avancem na compreensão sobre a regulação do ciclo celular e contração dos cardiomiócitos pode-se dar uma importante contribuição aos estudos que visam como enfoque a capacidade do crescimento regenerativo do miocárdio.
3 METODOLOGIA
Para a elaboração deste trabalho foram utilizadas necropsias de natimortos e neomortos a termo com idade gestacional entre 38 e 42 semanas, fornecidas pelo Banco de Necropsias Pediátricas e Perinatais (BNPP) da Unidade de Patologia Pediátrica e Perinatal do Serviço de Anatomia Patológica do Hospital de Clínicas da Universidade Federal do Paraná (UFPR). Vale ressaltar, que para o desenvolvimento da pesquisa foi necessário a autorização da Chefia do Serviço de Anatomia Patológica (Anexo A), bem como a aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa em Seres Humanos do Hospital de Clínicas da UFPR (Anexo B) e do Comitê de Ética em Pesquisa da Pontifícia Universidade Católica do Paraná (Anexo C).
A partir destes casos foram selecionadas, de acordo com os critérios de inclusão e exclusão, amostras de coração para a elaboração de um novo banco de dados, denominado Banco de Tecidos Cardiopediátricos (BTCP). O BTCP disponibilizou, através de planilha Excel, as seguintes variáveis referentes a todos os casos do estudo: sexo, idade gestacional, tempo de vida, causa da morte e doença básica. Estes dados foram extraídos dos laudos de necropsia do BNPP.
Os critérios de inclusão e exclusão visaram à obtenção de uma amostra onde o sofrimento fetal crônico antes do nascimento ou da morte intra-uterina fosse mínimo. Isto é necessário para se evitar casos de natimortos ou neomortos cujo crescimento do coração esteja alterado pelo retardo de crescimento intra-uterino do feto, devido ao sofrimento crônico e suas mais variadas causas, as quais foram excluídas deste estudo. Para isso, os critérios de causa morte foram divididos de acordo com os seguintes grupos: aqueles relacionados à mãe e/ou parto, aqueles relacionados ao neomorto ou natimorto e aqueles relacionados à placenta, de acordo conforme o quadro 1.
Critérios de inclusão (Sofrimento Fetal Agudo)
Critérios de exclusão (Sofrimento Fetal Crônico)
Mãe/Parto
Parto prematuro
Rotura prematura de membrana Trauma/acidentes
Distócias de progressão Distócias de apresentação Circular de cordão
Prolapso de cordão
Hipertensão arterial sistêmica Diabetes melitus da gestante
Infecção por toxoplasmose, rubéola, sífilis, citomegalovírus e Herpes
Corioamnionite Neoplasias
Doença hipertensiva especifica da gestação
Natimorto/ Neomorto
a termo
Hipóxia perinatal e Intra-uterina Alterações relacionadas a tempo de internação ou hipóxia
Malformações e síndromes (trissomia entre outras)
Macerados grau II e III
Infecção por toxoplasmose, rubéola, sífilis, Citomegalovírus, Herpes entre outras Eritroblastose fetal
Crescimento intra-uterino retardado Oligodrâmnio e Polidrâmnio Placenta
Descolamento prévio da placenta Anomalias de inserção do cordão Anomalias de inserção da membrana Placenta acreta, increta ou percreta
Aceleração da maturação da placenta Infartos placentários
Dismaturidade Quadro 1 – Critérios de inclusão e exclusão da amostra em estudo
Os casos foram classificados nos seguintes grupos: neomortos a termo com no máximo 2 dias de vida, neomortos a termo entre 3 até 10 dias de vida e natimortos a termo.
O banco de tecidos cardiopediátricos contava com os seguintes números: natimortos 142 casos, neomortos até 2 dias de vida com 56 casos e neomortos entre 3 e 10 dias de vida com 50 casos. Foram selecionados a partir deste banco 20 casos para o grupo natimorto, 11 casos para neomortos até 2 dias e 14 casos para neomortos com mais de dois dias, conforme tabela 1. As amostras selecionadas seguiram o seguinte critério: amostras recentes entre 1985 e 2005 e em bom estado de conservação a fim de garantir boa qualidade nas reações imunoistoquímicas.
Tabela 1 – Número de casos selecionados por grupos das amostras
GRUPOS DA AMOSTRAS NÚMERO DE CASOS
NATIMORTO 20
NEOMORTOS ATÉ 2 DIAS 11
NEOMORTOS ENTRE 3 E 10 DIAS 14
TOTAL 45
Depois de selecionados todos os casos, foi iniciada a preparação dos blocos das amostras com o Tissue Microarray Artesanal (TMA). Esta consiste na montagem de blocos de parafinacom múltiplas amostras, para confecção de lâminas histológicas a fim de realizar técnicas imunoistoquímicas em vários tecidos de uma só vez, barateando o custo do material gasto, conforme figura 11.
Figura 11 – Esquema de confecção das lâminas Fonte: Pesquisador
Este método se iniciou a partir da separação de múltiplas amostras e a junção de todos em um bloco comum utilizando-se uma máquina artesanal.A técnica completa, desde o início até a realização dos cortes histológicos, seguiu os seguintes passos.
O TMA consistiu na seleção de áreas doadoras através da observação de lâminas em hematoxilina-eosina provenientes dos blocos-doadores de cada um dos casos dos 3 grupos. As lâminas confeccionadas foram dirigidas ao patologista, para observação e localização de regiões representativas de tecido miocárdico bem preservado, sendo que estas áreas (3 para cada caso) foram marcadas com caneta de retroprojeção. Através do sistema de espelho, a lâmina marcada foi utilizada para localização da região de interesse nos blocos-doadores. Para que as amostras de TMA fossem posteriormente localizadas no bloco-receptor, conforme sua identificação inicial, foi confeccionado um mapa que serviu de apoio, do tipo plano cartesiano, onde as colunas foram identificadas com as letras A, B e C (uma para cada amostra, sendo 3 amostras por caso), e as linhas com números que variou entre 4-6, representando os casos do grupo.
Uma vez montado o mapa, os blocos-doadores foram organizados na bancada anexa aquela da confecção do bloco-receptor, conforme o mapa, da forma que foram utilizados em seqüência, para montagem do bloco-receptor final. Este processo de
Blocos doadores
Bloco receptor Lâmina
histológica
