Efeito do carvacrol na reversão de alterações comportamentais e neuroquímicas induzidas pelo estresse crônico imprevisível

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ FACULDADE DE MEDICINA

DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA

JOSÉ TIAGO VALENTIM

EFEITO DO CARVACROL NA REVERSÃO DE ALTERAÇÕES

COMPORTAMENTAIS E NEUROQUÍMICAS INDUZIDAS PELO ESTRESSE CRÔNICO IMPREVISÍVEL

FORTALEZA 2020

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JOSÉ TIAGO VALENTIM

EFEITO DO CARVACROL NA REVERSÃO DE ALTERAÇÕES

COMPORTAMENTAIS E NEUROQUÍMICAS INDUZIDAS PELO ESTRESSE CRÔNICO IMPREVISÍVEL

FORTALEZA 2020

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JOSÉ TIAGO VALENTIM

EFEITO DO CARVACROL NA REVERSÃO DE ALTERAÇÕES COMPORTAMENTAIS E NEUROQUÍMICAS INDUZIDAS PELO ESTRESSE CRÔNICO IMPREVISÍVEL

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Farmacologia da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial à obtenção do título de mestre em Farmacologia. Área de concentração: Neurofarmacologia

Orientador: Profa. Dra. Francisca Cléa Florenço de Sousa

FORTALEZA 2020

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JOSÉ TIAGO VALENTIM

EFEITO DO CARVACROL NA REVERSÃO DE ALTERAÇÕES COMPORTAMENTAIS E NEUROQUÍMICAS INDUZIDAS PELO ESTRESSE CRÔNICO IMPREVISÍVEL

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Farmacologia da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial à obtenção do título de mestre em Farmacologia. Área de concentração: Neurofarmacologia.

Orientador: Profa. Dra. Francisca Cléa Florenço de Sousa

Aprovada em: ___/___/______.

BANCA EXAMINADORA

________________________________________ Profa. Dra. Francisca Cléa Florenço de Sousa

Universidade Federal do Ceará (UFC)

_________________________________________ Dr. Emiliano Ricardo Vasconcelos Rios

Centro Universitário Maurício de Nassau (UniNassau)

_________________________________________ Dra. Marta Maria de França Fonteles

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“Dedico esse trabalho a Deus e minha família por todo incentivo e ajuda para que isso fosse possível.”

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AGRADECIMENTOS

Primeiramente a Deus pela sua infinita bondade, não somente nestes anos como universitário e pós-graduando, mas em todos os momentos, minha eterna gratidão por permitir que tudo isso acontecesse.

À minha família, a base de tudo. Meu pai e minha mãe, que apesar de todas as dificuldades, que não eram poucas, fizeram de tudo por mim e meus irmãos (Danilo, Diuvânio e Tatiana). Minha tia Eliene, que considero uma segunda mãe, fundamental para que eu pudesse concluir mais essa etapa da minha vida.

A minha amada namorada Layla, que esteve comigo em todos os momentos, acreditando em mim, me apoiando, me ajudando em tudo que era possível. Sou grato a Deus por tê-la colocado em minha vida.

À minha amiga e parceira Iardja, que sempre me socorreu em todos os momentos, sempre que precisei ela estava lá, me respondendo no celular, marcando reuniões de última hora, meu muito obrigado.

Aos meus amigos – Daniel e João Victor -, pela amizade, pelo apoio, pela presença, não só em dias felizes, mas em tempos de crise também. Amigos, companheiros e irmãos durante essa trajetória, os quais fizeram parte da minha formação e continuarão sempre fazendo parte dela.

À professora, orientadora e mãe científica Cléa, por, de forma tão amável, me receber e me orientar. Obrigada por todas as palavras de apoio, por todos os elogios e por todo o encorajamento concedidos a mim. Tenho você como exemplo de professora e orientadora.

A todos do Laboratório de Neurofarmacologia. Vocês são a imagem perfeita do que é trabalho em equipe. Meu agradecimento à Manoela, Larice, Dulce, Victor, Natália, Auriana, Andressa, Dilailson, Bárbara, Rafael, Isabelle e João Pedro que me acompanharam de perto e não mediram esforços para me ajudar. Sem vocês eu não teria conseguido!

Às Pós-Docs e amigas, Alyne e Raquell por terem me ajudado no que eu precisava. Tenham certeza que todas as minhas atitudes como profissional serão marcadas pelo que aprendi e vi de vocês.

Aos Professores Emiliano Rios e Marta Fonteles, por aceitarem o convite para participar da banca e estarem dispostos a contribuir.

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Aos animais de laboratório, sem os quais não seria possível o desenvolvimento deste trabalho, deixo meu reconhecimento pelo papel essencial que desempenham no avanço da pesquisa científica.

À CAPES e ao CNPq pelo apoio financeiro.

Enfim, agradeço a todos que contribuíram de alguma forma para que este trabalho fosse realizado. Sobretudo, agradeço por terem dedicado um pouco do que temos de mais precioso: o tempo!

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“Tudo que está no plano da realidade já foi sonho um dia.” (Leonardo da Vinci)

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RESUMO

A depressão é um transtorno de humor incapacitante e recorrente na prática clínica. Sua etiologia é considerada multifatorial, pois envolve fatores genéticos e ambientais, dentre os quais, o estresse é um dos mais estudados. Embora diversas classes de antidepressivos estejam disponíveis, a resistência ao tratamento ainda alcança altos índices. Nesse contexto, compostos oriundos de plantas oferecem um grande potencial para o desenvolvimento de novos fármacos, muitas vezes, mais seguros e inovadores. O Carvacrol (Carv) é um monoterpeno encontrado nos óleos essenciais de diversas plantas aromáticas, tais como o orégano e tomilho, que apresentou atividade antidepressiva e ansiolítica em modelos comportamentais de estresse agudo. O presente estudo teve como objetivo investigar a atividade de Carv em um modelo animal de Estresse Crônico Imprevisível (ECI). Para tanto, camundongos Swiss machos, 20-24g, foram submetidos a um protocolo experimental de 28 dias, no qual os animais (n=6-8/grupo), exceto o grupo controle, foram submetidos a estressores ambientais, de forma aleatória. A partir do 15º dia, os grupos experimentais receberam, por via oral: veículo (salina + Tween 80® a 2%), Carv (50 mg/kg) ou Fluoxetina (10 mg/kg), como antidepressivo padrão. Os camundongos foram expostos aos seguintes testes comportamentais: Nado Forçado (NF), Campo Aberto (CA), Preferência pela Solução de Sacarose (PS), Reconhecimento de Objetos (RO), Interação Social (IS) e Labirinto em Y (LY). Após a avaliação comportamental, os animais foram eutanasiados e as áreas cerebrais (cortex pré-frontal e hipocampo) foram dissecadas para a avaliação neuroquímica: parâmetros de estresse oxidativo (MDA, nitrito e GSH) e dosagem de citocinas (IL-1β e TNFα). Os animais submetidos ao modelo de ECI desenvolveram comportamento tipo depressivo e déficit cognitivo. Carv apresentou atividade antidepressiva com diminuição do tempo de imobilidade no teste de NF, anti-anedônica no teste de PS e melhora na preferência social no teste de IS, sendo desprovida de efeito sobre a atividade locomotora, como demonstrado no CA. Além disso, Carv reverteu o déficit cognitivo causado pelo ECI no LY e RO. Carv também foi capaz de reverter o dano oxidativo, diminuindo os níveis de nitrito e MDA nas duas áreas cerebrais avaliadas, além de reverter a diminuição de GSH causada pelo ECI. Os níveis das citocinas inflamatórias avaliadas (IL-1β e TNFα) foram reduzidas pela administração de Carv, enquanto o modelo do ECI aumentou. Esses resultados reforçam a hipótese de que o Carv possui atividade antidepressiva símile, que pode está relacionada a efeitos antioxidantes e antiinflamatórios e portanto, pode ser uma alternativa farmacológica para o tratamento de distúrbios do humor.

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ABSTRACT

EFFECT OF CARVACROL ON THE REVERSION OF BEHAVIORAL AND NEUROCHEMICAL CHANGES INDUCED BY UNCEDITABLE CHRONIC STRESS

Depression is a disabling and recurrent mood disorder in clinical practice. Its etiology is considered multifactorial, as it involves genetic and environmental factors, among which, stress is one of the most studied. Although several classes of antidepressants are available, resistance to treatment still reaches high rates. In this context, compounds from plants offer great potential for the development of new drugs, often safer and more innovative. Carvacrol (Carv) is a monoterpene found in the essential oils of several aromatic plants, such as oregano and thyme, which showed antidepressant and anxiolytic activity in acute stress behavioral models. The present study aimed to investigate the activity of Carv in an animal model of Chronic Unpredictable Stress (CUS). For this, male Swiss mice, 20-24g, were submitted to a 28-day experimental protocol, in which the animals (n = 6-8/group), except the control group, were submitted to environmental stressors, at random. From the 15th day, the experimental groups received, orally: vehicle (saline + 2% Tween 80®), Carv (50 mg/kg) or Fluoxetine (10 mg/kg), as a standard antidepressant. The mice were exposed to the following behavioral tests: Forced Swimming (FS), Open Field (OF), Sucrose Preference (SP), Object Recognition (OR), Social Interaction (SI) and Y Maze (YM). After the behavioral evaluation, the animals were euthanized and the brain areas (prefrontal cortex, striatum and hippocampus) were dissected for the neurochemical evaluation: oxidative stress parameters (MDA, nitrite and GSH) and cytokine dosage (IL-1β and TNFα). Animals submitted to the ECI model developed depressive behavior and cognitive deficit. Carv showed antidepressant activity with decreased immobility time in the FS test, anti-anhedonic in the SP test, and improved social preference in the SI test, being devoid of any effect on locomotor activity, as shown in the OF. In addition, Carv reversed the cognitive deficit caused by ECI in YM and OR. Carv was also able to reverse oxidative damage, decreasing the levels of nitrite and MDA in the three brain areas evaluated, in addition to reversing the decrease in GSH. The ECI model increased the levels of the inflammatory cytokines evaluated (IL-1β and TNFα), which were reduced by the administration of Carv. These results reinforce the hypothesis that Carv presents an antidepressant activity-like related to antioxidant and antiinflamatory effects and may be a pharmacological alternative for the treatment of mood disorders.

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Ativação do Eixo Hipotálamo-Hipófise-Adrenal e sua regulação. ... 19

Figura 2: Estrutura química do monoterpenoCarvacrol . ... 27

Figura 3: Fluxograma do protocolo experimental ... 34

Figura 4: Teste do Campo Aberto ... 35

Figura 5:Teste do Nado Forçado ... 36

Figura 6:Teste de Preferência pela Solução de Sacarose ... 37

Figura 7: Teste de Interação Social ... 38

Figura 8: Teste de Reconhecimento de Objetos ... 39

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LISTA DE GRÁFICOS

Gráfico 1: Efeito da administração de Carv no teste de Nado Forçado. ... 44

Gráfico 2: Efeito da administração de Carv no teste da Preferência pela Solução de Sacarose... ... 45

Gráfico 3: Efeito da administração de Carv no teste de Interação Social ... 46

Gráfico 4: Efeito da administração de Carv no teste Reconhecimento de Objetos ... 47

Gráfico 5: Efeito da administração de Carv no teste do Labirinto em Y ... 48

Gráfico 6: Efeito da administração de Carv sobre os níveis de nitrito no córtex pré-frontal e hipocampo de camundongos ... 49

Gráfico 7:Efeito da administração de Carvsobre os níveis de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico-Tbars no córtex pré-frontal e hipocampo de camundongos ... 50

Gráfico 8: Efeito da administração de Carv sobre a concentração de GSH no córtex pré-frontal e hipocampo de camundongos ... 51

Gráfico 9: Efeito da administração de Carv sobre a dosagem de IL1-β no Hipocampo de camundongos ... 52

Gráfico 10: Efeitos da administração de Carv sobre a dosagem de TNFα no hipocampo de camundongos ... 53

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LISTA DE QUADROS

Quadro 1  Estímulos estressores para indução do comportamento depressivo por estresse crônico imprevisível (He et al., 2016) com adaptações... 32 Quadro 2  Divisão dos grupos experimentais... 33 Quadro 3  Resumo dos principais efeitos do Carvacrol 50mg/kg,em camundongos

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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ACTH ALE

Hormônio adrecorticotrófico Atividade locomotora espontânea BDNF Brain-derived neurotrophic fator CAT Catalase

CRH Carv

Hormônio liberador de corticotrofina Carvacrol

ECI Estresse Crônico Imprevisível eNOS Óxido nítrico sintase endotelial EPM Erro Padrão da Média

ERN Espécies Reativas de Nitrogênio EROs Espécies Reativas de Oxigênio FLU Fluoxetina GC Glicocorticoides GR Receptores Glicocorticóides GSH Glutationa reduzida GSH-Px Glutationa peroxidase GSSG H2O2 Glutationa oxidada Peróxido de hidrogênio HHA Hipotálamo-Hipófise-Adrenal IL-1β Interleucina 1β IL-6 INFα ISRS LTP Interleucina 6 Interferon α

Inibidores Seletivos da Receptação de Serotonina Potenciação de longa duração

iNOS Óxido nítrico sintase induzível MDA NaNO2 Malonildialdeído Nitrito de Sódio nNOS NF PCR

Óxido nítrico sintase neuronal Teste do Nado Forçado Proteína C Reativa NO Óxido Nítrico

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NOS NO2 OH -ONOO -O

2-Óxido nítrico sintase Dióxido de nitrogênio Hidróxido

Peroxinitrito Óxido

RM Receptor de mineralocorticóde SNC Sistema Nervoso Central SOD

TBARS

Superóxido dismutase

Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico TCA Teste do Campo Aberto

TDM Transtorno de Depressão Maior Trk

TNFα

Receptor cinase relacionado a tropomiosina Fator de Necrose Tumoral α

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SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO... ...17

1.1 Depressão: aspectos gerais ... 17

1.2 Fisiopatologia da depressão ... 18

1.2.1Hipótese do estresse e relação Glicocorticoides – Estresse – Depressão...18

1.2.2Estresses oxidativo e depressão...20

1.2.3Hipótese Neuroinflamatória...22

1.2.4Dano neuronal e déficit de memória na depressão...23

1.3 Modelos animais no estudo da depressão – Estresse Crônico Imprevisí- vel (ECI) ... 24

1.4 Abordagem terapêutica da depressão ... 25

1.5 Carvacrol (Carv) ... 26 2. RELEVÂNCIA E JUSTIFICATIVA ... 29 3. OBJETIVO ... 30 3.1 Geral ... 30 3.2 Específicos ... 30 4. MATERIAIS E MÉTODOS ... 31 4.1 Animais... 31 4.2 Princípios Éticos... 31 4.3 Drogas ... 31

4.4 Indução de depressão por estresse crônico imprevisível ... 31

4.5 Desenho experimental ... 33

4.6 Avaliação Comportamental ... 35

4.6.1Teste do Campo Aberto...35

4.6.2Teste do Nado Forçado...35

4.6.3Teste da preferência pela solução de sacarose...36

4.6.4Teste de Interação social...37

4.6.5Teste de Reconhecimento de Objetos...38

4.6.6Teste do Labirinto em Y...39

4.7 Testes Neuroquímicos...40

4.7.1Dissecação das áreas cerebrais...40

4.7.2Determinação de parâmetros de estresse oxidativo...40

4.7.3Mensuração das concentrações de IL-1β e TNFα...42

4.8 Análise Estatística...42

5. RESULTADOS...43

5.1 Avaliação Comportamental...43

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exploratória de camundongos no teste do Campo Aberto...43

5.1.2 Efeito da administração de Carv (50 mg/kg) sobre o tempo de imobilidade de camundongos no teste do Nado Forçado...43

5.1.3 Efeito da administração de Carv (50 mg/kg) sobre o comportamento do tipo anedônico de camundongos no teste de Preferência pela Solução de Sacarose...44

5.1.4 Efeito da administração de Carv (50mg/kg) sobre a preferência social de camundongos no teste de Interação Social...45

5.1.5 Efeito da administração de Carv (50mg/kg) sobre a memória de camundongos no teste de Reconhecimento de Objetos...46

5.1.6 Efeito da administração de Carv (50mg/kg) sobre a memória de camundongos no teste do Labirinto em Y...47

5.2Avaliação Neuroquímica...48

5.2.1Determinação de parâmetros de estresse oxidativo...48

5.2.2Determinação dos parâmetros inflamatórios...51

6. DISCUSSÃO...54

7. CONCLUSÃO...62

8. CONSIDERAÇÕES FINAIS ... 63

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1. INTRODUÇÃO

1.1 Depressão: aspectos gerais

A depressão é um transtorno de humor comum e recorrente na prática clínica (OPAS, 2018). O Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders (DSM-5) descreve nove sintomas da depressão: 1) humor deprimido, 2) prazer ou interesse diminuídos, 3) perda de apetite e/ou peso, 4) agitação ou retardo psicomotor, 5) distúrbios do sono, 6) sentimento de culpa, 7) fadiga e perda de energia, 8) dificuldade de pensamento e concentração, 9) pensamentos recorrentes de morte e ideação suicida. Para que seja estabelecido o diagnóstico, o indivíduo deve apresentar cinco ou mais sintomas, dentre os quais devem estar o primeiro e/ou o segundo, e estes devem permanecer por pelo menos duas semanas (APA, 2017; PEREZ-CABALLERO et al., 2019).

A depressão deve ser diferenciada de respostas emocionais normais a desafios da vida diária, já que, em casos mais graves, pode levar a problemas sérios, como o suicídio. Segundo a Organização Mundial de Saúde, mais de 800.000 pessoas morrem a cada ano por suicídio, e esta é a segunda causa de morte de pessoas entre 15 e 29 anos (LIM et al., 2018).

A depressão apresenta-se cerca de duas a três vezes mais frequente em indivíduos do sexo feminino. Estudos mostram que cerca de um terço das mulheres terá um episódio de depressão ao longo de sua vida. Além disso, esse é considerado um fator de risco para depressão resistente ao tratamento (APA, 2017; FERRARI et al., 2013; KESSLER et al., 2003).

Além das alterações emocionais, estudos relatam que pacientes depressivos podem apresentar disfunções cognitivas, que podem permanecer mesmo nos perídos de remissão (MCINTYRE et al., 2013; MILLAN et al., 2012; MISKOWIAK et al., 2012). A exposição ao estresse de forma crônica está relacionada a danos no aprendizado e memória encontrados na depressão (COLCIAGO et al., 2015; XU et al., 2017).

Embora ainda não se saiba claramente quais são os mecanismos envolvidos, a depressão tem sido considerada um importante fator de risco para o desenvolvimento de diversas doenças graves. Indivíduos depressivos apresentam risco aumentado de desenvolver cardiopatias – cerca de 1,5 vezes (KOOY et al., 2007; SAVOY; VAN LIESHOUT; STEINER, 2017), diabetes mellitus - 1,26 a 1,37 vezes (KNOL et al., 2006), doença de Alzheimer – 2,03 vezes (OWNBY et al., 2006) e epilepsia – 3 a 7 vezes (HESDORFFER et al., 2006), quando comparados a indivíduos não depressivos, o que reforça a necessidade de uma melhor

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compreensão da fisiopatologia da depressão.

1.2 Fisiopatologia da depressão

Diversas hipóteses têm sido propostas para explicar os mecanismos envolvidos na patogênese da depressão. Estudos propõem que sua etiologia seja resultado de anormalidades em fatores genéticos e ambientais (CHEN et al., 2019; KRISHNAN; NESTLER, 2008), sendo o estresse o principal fator ambiental descrito (WILLNER; SCHEEL-KRÜGER; BELZUNG, 2013).

De fato, a maior parte dos episódios diagnosticados como depressão é precedida por um evento estressante de natureza diversa. Um estudo longitudinal, realizado na Virgínia com 4.856 indivíduos (53% do sexo feminino) que apresentaram sintomas depressivos um ano antes do início do estudo e foram avaliados em um período máximo de 12 anos, mostrou que 88,1% dos casos diagnosticados foram relacionados a um estressor, enquanto apenas 11,9% tinham origem endógena (KELLER; NEALE; KENDLER, 2007; TERLUIN; OUD, 2012).

Segundo a teoria monoaminérgica, os níveis de serotonina e noradrenalina e, em menor extensão, dopamina, estão, direta ou indiretamente, relacionadas à depressão (SAPOLSKY, 2004). Considerando que os níveis monoaminérgicos são regulados de forma homeostática (BEST; NIJHOUT; REED, 2010), o estresse altera, de forma ainda não totalmente esclarecida, os níveis dessas monoaminas (ANDREWS et al., 2011).

Essa teoria, no entanto, não explica completamente as alterações encontradas na depressão, sendo, portanto, necessárias hipóteses adicionais que expliquem com mais clareza a fisiopatologia dessa doença. As hipóteses atuais relacionam as neurotrofinas, o eixo hipotálamo-hipófise-adrenal, o estresse oxidativo e a neuroinflamação à depressão (KRISHNAN; NESTLER, 2008).

1.2.1 Hipótese do estresse e relação Glicocorticoides – Estresse – Depressão

Diversos estudos sugerem que a exposição ao estresse é um fator relacionado ao desenvolvimento da depressão (HENRY et al., 2019; JASER et al., 2005; RUMBURG et al., 2017), já que quase 90% dos pacientes vivenciam eventos estressantes antes do início dos sintomas depressivos (KELLER; NEALE; KENDLER, 2007).

Fisiologicamente, a exposição a um fator estressante agudo ativa o eixo hipotalâmico-hipofisário-adrenal (HHA), resultando em uma cascata de eventos

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endócrinos. Essa cascata inclui a liberação e transporte do hormônio de liberação da corticotropina (CRH) de neurônios do núcleo paraventricular do hipotálamo para a hipófise anterior, onde estimulam a liberação do hormônio adrenocorticotrópico (ACTH) para a circulação sistêmica. O ACTH estimula a produção e liberação de glicocorticóides (cortisol em humanos e corticosterona em roedores) do córtex da adrenal para a circulação sistêmica. Depois de liberados, os glicocorticóides agem nos tecidos periféricos, ligando-se e ativando receptores de glicorticóides (GR) e receptor de mineralocorticó ide (RM) no cérebro, iniciando mudanças metabólicas e neuromodulatórias necessárias para lidar com o fator estressante. No cérebro, os níveis de GR são particularmente altos no hipocampo, amígdala e córtex pré-frontal, enquanto os RM são expressos principalmente em áreas límbicas, com altos níveis no hipocampo e níveis moderados na amígdala e no córtex pré-frontal. Quando o objetivo é alcançado, o feedback negativo mediado pelo nível elevado de cortisol é fundamental para o término da resposta do eixo HHA ao estresse (BAO; SWAAB, 2019; IOB; KIRSCHBAUM; STEPTOE, 2019; WILLNER; SCHEEL-KRÜGER; BELZUNG, 2013).

Figura 1: Ativação do Eixo Hipotálamo-Hipófise-Adrenal e sua regulação.

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Os receptores de glicocorticoides estão intimamente envolvidos no processo de retroalimentação negativa do eixo HHA. Quando estes receptores estão disponíveis em nível alto, a inibição por retroalimentação do núcleo paraventricular é aumentada e a atividade no eixo HHA é fortemente controlada. Contudo, quando estes receptores estão em nível baixo, ou hipofuncionantes, a inibição por retroalimentação é ineficiente e o estímulo que provoca a resposta no eixo HHA permite um aumento, maior que o normal, nos níveis de cortisol, característica essa encontrada em pacientes com depressão (GJERSTAD; LIGHTMAN; SPIGA, 2018; GONCHAROVA et al., 2019). A ativação prolongada do eixo HHA, pode representar um sério risco à saúde, podendo levar à imunossupressão, inibição do crescimento, distúrbios do sono, impedimento da memória, diminuição do comportamento sexual, falta de apetite e disforia crônica (IOB; KIRSCHBAUM; STEPTOE, 2019).

Estudo recente também mostra que o estresse crônico é acompanhado por resistência aos GC e ativação dos mecanismos pró-inflamatórios. A hiperatividade do eixo ocorre pela interação imunoendócrina, ou seja, as citocinas pró-inflamatórias também aumentam a secreção de ACTH por ação direta ou mediante aumento do efeito do CRH (IOB; KIRSCHBAUM; STEPTOE, 2019; MAYDYCH, 2019).

A correlação entre citocinas, estresse e depressão ainda não é totalmente conhecida, no entanto, sabe-se que se configura como uma via de mão dupla. Em suma, hiperatividade do eixo HHA e inflamação podem ser parte de um mesmo processo patológico: hiperatividade do eixo é um marcador de resistência a GC, implicando em ação ineficiente desses hormônios em tecidos-alvo, o que pode levar a ativação imune; igualmente, inflamação pode estimular a atividade do eixo por duas vias: uma ação diret a das citocinas no cérebro ou a produção de resistência a GC (IOB; KIRSCHBAUM; STEPTOE, 2019; MAYDYCH, 2019).

1.2.2 Estresse oxidativo e depressão

A oxidação é parte fundamental da via aeróbica e do nosso metabolismo. Normalmente, os radicais livres, que também são denominados espécies reativas de oxigênio (EROs) e espécies reativas de nitrogênio (ERNs) são produzidos diariamente pelo nosso organismo, podendo interagir com diversos substratos, desempenhando funções como sinalização celular, respostas imunológicas e mitose. Logo em seguida, são eliminadas pelos sistemas de defesa celular, mantendo-se, assim, presentes transitoriamente e em baixos níveis

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sem causar danos às células. Quando a sua produção aumenta ou quando os sistemas de defesa são ineficientes para a remoção, o resultado é um excesso de radicais livres, que leva a uma condição denominada de estresse oxidativo. Estudos recentes evidenciam que o estresse oxidativo pode estar ocasionando o aumento no número de doenças neuropsiquiátricas, como a depressão (BLACK et al., 2015; GHASEMI, 2019).

O Sistema Nervoso Central (SNC) é especialmente sensível a eventos geradores de estresse oxidativo em razão das suas características fisiológicas e anatômicas. Essa susceptibilidade do cérebro ao estresse oxidativo decorre do alto teor de ácidos graxos insaturados, alto consumo de oxigênio e escassez dos sistemas de defesa antioxidantes (COBLEY; FIORELLO; BAILEY, 2018).

O óxido nítrico (NO) é uma das principais ERNs e seus níveis podem ser mensurados indiretamente pela determinação de nitrito/nitrato, uma vez que o NO passa por várias reações em fluidos biológicos resultando na formação de nitritos e nitratos. Este radical é produzido a partir da L-arginina, por uma reação mediada por 3 isoformas: NO-sintase neuronal (nNOS), endotelial (eNOS) e induzível (iNOS). Estudos sugerem que a isoforma iNOS, desempenha papel crucial nos processos inflamatórios e que a inibição de iNOS pode resultar em um efeito antidepressivo (GHASEMI, 2019; TALAROWSKA et al., 2014; VAVÁKOVÁ et al., 2015).

Em determinadas condições, o NO pode exercer efeitos nocivos, interagindo com Óxido (O2-), resultando na formação de peroxinitrito (ONOO-), Hidróxido (OH-) e/ou dióxido de nitrogênio (NO2), produtos altamente tóxicos. Estes compostos são capazes de reagir com diversas moléculas, danificando-as (GHASEMI, 2019).

O malonildialdeído (MDA), um produto da peroxidação lipídica, é também usado como marcador biológico indicativo de estresse oxidativo e dano celular. A membrana celular é um dos componentes mais susceptíveis à ação das EROs, em virtude da peroxidação lipídica. Esse processo ocorre quando as EROs reagem com ácidos graxos presentes nas membranas celulares, o que resulta na degradação de suas estruturas. Estudos mostram que altos níveis de MDA estão associados a transtornos de ansiedade e depressão, podendo ser normalizados com a ação de antidepressivos (FINDIKL et al., 2018; MAZEREEUW et al., 2015).

Existem enzimas antioxidantes protetoras e mecanismos que neutralizam os radicais livres, como as enzimas Superóxido Dismutase (SOD), Catalase (CAT) e a molécula Glutationa Reduzida (GSH). A GSH é a principal defesa antioxidante da célula e está intimamente relacionada ao equilíbrio do ciclo celular redox; sendo assim, a

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manutenção dos seus níveis é primordial para o bom funcionamento da célula e combate ao estresse oxidativo (KULAK et al., 2013). Estudos pré-clínicos sugerem que a geração de radicais livres está envolvida na fisiopatologia da depressão, já que os animais apresentaram níveis mais elevados de peroxidação lipídica e níveis mais baixos de GSH no cérebro (ABDEL-SALAM; MORSY; SLEEM, 2011; MAJDI et al., 2019)

Diversos estudos relatam distúrbios oxidativos em pacientes deprimidos, incluindo dano oxidativo, com aumento de EROs e ERNs, e função enzimática dos sistemas antioxidantes diminuída (COBLEY; FIORELLO; BAILEY, 2018; FINDIKL et al., 2018; GHASEMI, 2019; MAJDI et al., 2019). O estresse oxidativo causa danos no cérebro, levando à lesão e apoptose de neurônios. Além disso, a redução da atividade das enzimas antioxidantes, também leva ao aumento do catabolismo dos neurotransmissores monoaminérgicos, mecanismos estes relacionados à fisiopatologia da depressão (NUTT, 2008).

1.2.3 Hipótese Neuroinflamatória

A hipótese neuroinflamatória caracteriza a depressão como uma doença relacionada à ativação imune mediada por células, podendo ser desencadeada por estresse (ZHANG et al., 2017). Há fortes evidências de que os processos inflamatórios mediados por citocinas têm relação com o surgimento da sintomatologia (ZUNSZAIN et al., 2011).

O processo inflamatório, inicialmente, envolve a síntese e liberação de mediadores pró-inflamatórios, como citocinas e quimiocinas. Em nível periférico, a inflamação geralmente envolve monócitos, neutrófilos, macrófagos e a cascata do complemento, gerando EROs nos locais de infecção. No SNC as células da glia (micróglia e astrócitos) assumem esse papel (DU et al., 2019; RIAL et al., 2016).

Pacientes depressivos apresentam altos níveis de citocinas pró-inflamatórias, como Interleucina 1 (IL-1), Interleucina 6 (IL-6) e Fator de Necrose Tumoral α (TNFα), proteínas de fase aguda, quimiocinas e moléculas de adesão (KOPSCHINA FELTES et al., 2017; MILLER; RAISON, 2016). Soma-se a isso, o fato de que a administração terapêutica de Inerferon α (IFNα) desencadeia sintomatologia depressiva em mais de 50% dos pacientes, que pode ser tratada com antidepressivos (BULL et al., 2009).

Estudos com animais têm dado evidências da função das citocinas no contexto do estresse e depressão. Camundongos expostos ao estresse crônico moderado mostraram níveis aumentados de IL-1β no hipocampo, em conjunto com o desenvolvimento de mudanças comportamentais típicas da depressão, como diminuição da preferência por sacarose e redução

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da exploração social. Além disso, a deleção do receptor de IL-1 previne o aparecimento dessas mudanças causadas pela exposição crônica ao estresse (DENG et al., 2015; GOSHEN et al., 2008; KOO; DUMAN, 2008; REBOUÇAS, 2019).

A hipótese neuroinflamatória, ou das citocinas, sugere que estressores externos, ou psicossociais, e estressores internos, como condições inflamatórias, podem levar à depressão via processos inflamatórios (HOLZER et al., 2017; SLAVICH; IRWIN, 2014).

1.2.4 Dano neuronal e déficit de memória na depressão

Além das alterações emocionais, diversos estudos relatam o aparecimento de disfunções cognitivas em pacientes depressivos, sendo estas muito mais duradouras, podendo permanecer mesmo nos perídos de remissão (MCINTYRE et al., 2013; MILLAN et al., 2012; MISKOWIAK et al., 2012).

O estresse crônico ou mesmo experiências traumáticas isoladas podem alterar as funções cognitivas, tais como aprendizagem e memória (IOB; KIRSCHBAUM; STEPTOE, 2019; SCHILLING et al., 2013). Segundo um estudo de Saveanu et al., (2012), 85% dos pacientes vivenciam significantes eventos estressantes antes do início dos sintomas depressivos (SAVEANU; NEMEROFF, 2012). As queixas cognitivas durante a fase sintomática são comumente mais relatadas por indivíduos com depressão, quando comparado a outros transtornos mentais graves, como esquizofrenia e transtorno bipolar (MCINTYRE et al., 2013).

O hipocampo é particularmente susceptível aos efeitos danosos do estresse prolongado, visto que possui grande densidade de receptores glicocorticóides. Esses efeitos danosos são evidenciados pela diminuição da ramificação dendrítica e diminuição da neurogênese, com possível redução do tamanho hipocampal (KANDEL, 2014; PHAM et al., 2003; VAN BODEGOM; HOMBERG; HENCKENS, 2017).

As citocinas pró-inflamatórias também têm sido relacionadas à patogênese da depressão e ao dano ao aprendizado e memória. Citocinas podem afetar a neuroplasticidade, influenciando o funcionamento neuronal por meio de mudanças na apoptose, estresse oxidativo e desarranjo metabólico, assim como comprometimento nos processos de ramificação neuronal (HIMMERICH et al., 2019). Em particular, IL-1β mostrou inibir a potenciação de longa duração (LTP), uma forma de plasticidade neuronal que é a base para o aprendizado e memória, os quais estão frequentemente afetados na depressão (IOB;

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KIRSCHBAUM; STEPTOE, 2019; MAYDYCH, 2019).

1.3 Modelos animais no estudo da depressão – Estresse Crônico Imprevisível (ECI) Modelos animais pré-clínicos são utilizados como uma maneira eficiente de estudar a etiologia de desordens humanas, por permitir a associação de sintomas encontrados em humanos às alterações comportamentais e neuroquímicas encontradas nos animais. No entanto, na depressão essa correlação torna-se, por vezes, difícil, visto que os sintomas são frequentemente subjetivos e variáveis. Portanto, para que um modelo animal de depressão seja útil, ele deve apresentar maneiras de avaliar o grau de semelhança com este distúrbio clínico. Sendo assim, o modelo deverá compreender uma série de critérios estabelecidos para a sua validade (WILLNER, 2017).

Com o propósito de estudar a sintomatologia da depressão, alguns modelos animais foram desenvolvidos, e a escolha deste será determinada pelo aspecto da doença a ser estudado (WANG et al., 2017).

A depressão tem sido descrita como um distúrbio relacionado ao estresse e há uma boa evidência de que seu início e recaída podem ser precipitados por estresse repetido ou experiências estressantes graves (HAMMEN, 2018; RICHTER-LEVIN; XU, 2018). Com base nessa hipótese,Willner (1987, 2017) desenvolveu, avaliou e validou o modelo de estresse crônico imprevisível (ECI), na tentativa de imitar alguns dos fatores ambientais que contribuem para a indução de distúrbios depressivos em seres humanos. Os protocolos consistem em submeter os animais, durante várias semanas, a inúmeros fatores estressantes, de forma aleatória e imprevisível, o que reduz as chances de habituação; têm como finalidade reduzir o comportamento depressivo símile, verificar a anedonia e observar as alterações bioquímicas e morfológicas do cérebro (WILLNER, 2017).

O modelo foi projetado inicialmente para imitar a anedonia, um sintoma central da depressão clínica, que diz respeito à perda de interesse em estímulos normalmente gratificantes. Uma revisão recente (WILLNER, 2005, 2017) resumiu estudos de mais de sessenta grupos de pesquisa que relatam diminuição da reatividade a recompensas e uma variedade de outros comportamentos semelhantes à depressão, após exposição ao ECI. Além disso, vários estudos relataram a eficácia dos antidepressivos, como Fluoxetina e Doxepina, em reverter alterações morfológicas e comportamentais associadas ao estresse nos modelos de roedores (HARE; GHOSAL; DUMAN, 2017; KIM et al., 2018).

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efeito na neurogênese hipocampal, causando rápidas e consistentes reduções na proliferação e sobrevivência de neurônios recém-formados no cérebro adulto (BAPTISTA; ANDRADE, 2018; TODA et al., 2019), podendo gerar, nos animais, alterações comportamentais e neuroquímicas características da depressão, como diminuição do tempo de imobilidade no Teste do Nado Forçado (DENG et al., 2015), redução da preferência pelo consumo da solução de sacarose (REBOUÇAS, 2019), aumento da atividade das enzimas catalase e superóxido dismutase – SOD e aumento da peroxidação lipídica representada pelo aumento da concentração de malondialdeído (THAKARE et al., 2018), aumento de nitrito e aumento da concentração de corticosterona sérica (XU et al., 2017). Esses achados são particularmente importantes, pois embasam a hipótese de que o estresse crônico compromete a plasticidade do hipocampo, levando à diminuição da neurogênese e eventualmente aos sintomas depressivos (BAPTISTA; ANDRADE, 2018; TODA et al., 2019).

1.4 Abordagem terapêutica da depressão

O tratamento do transtorno depressivo não se baseia apenas em fármacos antidepressivos, mas também inclui intervenções comportamentais e medidas psicoterapêuticas (GUO; KONG; ZHANG, 2019; LANTHEAUME; MONTAGNE; SHANKLAND, 2019). Estudos evidenciaram a relação entre hábitos de vida não saudáveis e o aparecimento de sintomas depressivos (PAGLIAI et al., 2018; PETROULIA et al., 2018; RUBIN et al., 2019). Desse mesmo modo, dietas balanceadas, realização de exercícios físicos e cuidados com a qualidade do sono têm sido descritos como auxiliares no tratamento da depressão (LEGRAND; NEFF, 2016; MORAES et al., 2019; PAGLIAI et al., 2018; SIQUEIRA et al., 2016).

A psicoterapia, que inclui terapia cognitivo-comportamental, psicoterapia interpessoal, terapia de resolução de problemas e psicodinâmica, tem mostrado eficácia no tratamento da depressão (CUIJPERS et al., 2008; GUO; KONG; ZHANG, 2019; LANTHEAUME; MONTAGNE; SHANKLAND, 2019).

Apesar de todas essas opções terapêuticas, coadjuvantes no tratamento da depressão, a utilização de fármacos se faz necessária na maioria dos casos. Desde as primeiras classes de antidepressivos descritos, muitos avanços já ocorreram, garantindo a descoberta de fármacos cada vez mais seguros e eficazes (DUBOVSKY, 2018; O’LEARY; DINAN; CRYAN, 2014).

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A primeira classe de antidepressivos descoberta foi a dos inibidores da monoaminoxidase (IMAOs). Seu mecanismo no tratamento da depressão consiste no bloqueio da isoforma A da enzima monoaminoxidase, responsável pela degradação dos neurotransmissores monoaminérgicos. Outra classe de fármacos largamente utilizada é a dos antidepressivos tricíclicos (ADT), cujo mecanismo consiste em bloquear a recaptação de monoaminas, principalmente noradrenalina (NA) e serotonina (5-HT), e, em menor proporção, dopamina (DA). O bloqueio de outros receptores, como os histaminérgicos, alfa-adrenérgicos e muscarínicos está relacionado aos seus efeitos adversos (hipotensão ortostática, sedação, constipação, xerostomia). Os principais exemplos desses fármacos são amitriptilina e nortriptilina (BRUNTON et al., 2018; KATZUNG, 2017).

Os inibidores seletivos da receptação de serotonina (ISRS) estão entre os fármacos mais utilizados para o tratamento da depressão. Possuem baixa afinidade por receptores histaminérgicos, adrenérgicos e muscarínicos, diminuindo assim os efeitos adversos encontrados nos ADT (BRUNTON et al., 2018; KATZUNG, 2017). Entre os ISRS, a Fluoxetina tem-se destacado como fármaco de escolha no tratamento de alguns subtipos de depressão, inclusive em depressões severas (LAZAREVIC et al., 2019; OTTEVANGER, 1991; ZHOU et al., 2019). Buscando aumentar a eficácia e a tolerabilidade dos fármacos antidepressivos, foram desenvolvidos fármacos com mecanismos de ação distintos, dentre eles trazodona, bupropiona e mirtazapina (BRUNTON et al., 2018).

Embora com grandes avanços, a farmacoterapia da depressão ainda apresenta falhas, como resistência ao tratamento, demora no início da ação dos fármacos, bem como efeitos adversos (AMSTERDAM; HORNIG-ROHAN, 1996; MCINTYRE et al., 2014). Esses fatores justificam a pesquisa de novas drogas que apresentem melhores características de segurança, eficácia e tolerabilidade, aumentando, assim, a adesão ao tratamento e a qualidade de vida dos pacientes.

1.5 Carvacrol (Carv)

Os terpenos ou terpenóides representam uma das maiores e mais diversas classes de substâncias químicas de origem natural, com aproximadamente 55.000 membros isolados (MAIMONE, BARAN, 2007). Carvacrol (5-isopropil-2-metil-fenol) é um monoterpeno (Fig. 2) naturalmente encontrado nos óleos essenciais de diversas plantas aromáticas, tais como o orégano (Origanum vulgaris) e tomilho (Thymus vulgaris), onde aparece como constituinte

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majoritário, juntamente com seu isômero timol (LAROUGI et al, 1993; MULINACCI et al.; GROSSO et al., 2010).

Figura 2: Estrutura química do monoterpeno Carvacrol.

Fonte: adaptado de HAJIMEHDIPOO (2010).

Já tem sido descrito que o tomilho apresenta vários benefícios medicinais, dentre os quais se destacam as propriedades antimicrobiana e antifúngica (GONELIMALI et al., 2018; LIU et al., 2017a; PUŠKÁROVÁ et al., 2017). As propriedades antimicrobianas do óleo essencial do tomilho estão relacionadas ao seu alto teor fenólico (GEDIKOĞLU; SÖKMEN; ÇIVIT, 2019). Estudo mais recente mostra sua atividade contra seis bactérias de origem alimentar, sendo seu principal efeito contra Staphylococcus e Bacillus cereus (SOTELO-BOYÁS et al., 2017). Também existem diversos estudos mostrando a atividade antimicrobiana do óleo essencial do orégano, outra planta rica em Carv (ABOUELEZZ et al., 2019; BEAUBRUN et al., 2018; LOFA et al., 2019).

Aeschbach et al. (1994) sugeriram que o Carv apresenta propriedades antioxidantes que podem ser utilizadas como uma alternativa aos aditivos antioxidantes sintéticos usados na preservação de alimentos, bem como inibe a peroxidação de lipossomos fosfolipídios de maneira dose-dependente. Slamenova et al. (2008) sugerem uma ação protetora contra peróxido de hidrogênio (H2O2) no fígado e células testiculares de ratos pré-tratados com Carv. Além disso, estudos mais recentes mostraram que Carv induziu uma ação antioxidante, diminuindo os níveis de peroxidação lipídica,

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carbonilação de proteínas e nitração de proteínas nas membranas mitocondriais de neuroblastos humanos (CHENET et al., 2019).

Estudos de células neoplásicas de pulmões humanos demostraram que Carv apresenta propriedades antitumorais (JUNG; KIM; LEE, 2018;(KOPARAL; ZEYTINOGLU, 2005). Pesquisas mais atuais apresentam o forte potencial de Carv como agente quimiopreventivo contra células cancerígenas da próstata humana independentes de androgênio (KHAN et al., 2019). Essas atividades podem estar relacionadas à sua habilidade de modificar as membranas lipídicas e a permeabilidade dos canais iônicos ou devido à sua natureza antioxidante (IPEK et al., 2005). Além disso, Guimarães et al. (2010) fizeram um estudo que demonstrou uma possível ação antinociceptiva de Carv em camundongos tratados intraperitonealmente e uma possível ação antioxidante in vitro.

Nosso grupo realizou estudos com Carv nas doses de 25 e 50 mg/kg com o objetivo de investigar possíveis ações centrais desta substância em modelo animal agudo de depressão e ansiedade. Os resultados demonstraram que este monoterpeno apresentou ações ansiolíticas (MELO et al., 2010) e antidepressivas (MELO et al., 2011), possivelmente por meio da ativação de vias gabaérgicas e dopaminérgicas, respectivamente.

Carv tem atraído a atenção da comunidade científica devido à grande variedade de atividades biofarmacológicas que apresenta, incluindo ação antibacteriana, antifúngica, antioxidante, anti-inflamatória, antinociceptiva, antitumoral e hepatoprotetora (ABOUELEZZ et al., 2019; BEAUBRUN et al., 2018; CHENET et al., 2019; JUNG; KIM; LEE, 2018; KHAN et al., 2019; LOFA et al., 2019; SOTELO-BOYÁS et al., 2017). Assim, considerando a importância dos resultados dos estudos pré-clínicos que demonstraram um potencial antidepressivo do Carv em modelos animais de depressão, pretende-se dar prosseguimento à investigação dos mecanismos de ação desta substância farmacologicamente ativa, por meio da análise de marcadores inflamatórios, bem como do estudo dos efeitos sobre déficit de memória em camundongos submetidos ao modelo de depressão induzida por ECI.

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2. RELEVÂNCIA E JUSTIFICATIVA

A depressão é uma doença grave, crônica e incapacitante, que compromete a qualidade de vida do indivíduo e de sua família, devido aos seus sintomas físicos e emocionais (LIM et al., 2018). Foram obtidos grandes avanços no que se refere ao conhecimento da fisiopatologia da depressão e no desenvolvimento de fármacos, mas os antidepressivos encontrados no mercado atualmente ainda possuem o mecanismo de ação baseado na teoria monoaminérgica da depressão (O’LEARY; DINAN; CRYAN, 2014).

Tem sido estudada a relação entre os transtornos de ansiedade e depressão e o estresse, tendo em vista que o estresse crônico, seja este causado pela perda de entes queridos, conflitos sociais, problemas de saúde e/ou trabalho excessivo, está relacionado ao desenvolvimento dessas doenças (BERNARAS; JAUREGUIZAR; GARAIGORDOBIL, 2019; NORMANDEAU et al., 2018). Ademais, foi visto que pacientes com depressão apresentavam elevados níveis de citocinas pró-inflamatórias, demonstrando uma possível relação entre depressão, estresse e inflamação (BAUER; TEIXEIRA, 2019; FAROOQ et al., 2017; HIMMERICH et al., 2019).

A investigação das vias envolvidas na fisiopatologia da depressão constitui-se um desafio, pois alguns dos sintomas são subjetivos e variáveis, como culpa e ideação suicida. A utilização de modelos animais, como o ECI, para simular fatores ambientais estressantes, possibilita investigar se o estresse ambiental é capaz de desenvolver o comportamento característico da doença, assim como mimetizar o que ocorre em humanos (WILLNER, 2005).

Mesmo com o desenvolvimento de diferentes classes de antidepressivos, a resistência ao tratamento ainda alcança altos índices. Nesse contexto, os produtos naturais constituem uma grande fonte para o desenvolvimento de novas drogas (CARLSON, 2010). Em estudos realizados pelo nosso grupo, Carv (5-isopropil-2-metil-fenol), um monoterpeno encontrado principalmente em óleos essenciais de plantas do gênero Thymus e Lamiaceae, quando administrado agudamente, demonstrou possuir efeitos sobre o SNC, incluindo atividade ansiolítica, antidepressiva e analgésica (MELO, 2010, 2014).

Diante do rico potencial farmacológico e de sua atividade antidepressiva, já demonstrada em modelos animais de estresse agudo, foi dada continuidade à investigação do efeito antidepressivo de tal substância, utilizando o modelo de depressão induzida por estresse crônico imprevisível (ECI). Nessa perspectiva, pretendeu-se investigar, mais detalhadamente, o efeito antidepressivo do Carv, com ênfase na hipótese neuroinflamatória da depressão.

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3. OBJETIVOS

3.1 Geral

Investigar o efeito do Carvacrol na reversão de alterações comportamentais e neuroquímicas em camundongos submetidos ao modelo do Estresse Crônico Imprevisível.

3.2 Específicos

Avaliar os efeitos do Carvacrol em camundongos submetidos ao modelo do Estresse Crônico Imprevisível sobre os seguintes parâmetros em testes comportamentais e neuroquímicos:

 Atividade exploratória e locomotora no teste do Campo Aberto;

 Tempo de Imobilidade no teste do Nado Forçado, Anedonia no Teste de Preferência pela solução de Sacarose e Índice de habilidade social no teste de Interação Social;  Déficits de memória nos testes Reconhecimento de Objetos e Labirinto em Y;

 Efeito antioxidante através da mensuração de parâmetros do estresse oxidativo (malondialdeído, glutationa reduzida e nitrito/nitrato) no hipocampo e córtex pré-frontal.

 Efeito antiinflamatório por meio da determinação dos níveis de IL-1β e TNFα no hipocampo.

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4. MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 Animais

Foram utilizados camundongos Swiss, machos, com idade de 6 a 8 semanas, pesando entre 20 e 24g, provenientes do Biotério Setorial do Departamento de Fisiologia e Farmacologia, da Faculdade de Medicina, da Universidade Federal do Ceará. Os animais foram mantidos em caixas de propileno a 26 ± 2ºC, com ciclo claro/escuro alternado de doze horas, recebendo alimento padrão e água ad libitum.

4.2 Princípios Éticos

Os experimentos foram realizados após aprovação do projeto (Nº protocolo: 62921405/18) pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) da Universidade Federal do Ceará. Os protocolos experimentais seguiram os princípios éticos aceitos pelo National Institute of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (NIH et al., 2011). Todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento e reduzir o número de animais usados nos experimentos.

4.3 Drogas

Todas as substâncias a seguir foram administradas em um volume de 0,1 mL/10 g de peso do animal.

 Carvacrol [50 mg/kg, via oral (v.o.)], (Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA) foi dissolvido em 2% de Tween 80® e diluído em solução salina 0,9%. A escolha da dose utilizada foi baseada nos resultados prévios de Melo (2010, 2014).

 Fluoxetina [FLU, Sandoz® 10 mg/kg, via oral (v.o.)] foi diluída em salina 0,9%. A escolha da dose utilizada foi baseada nos estudos de Ossowska (2004).

4.4 Indução de depressão por estresse crônico imprevisível

A exposição ao ECI foi realizada para mimetizar o estado de depressão induzido pelo estresse crônico. O procedimento é uma versão modificada da usada por He (2016). Os

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camundongos foram submetidos a fatores estressores de forma aleatória, durante 28 dias, de modo que fosse imprevisível. Os fatores estressores foram aplicados conforme o cronograma abaixo:

Quadro 1. Estímulos estressores para indução do comportamento depressivo por estresse crônico imprevisível (He et al., 2016) com adaptações:

DIA ESTRESSOR TEMPO

1 Ciclo Claro 24 horas

2 Contenção do animal em tubos plásticos 2 horas

3 Pequeno choque nas patas (1 miliampere) 2 segundos

4 Privação de água 18 horas

5 Ciclo intermitente entre luzes acesas e apagadas 18 horas

6 Caixa Inclinada 6 horas

11 Presença de maravalha molhada 18 horas

28 Ciclo intermitente entre luzes acesas e apagadas 18 horas Fonte: Autoria própria.

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4.5 Desenho experimental

Para estes experimentos os grupos, contendo em média 8 animais, foram divididos conforme abaixo:

Quadro 2: Divisão dos grupos experimentais

Fonte: Autoria própria.

- Grupo controle (saudável): os animais foram mantidos na caixa sem nenhum fator estressante durante 28 dias, com administração de solução salina 0,9% com 2% de Tween 80® por via oral (v.o.) através de gavagem entre o 15º ao 28º dia.

- Grupo Carv (saudável): os animais foram mantidos na caixa sem nenhum fator estressante durante 28 dias, com administração de Carvacrol 50mg/kg, por via oral (v.o.) através de gavagem entre o 15º ao 28º dia.

- Grupo FLU (saudável): os animais foram mantidos na caixa sem nenhum fator estressante durante 28 dias, com administração de Fluoxetina (10mg/kg), por via oral (v.o.), através de gavagem, entre o 15º ao 28º dia.

- Grupo estresse crônico imprevisível (ECI): os animais foram submetidos a fatores estressores durante 28 dias, com administração de solução salina 0,9% com 2% de Tween® 80 por via oral através de gavagem (v.o.) entre o 15º ao 28º dia.

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dias, com administração de Carvacrol (50mg/kg) por via oral (v.o.) através de gavagem entre o 15º ao 28º dia.

- Grupo ECI + FLU: os animais foram submetidos a fatores estressores durante 28 dias, com administração de Fluoxetina (10mg/kg) por via oral (v.o.) através de gavagem entre o 15º ao 28º dia.

O ECI foi utilizado para mimetizar o estado de depressão induzido pelo estresse crônico. Uma visão geral do desenho experimental está ilustrada na Figura 3. Os grupos de animais (n=8, em média) foram submetidos a diferentes tipos de estresses aplicados aleatoriamente durante 28 dias, e foram tratados com as drogas ou veículo durante 14 dias; os animais receberam um desses estresses diariamente e o mesmo estresse não foi aplicado por 2 dias consecutivos, a fim de minimizar a previsibilidade de cada estresse. Os testes comportamentais (Preferência por sacarose, Nado Forçado, Campo aberto, Interação Social, Labirinto em Y, Reconhecimento de Objetos) foram realizados no 29º dia de tratamento. Após 1 hora dos testes comportamentais, os animais foram eutanasiados e as áreas cerebrais foram dissecadas para realização das análises neuroquímicas.

Figura 3: Fluxograma do protocolo experimental

Abreviações: ECI = Estresse Crônico Imprevisível; Carv = Carvacrol; FLU = Fluoxetina; v.o. = Via Oral Fonte: Autoria própria.

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4.6 Avaliação Comportamental

4.6.1 Teste do Campo Aberto

Este teste foi utilizado para avaliar a atividade locomotora do animal e a influência das drogas sobre tal atividade. Foi utilizado um aparato em acrílico (paredes transparentes e fundo preto, dimensões 30x30x15cm), dividido em 9 quadrantes. Como representado na figura 4, o animal foi colocado no centro do aparato e, durante 1 minuto percorreu livremente para ambientação. Durante os 5 minutos seguintes, foram observados os seguintes parâmetros: número de cruzamento entre os quadrantes (crossing), número de vezes que ele fica de pé sobre as patas traseiras (rearing) e número de movimento de autolimpeza (grooming). O aparato foi higienizado com álcool 10% após avaliação de cada animal (ARCHER, 1973).

Figura 4: Teste do Campo Aberto

4.6.2 Teste do Nado Forçado

O teste foi realizado de acordo com o modelo de Porsolt et al. (1977) com poucas modificações. Os animais foram colocados no cilindro com água, e a duração total da imobilidade (em segundos) foi registrada durante 6 minutos, com 1 minuto de adaptação, por

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um observador cego ao tratamento dado a cada animal. O camundongo foi considerado imóvel quando permaneceu flutuando passivamente, podendo fazer até leves movimentos para manter a cabeça fora da água (Figura 5).

Figura 5: Teste do Nado Forçado

Fonte: autoria própria.

4.6.3 Teste da preferência pela solução de sacarose

Esse teste é utilizado para avaliar a perda de prazer (anedonia) por meio da preferência pela solução de sacarose. O teste foi realizado como descrito por Mao et al. (2014) com pequenas modificações. Antes do teste, os camundongos foram treinados colocando-se dois frascos de uma solução de sacarose (2%, p/v), durante 18 horas. Em seguida, uma das garrafas foi substituída por água por 18 horas. Após a adaptação, para a realização do teste, os animais foram colocados em gaiolas individuais e receberam a opção de uma garrafa contendo 100 mL de água e outra contendo 100 mL de sacarose (2%, p/v), durante 18 horas (Figura 6). Ao final do teste, foi determinada a porcentagem de preferência pela solução de sacarose calculada pela seguinte fórmula:

Preferência por sacarose (%) = consumo de sacarose

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Figura 6: Teste de Preferência pela Solução de Sacarose

Fonte: adaptado de Sousa (2015).

4.6.4 Teste de Interação social

Para avaliar a interação social, os animais foram inseridos em um aparato de acrílico (60 × 40 cm) dividido em três compartimentos. Em um dos compartimentos da lateral existia uma gaiola de ferro contendo um animal do mesmo sexo e idade (câmara social), na outra lateral continha outra gaiola de ferro sem animal em seu interior (câmara oposta) e o compartimento do meio era vazio, podendo o animal passar livremente de um compartimento para outro (Figura 7). Os animais foram inseridos na câmara do meio e seus comportamentos registrados durante cinco minutos (RADYUSHKIN et al., 2009). O tempo de permanência em cada uma das câmaras foi medido e a preferência social foi definida como:

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Figura 7: Teste de Interação Social

4.6.5 Teste de Reconhecimento de Objetos

O teste de reconhecimento de objetos é baseado na tendência natural dos animais buscarem o novo (ENNACEUR; DELACOUR, 1988). Inicialmente, os animais foram colocados no aparato, uma arena quadrada (30x30x15 cm) de acrílico, por 5 min para fins de ambientação. Após 15 min, deu-se início ao treino. Neste, o animal foi colocado no aparato contendo dois objetos iguais (OI) e, durante 5 min, teve a liberdade de explorar o ambiente e os objetos. Após 15 min, um dos objetos iguais foi substituido pelo objeto novo (ON) e o animal foi colocado novamente na arena teste. Durante 5 min, o tempo que o animal utilizou explorando cada um dos objetos foi anotado (Figura 8). O resultado foi expresso como índice de reconhecimento e foi obtido a partir da seguinte fórmula:

Índice de reconhecimento = (tempo ON – tempo OI) − (tempo ON + tempo OI)

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Figura 8: Teste de Reconhecimento de Objetos

4.6.6 Teste do Labirinto em Y

A memória operacional e o aprendizado foram avaliados por meio do teste de labirinto em Y (SARTER; BODEWITZ; STEPHENS, 1988). O labirinto consiste em três braços idênticos (A,B,C) de 40 cm de comprimento, 25 cm de altura e 6 cm de largura – cada um convergindo a um ângulo igual. Cada camundongo foi colocado na extremidade de um braço e deixado para explorar o ambiente por oito minutos (Figura 9). A sequência dos braços em que os animais entraram foi então anotada e as informações analisadas de forma a determinar o número de entrada nos braços sem repetição. Uma alternância foi considerada correta se o animal visitou um novo braço e não retornou ao braço anteriormente visitado.

Alternações corretas (%) = alternações corretas

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Figura 9: Teste do Labirinto em Y

4.7 Testes Neuroquímicos

4.7.1 Dissecação das áreas cerebrais

Os animais foram eutanasiados com o uso de guilhotina e os cérebros foram retirados e rapidamente colocados sobre papel alumínio em uma placa de Petri com gelo. O hipocampo e o córtex pré-frontal foram retirados para o preparo dos homogenatos utilizados em testes posteriores. Ao final da dissecação, as áreas foram armazenadas em microtubos eppendorfs® devidamente identificados, pesados e conservados a -70°C para uso posterior.

4.7.2 Determinação de parâmetros de estresse oxidativo 4.7.2.1 Determinação dos níveis de nitrato/nitrito

Para avaliar os efeitos do tratamento com as respectivas drogas na produção de NO, foram determinados os níveis de nitrito nos homogenatos, pelo método de Green et al. (1982). Para esse experimento 100 µL do Reagente de Griess (ácido fosfórico 5%, sulfonilamida 1% em ácido fosfórico 5%, NEED 0,1% e água destilada) foram adicionados a

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100 µL do sobrenadante do homogenato e incubados a temperatura ambiente por 10 min. A curva padrão foi elaborada com várias concentrações de Nitrito de Sódio (NaNO2), variando de 0,75 a 100 mM, sob as mesmas condições. Os brancos foram preparados pela adição de 100 µL do Reagente de Griess a 100 µL do tampão usado para o homogenato (fosfato de potássio monobásico 50 mM, pH 7,4). A absorbância foi medida em leitor de microplacas em 540 nm, e o resultado expresso em μmol de nitrito/g de tecido.

4.7.2.2 Avaliação da peroxidação lipídica

O grau de lipoperoxidação nas áreas cerebrais foi medido através da determinação de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), malonildialdeído (MDA), conforme o método de Draperet al. (1990), seguindo o protocolo a seguir.

Foram preparados os homogenatos das áreas cerebrais a 10% em tampão fosfato de potássio monobásico 50 mM, pH 7,4 e 63μL destes foram adicionados a 100 μL de ácido perclórico 35% em microtubos eppendorf®, que foram centrifugados a 10000 rpm por 10 minutos a 4ºC. Em seguida 150 μL do sobrenadante foram adicionados a 50 μL de ácido tiobarbitúrico 1,2%, que ficaram em banho-maria a 95ºC por 30 minutos. Por fim, 150 μL da mistura foram adicionados aos poços da placa de ELISA e, posteriormente, foi feita a leitura a 535nm. Os resultados foram expressos em µg de MDA/g de tecido.

4.7.2.3 Determinação da concentração de glutationa reduzida (GSH)

Os níveis de GSH foram avaliados para estimar defesas endógenas contra o estresse oxidativo. O método é baseado na reação de reagente de Ellman (DTNB), com grupos tiol livres. Foram retirados 400μL do homogenato e adicionados a 320μL de água destilada e mais 80μL de ácido tricloroacético a 50%. O material foi centrifugado a 3000 rpm por 15 minutos. Em seguida, foram recolhidos 400μL do sobrenadante e acrescidos 800μL de tampão Tris-HCl 0,4M, pH 8,9 e mais 20μl de DTNB 0,01M aos poços da placa de ELISA e após 1 minuto da reação foi feita a leitura da coloração a 412nm (SEDLAK; LINDSAY, 1968). A concentração de glutationa reduzida foi expressa em µg de GSH/g de tecido, tendo por base uma curva padrão.

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4.7.3 Mensuração das concentrações de IL-1β e TNFα

As áreas cerebrais dissecadas foram homogeneizadas em 8 volumes de tampão PBS com protease (EMD Biosciences®), fosfatase (Sigma®-Aldrich), para posteriormente serem centrifugadas (10000 rpm, 5 min) e utilizando sobrenadante da diluição. A concentração das citocinas, em 50 μL de amostras, foi determinada por ELISA (R&D® Systems, Minneapolis, MN, EUA) de acordo com o protocolo do fabricante e expressa em pg/g de tecido.

4.8 Análise Estatística

A análise estatística dos dados foi realizada através do software GraphPad Prism versão 6.0 para Windows (GraphPad Software®, San Diego Califórnia EUA). Inicialmente, os resultados foram submetidos ao teste de Shapiro-Wilk, para verificar a normalidade da amostra. Por apresentar testes com mais de três grupos, foi utilizado o teste de análise de variância (ANOVA) seguido do teste de Tukey (post hoc) para resultados paramétricos ou Kruskal-Wallis seguido do teste de Dunn’s (post hoc) para os não paramétricos.

Em todas as análises estatísticas, os valores foram representados pela Média ± Erro Padrão da Média (EPM) com valores significativos quando p<0,05.

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5. RESULTADOS

5.1 Avaliação Comportamental

5.1.1 Efeito da administração de Carv (50 mg/kg) sobre a atividade locomotora e exploratória de camundongos no teste do Campo Aberto

O teste do Campo Aberto, realizado com o objetivo de avaliar possíveis alterações na atividade locomotora dos animais, mostrou que não houve diferença significativa entre os grupos, como pode ser visto na tabela 1 no parâmetro da atividade locomotora. Também não houve diferença estatisticamente significativa nos parâmetros de grooming e rearing

Tabela 1: Efeito da administração de Carv no teste do Campo Aberto

GRUPO ATIVIDADE LOCOMOTORA REARING GROOMING

CONTROLE 92,14 ± 5,157 1,313 ± 1,894 1,125 ± 0,2950 Carv 61,13 ± 7,162 6,500 ± 2,542 2,143 ± 0,7047 FLU 67,38 ± 5,039 6,500 ± 1,476 1,857 ± 0,7997 ECI 98,75 ± 9,960 8,875 ± 1,856 2,571 ± 0,2974 ECI + Carv 79,25 ± 5,202 8,750 ± 1,623 2,500 ± 0,5976 ECI + FLU 87,57 ± 9,693 8,500 ± 1,842 1,250 ± 0,2500

Resultados expressos como média ± EPM (n=8-10 animais/grupo). Não houve diferenças significativas de acordo com ANOVA (one-way) seguido do teste post hoc de Tukey para comparações múltiplas. Abreviações: ECI = Estresse Crônico Imprevisível; Carv = Carvacrol; FLU = fluoxetina.

5.1.2 Efeito da administração de Carv (50 mg/kg) sobre o tempo de imobilidade de camundongos no teste do Nado Forçado

O teste do nado forçado foi utilizado para avaliar o efeito da administração de Carv (50 mg/kg) na reversão do comportamento depressivo-símile dos animais expostos ao ECI. Como demonstrado no Gráfico 1, o grupo ECI apresentou um aumento significativo no tempo de imobilidade quando comparado ao controle (ECI: 121,9 ± 13,22; CONTROLE:

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31,75 ± 5,411; p<0,0001). Carv reverteu o aumento no tempo de imobilidade provocado pelo ECI, de maneira significativa (ECI: 121,9 ± 13,22; ECI + Carv: 49,25 ± 11,40; p<0,001).

Gráfico 1: Efeito da administração de Carv no teste de Nado Forçado.

Os animais (n=6-8/grupo) foram tratados durante 14 dias com Carvacrol (50mg/kg) ou fluoxetina (10mg/kg). No 29º dia do protocolo experimental foram submetidos ao teste do Nado Forçado para verificar o tempo de

imobilidade (s) durante 5 minutos. Os valores estão representados como média ± EPM. ####_{p<0,0001 vs}

CONTROLE; ***_{p<0,001 vs ECI. Teste ANOVA, seguido de Tukey (post hoc).Abreviações: ECI = Estresse}

Crônico Imprevisível; Carv = Carvacrol; FLU = fluoxetina.

5.1.3 Efeito da administração de Carv (50 mg/kg) sobre o comportamento do tipo anedônico de camundongos no teste de Preferência pela Solução de Sacarose

No teste de Preferência pela Solução de Sacarose, o ECI diminuiu a preferência por solução de sacarose quando comparada ao grupo controle (ECI: 61,38 ± 3,076; CONTROLE: 90,13 ± 2,191; p<0,0001). Carv reverteu esse comportamento anedônico provocado pelo ECI, de maneira tão significativa quanto o antidepressivo padrão (ECI: 61,38 ± 3,076; ECI + Carv: 86,00 ± 2,632; ECI + FLU: 85,00 ± 3,988; p<0,001).