O presente estudo apresentou os efeitos de Carv sobre parâmetros comportamentais e neuroquímicos em animais submetidos ao modelo de ECI. Além disso, foi possível comprovar a eficácia desse modelo na indução de comportamento depressivo-símile, com o propósito de que seja possível obter dados científicos que possibilitem o desenvolvimento de novos tratamentos para a depressão.
O modelo do ECI foi utilizado no presente trabalho com base no reconhecimento de que depressão e estresse são fenômenos inter-relacionados, sendo o estresse descrito por vários autores como o principal fator ambiental responsável por precipitar transtornos depressivos (GONDA et al., 2018; HAMMEN, 2018; WILLNER; SCHEEL-KRÜGER; BELZUNG, 2013).
Inicialmente, foi avaliado os efeitos do modelo de ECI e da administração repetida de Carv e FLU sobre a atividade locomotora dos animais, por meio do teste do Campo Aberto (CA), com o objetivo de verificar a influência dessas substâncias sobre o nível de excitabilidade do SNC. O aumento da atividade locomotora espontânea (ALE) pode estar associado a um efeito psicoestimulante, enquanto a diminuição de tal parâmetro pode estar relacionada à sedação (BEZERRA et al., 2019; CHATTERJEE et al., 1998; SESTAKOVA et al., 2013).
Essa avaliação foi feita por meio donúmero de crossing (atividade locomotora horizontal) e rearing (vertical),e pelo número de grooming, que representa a atividade de tocar o corpo ou a cabeça com as patas, com movimentos rápidos, em um comportamento característico de limpeza (BRANCHI; ALLEVA, 2006). A observação desses parâmetros demonstrou que tanto o modelo de ECI quanto as drogas utilizadas não alteram a atividade locomotora dos animais.
O comportamento de grooming pode aumentar quando o animal se apresenta tranquilo, ou também em casos de ansiedade. Por apresentar significados paradoxais, não pode ser utilizado isoladamente como indicativo de ansiedade, uma das principais comorbidades da depressão (LAUREANO, 2010). Nesse contexto, podemos afirmar que o movimento de autolimpeza, representado pelo parâmetro grooming, também não apresentou diferenças significativas entre os grupos, aliando-se aos parâmetros de crossing e rearing. Nossos resultados corroboram com os achados de Melo (2010), que utilizou apenas uma dose de Carv (50mg/g) e não observou alterações significativas desses parâmetros. Os resultados obtidos nos parâmetros de crossing, rearing e groming não podem ser considerados como
alterações importantes, pois excluem a possibilidade de que, nos testes em que se utiliza como parâmetro o tempo de imobilidade, como os citados a seguir, os animais estejam respondendo devido a uma ação sedativa ou estimulante das drogas.
A relação entre estresse e depressão é bem documentada em vários estudos pré- clínicos e indicam que os animais que passam por esse modelo de estresse crônico apresentam consequências comportamentais e bioquímicas semelhantes àquelas relatadas em pacientes deprimidos (AYUOB et al., 2017; CAPIBARIBE, 2018; DENG et al., 2015).
No presente trabalho, a eficácia do modelo de ECI foi evidenciada, visto que este produziu um comportamento do tipo depressivo, comprovado pelo teste de Nado Forçado (NF) após 28 dias. Este teste é amplamente utilizado para avaliar drogas com potencial efeito antidepressivo, pois, ao submeter o animal a um cenário com poucas chances de escape, este tende a manter-se o maior tempo imóvel após um tempo de agitação inicial (YRONDI et al., 2018).
Nosso estudo demonstrou uma atividade anti-depressiva-símile do Carv 50mg/kg, detectado pela redução do tempo de imobilidade no teste de NF. Em um recente trabalho que utilizou o modelo de ECI (24 dias) na indução do comportamento depressivo, o tratamento com óleo essencial de orégano (contém 6,83% de carvacrol) através de injeções de 0,2 mL/Kg por via intraperitoneal durante 14 dias, também foi capaz de diminuir o tempo de imobilidade no teste do NF (AMIRESMAEILI et al., 2018), corroborando nossos dados. De forma semelhante, outros estudos com terpenoides como o Timol (isômero do carvacrol), Geraniol, (-)-α-bisabolol e Bilobalide, também demonstraram resultados usando o teste de NF nesse mesmo modelo (DENG et al., 2015; JIANG et al., 2018; REBOUÇAS, 2019; WU et al., 2016).
Um dos sintomas mais frequentes na depressão é a anedonia, que diz respeito à perda de interesse ou sensações prazerosas e que, quando associado a outros sintomas, como culpa e ideação suicida, é útil para se chegar ao diagnóstico de transtorno depressivo (KANDRATAVICIUS et al., 2012). A anedonia está associada a um mau funcionamento do sistema de recompensa no cerébro, sendo um dos sintomas mais difíceis de ser tratado (DUNLOP BW; NEMEROFF CB, 2007). Um dos testes considerados úteis para a investigação de comportamento anedônico em modelos animais é o Teste de Preferência pela Solução de Sacarose, no qual a diminuição da capacidade de resposta a recompensas é evidenciada pela redução do consumo de uma solução açucarada (MAO et al., 2014).
Na nossa pesquisa os animais que passaram pelo ECI durante 28 dias sem receber tratamento, apresentaram diminuição na preferência pela solução de sacarose, e a
administração de Carv 50mg/kg reverteu o comportamento anedônico causado pelo ECI, mostrando que esse modelo de estresse é capaz de induzir a depressão, com características muito semelhantes às encontradas em humanos (HE et al., 2016; REBOUÇAS, 2019; SEQUEIRA-CORDERO et al., 2019).
A administração de Carv na dose de 50 mg/kg apresentou uma reversão do comportamento anedônico causado pelo ECI. Esse resultado sugere que Carv pode ser potencialmente útil no tratamento de quadros de depressão que apresentem comprometimento no comportamento prazeroso. Sabe-se que muitos neurotransmissores (serotonina, glutamato, acetilcolina, GABA), estão envolvidos com a anedonia, todavia o que mais se destaca é a dopamina, pois ela parece se relacionar, em especial, com a motivação na busca de recompensa. É importante destacar que, em um estudo anterior realizado por nosso grupo (Melo et al., 2014) o tratamento agudo com Carv na dose de 50 mg/kg mostrou um aumento na liberação de aminoácido GABA e de dopamina, o que poderia justificar o efeito anti- anedônico observado no presente trabalho.
Além disso, a FLU, utilizada como controle positivo, também apresentou efeito anti-anedônico. De forma similar, Hasebe et al. (2016), em um modelo animal diferente, demonstrou esse efeito anti-anedonia da FLU, acompanhado pela diminuição da função do receptor GABAa causada pela administração de picrotoxina. Cabe ressaltar que A FLU é utilizada como monoterapia no tratamento da Depressão Psicótica, visto que a mesma possui efeito anti-anedonia e efeito antipsicótico (FURUSE; HASHIMOTO, 2009, 2010); além de que esse fármaco possui, também, alta afinidade pelo receptor σ1 (sigma-1), ao qual desempenha um importante papel na fisiopatologia de diversas doenças psiquiátricas (ISHIKAWA et al., 2007; HASHIMOTO, 2009; KOURRICH et al., 2012; HASEBE et al., 2016).
Dessa forma, diante desse resultado obtido através do nosso estudo com o Carv, infere-se que o mesmo pode ser útil no tratamento de pacientes com depressão que apresentem comprometimento no comportamento prazeroso. E, justificando mais uma vez a relevância desses dados, cabe ressaltar, ainda, que as pesquisas realizadas em vários trabalhos demonstraram que nem todos os antidepressivos utilizados na clínica são capazes de reverter esse sintoma (CHAVES, 2019; LOPES et al., 2018; REBOUÇAS, 2019; VASCONCELOS, 2015).
Além dos sintomas já relatados, sabe-se que a depressão apresenta alta comorbidade com transtornos de ansiedade, e muitos autores já investigaram a atividade ansiolítica de antidepressivos (ADAMS et al., 2016; KAUFMAN; CHARNEY, 2000;
MANES et al., 2016). O teste de Interação Social foi desenvolvido há 40 anos como o primeiro teste animal para ansiedade (CAMPOS et al., 2013; FILE; HYDE, 1978). Este mede uma variedade de comportamentos exibidos por um sujeito (normalmente ratos e/ou camundongos) quando exposto a um animal estranho, o que permite a avaliação das respostas sociais do mesmo para com o estranho, sendo a resposta quantificada de forma diferente dependendo do grupo de pesquisa (NEILL et al., 2010). Deste modo, os níveis de interação social em roedores têm sido usados para avaliar efeitos farmacológicos, principalmente na ansiedade. Um aumento na interação social é indicativo de efeito ansiolítico, ao passo que uma diminuição nessa interação é comumente induzida por drogas ansiogênicas (CAMPOS et al., 2013; FILE; HYDE, 1978; FILE; SETH, 2003). Muitos autores relatam ainda que déficits em habilidades sociais podem estar associados a um quadro depressivo, sendo a ansiedade considerada como uma das comorbidades mais comuns na depressão (BOLSONI-SILVA; LOUREIRO, 2016; OLFSON et al., 2017). Um estudo agudo utilizando o Carv na dose de 50 mg/kg via oral mostrou um aumento nos níveis do neurotransmissor GABA, importante na ansiedade (MELO, 2014). Nesse contexto, nossos resultados mostraram que Carv foi capaz de aumentar o parâmetro de interação social, quando comparado com o grupo ECI, sugerindo que este pode melhorar este parâmetro de habilidade social deficiente observado em pacientes depressivos.
Além das alterações emocionais, diversos estudos relatam o aparecimento de disfunções cognitivas em pacientes depressivos, sendo estas muito mais duradouras, podendo permanecer mesmo nos perídos de remissão (MCINTYRE et al., 2013; MILLAN et al., 2012; MISKOWIAK et al., 2012).
O aprendizado e a memória são elementos comportamentais relacionados à plasticidade do SNC. É bem documentado na literatura a existência de déficit cognitivo em pacientes com depressão, tais como memória e a atenção (BAUNE; RENGER, 2014; PERINI et al., 2019; RICHARDSON; ADAMS, 2018; ZUCKERMAN et al., 2018), inclusive em situações de estresse crônico (BANGASSER; KAWASUMI, 2015). No entanto, há relativamente poucos estudos disponíveis comparando o desempenho cognitivo e os efeitos de diferentes classes de antidepressivos na melhora da cognição (MCINTYRE et al., 2013). Dentre estes, podem ser citados estudos com pacientes tratados com os moduladores de dopamina (bupropiona), inibidores da norepinefrina (reboxetina) e o multimodal (vortioxetina) (MCINTYRE; LOPHAVEN; OLSEN, 2014; PERINI et al., 2019; VERBEECK et al., 2017).
roedores, foi proposto avaliar a memória por meio do teste de Reconhecimento de Objetos. Nesse teste, que se baseia na preferência do animal saudável por explorar ambientes e objetos ainda não vistos, os animais naturalmente despendem mais tempo explorando o objeto novo, após reconhecer um objeto familiar (ENNACEUR; DELACOUR, 1988). O córtex e hipocampo estão diretamente relacionados com o reconhecimento de objetos, e quando não estão íntegros, ocorre prejuízo no reconhecimento e formação da memória (ALBASSER et al., 2009).
No presente estudo, o grupo exposto ao ECI apresentou menor índice de reconhecimento do objeto novo, enquanto o grupo tratado com Carv apresentou um aumento significativo nesse índice, indicando uma melhora na cognição que havia sido prejudicada pelo estresse. Um recente estudo utilizando o modelo de estresse por lipopolissacarídeo (LPS) mostrou que a administração diária de Carv (25, 50 e 100 mg/Kg) por 21 dias melhorou o reconhecimento, a discriminação e a memória em relação aos grupos não tratados, confirmando dessa maneira nossos resultados. Esse efeito pode estar relacionado às atividades antioxidante e antiinflamatória, apresentadas pelo Carv em estudos anteriores (EZZ-ELDIN; ABOSEIF; KHALAF, 2020; SAMARGHANDIAN et al., 2016)
No presente trabalho também foi avaliada a memória operacional, através do uso do teste labirinto em Y. Este teste baseia-se na tendência de que usualmente os roedores visitam os três braços do aparato, um após o outro, pois têm a tendência de explorar ambientes novos (OADES et al., 1985). Nitidamente o modelo de ECI, neste trabalho, causou diminuição do desempenho cognitivo, como observado pela diminuição do número de alternações espontâneas, o que evidencia comprometimento cognitivo em decorrência da exposição crônica ao estresse e de forma interessante o Carv melhorou este parâmetro.
Resultados semelhantes ao prejuízo cognitivo causado pelo ECI também foram observados previamente por Rebouças et al (2019). Os efeitos do Carv sobre a memória também foram demonstrados anteriormente, usando-se o teste do labirinto em água. Camundongos machos C57BL/6 que foram expostos a etanol 35% por via intraperitoneal durante 4 semanas concomitantemente ao tratamento com Carv (25,50 e 100 mg/kg) durante 7 dias mostraram uma atenuação na disfunção cognitiva neste teste (CAI et al., 2013). Este efeito benéfico do Carv, revertendo o déficit cognitivo nos animais, pode estar relacionado às atividades antioxidante e antiinflamatória apresentadas pelo Carv em um modelo agudo demonstrado previamente (MELO, 2010, 2014).
A grande vulnerabilidade do cérebro ao dano oxidativo torna esse evento um dos mecanismos importantes na patogênese da depressão (BLACK et al., 2015; NG et al., 2008).
Nesse contexto, é importante destacar que estudos prévios relatam a relação existente entre o ECI, modelo utilizado no presente trabalho, e o aumento de parâmetros do estresse oxidativo, acarretando o desenvolvimento de sintomatologia depressiva. De fato, estudos anteriores mostram que fatores estressantes são capazes de aumentar os parâmetros de estresse oxidativo (LÓPEZ-LÓPEZ et al., 2016; LUCCA et al., 2009).
No presente estudo, o ECI elevou os níveis de MDA e nitrito/nitrato no córtex pré-frontal e hipocampo dos camundongos, demonstrando que agentes estressores, quando aplicados de forma crônica, estimulam o estresse oxidativo em áreas cerebrais, gerando EROs que estão potencialmente relacionadas à alteração no humor e no comportamento (BLACK et al., 2015). Assim sendo, a diminuição na função das áreas cerebrais em decorrência do dano oxidativo provocado pela exposição ao modelo de ECI, sobretudo no hipocampo, pode ser correlacionada ao comportamento tipo depressivo observado nos camundongos por meio dos parâmetros comportamentais (YU et al., 2020; ZHONG et al., 2019).
No nosso trabalho, Carv foi capaz de reduzir o dano oxidativo causado pelo ECI, como demonstrado pela diminuição dos níveis de nitrito/nitrato e MDA no córtex pré-frontal e hipocampo dos animais. Esse resultado é corroborado com outros estudos que mostram a capacidade do Carv de diminuir o dano oxidativo em um modelo de inflamação induzida por LPS (HAKIMI et al., 2019), e em um modelo de asma induzida por ovalbumina (EZZ- ELDIN; ABOSEIF; KHALAF, 2020). Tendo como base que a depressão é geralmente acompanhada de lesão neuronal em regiões do cérebro, juntamente com uma produção excessiva de espécies reativas que podem levar à senescência ou morte celular, a capacidade de Carv de diminuir parâmetros do estresse oxidativo mostra-se, portanto, como um possível mecanismo de sua atividade antidepressiva (MEDHAT et al., 2019; MELO, 2010, 2014).
Além de mensurar a formação de produtos citotóxicos decorrentes da formação de EROs, pode-se verificar a ocorrência de desequilíbrio oxidativo através da determinação da concentração de componentes antioxidantes. Dessa forma, foram determinados os níveis de GSH, a principal defesa antioxidante da célula, que é usada como substrato da enzima glutationa peroxidase na conversão do peróxido de hidrogênio, uma espécie reativa de oxigênio, em água (KULAK et al., 2013).
No presente estudo, o ECI promoveu a diminuição das defesas antioxidantes, como demonstrado pela redução dos níveis de GSH no hipocampo, corroborando com estudos anteriores (REBOUÇAS, 2019; YU et al., 2020). Esses níveis encontram-se diminuídos em decorrência da tentativa de eliminação das EROs geradas nas células neuronais. No presente estudo, Carv foi capaz de aumentar os níveis de GSH no hipocampo dos camundongos
(MEDHAT et al., 2019; MELO, 2010, 2014). Esse dado sugere que a atividade antidepressiva de Carv pode ser decorrente de estimulação da produção de fatores antioxidantes e diminuição da produção de fatores pró-oxidantes, indicando uma potencial atividade neuroprotetora (GUNES et al., 2017; KILIÇ et al., 2016; SAMARGHANDIAN et al., 2016).
A hipótese neuroinflamatória da depressão correlaciona os processos inflamatórios mediados por citocinas com o surgimento da sintomatologia tipo depressiva (MILLER; RAISON, 2016). Pacientes com depressão apresentam aumento da expressão de citocinas pró-infamatórias, como IL-1β, IL-6, TNFα e seus respectivos receptores, além do aumento de proteína C reativa (PCR), quimiocinas e moléculas de adesão solúveis no sangue e no líquido cefalorraquidiano, características principais de uma resposta inflamatória (ANTONIO et al., 2015; MILLER; MALETIC; RAISON, 2009; MILLER; RAISON, 2016).
Nossos resultados mostraram um aumento significativo de IL 1β e TNFα no hipocampo de camundongos do grupo ECI,em comparação ao grupo controle, corroborando com outros trabalhos em que esse modelo induz um aumento nos níveis de citocinas pró- inflamatórias (LIU et al., 2015; MOGRABI et al., 2020; ZHONG et al., 2019). Foi observado que a exposição repetida a diferentes tipos de estressores ambientais causou importantes alterações a nível hipocampal, visto que essa é uma área cerebral relacionada com a sintomatologia da depressão (KRAUS et al., 2019; LIU et al., 2017b).
No presente estudo, observou-se que o tratamento com Carv foi capaz de diminuir os níveis de IL-1β e TNFα no hipocampo de camundongos expostos ao modelo de ECI. Esse resultado corrobora alguns estudos que mostram o efeito modulatório de Carv sobre a expressão de citocinas pró-inflamatórias. Em um estudo em ratos, Carv mostrou um efeito antiinflamatório em um modelo crônico de encefalite autoimune (MAHMOODI et al., 2019). Em outro estudo realizado por Lee et al. (2020), usando um modelo de neuroinflamação induzida por LPS, a administração de Carv atenuou significativamente a expressão de citocinas pró-inflamatórias como IL-1β, TNFα e ciclooxigenase-2. No entanto, no nosso estudo os níveis de citocinas não foram alterados significativamente por FLU. Em um estudo de longa duração usando o estresse crônico moderado, Lu et al. (2017) descreveu que houve efeito da FLU sobre os níveis de citocinas apenas a partir de 90 dias de tratamento. Isso poderia justificar, pelo menos em parte, o fato da FLU não ter causado efeito sobre as citocinas, pois o tempo de tratamento pode ter sido curto.
O presente estudo mostrou que Carv possui atividade antidepressiva-símile, além de melhorar parâmetros que geralmente acompanham a depressão, como anedonia, déficit de habilidade social e memória de curto prazo, como observados em camundongos submetidos
ao modelo de ECI. Estes efeitos parecem estar relacionados aos seus efeitos antioxidantes e antiinflamatórios obtidos nos testes neuroquímicos. Um resumo dos principais efeitos do carvacrol são apresentados no Quadro 3.
Quadro 3: Resumo dos principais efeitos do Carvacrol 50mg/kg,em camundongos submetidos ao modelo de ECI
Testes comportamentais
e Neuroquímicos Parâmetros Efeitos
Teste do campo aberto Não alterou a atividade locomotora
Ausência de efeito sedativo ou estimulante Nado Forçado Diminuiu o tempo de
imobilidade Efeito antidepressivo-símile Preferência pela Solução
de Sacarose;
Aumentou a preferência pela
Solução de Sacarose Efeito anti-anedônico Interação Social Aumentou a % de interação
social Melhora na habilidade social Reconhecimento de
objetos e Labirinto em Y
Reverteu as alterações de déficit de memória
Melhora na memória de curto-prazo
Dosagem do Estresse Oxidativo
Aumentou a produção de fatores antioxidantes (GSH) e diminuiu a produção de fatores pró- oxidantes (nitrito/nitrato e MDA) no CPF e hipocampo, Atividade antioxidante Dosagem de citocinas
Diminuiu os níveis de citocinas pró-inflamatórias (IL-1β e
TNFα) no hipocampo
Efeito antiinflamatório