Pela busca de terapias com substâncias não sintéticas e o interesse por parte dos investigadores em caracterizar e estudar a aplicação das plantas na área medicinal, tem vindo a crescer a investigação da aplicação de compostos naturais provenientes das plantas. Exemplos de espécies endémicas de Portugal, utilizadas tradicionalmente para o tratamento de várias patologias são a carqueja (Pterospartum tridentatum Wilk.) e a erva de S. Roberto (Geranium
robertianum L.). São utilizadas devido aos efeitos: anti-inflamatório, anti-diabético, anti-
cancerígeno, entre muitos outros (Coelho et al., 2011; Ferreira et al., 2010; Grosso et al., 2007; Martins, 2011; Neagu et al., 2010; Paun et al., 2012; Vitor et al., 2004). Com a sua extensa aplicação é importante e necessário o conhecimento da aplicação dos extratos no organismo, sendo essencial saber o local e forma de ação e se efetivamente existe fundamento científico para todas estas aplicações.
Das duas espécies estudadas, aquela que apresentou resultados mais promissores foi a erva de S. Roberto, devido a apresentar, a nível da viabilidade celular um maior número de tratamentos com percentagens de redução de Alamar blue inferiores a 80%. A carqueja apenas apresentou um tratamento com resultados semelhantes. Mostrando assim que os extratos da erva de S. Roberto possuirá uma ação mais eficaz que os extratos da carqueja.
Seria de esperar que as espécies apresentassem resultados distintos, devido às diferenças morfo-anatómicas das duas espécies como mostra a figura 23. A carqueja é um arbusto de pequeno porte, apresentando folhas duras, constituídas por lenhina e paredes celulares mais resistentes, tornando a extrações dos compostos mais difíceis (Castroviejo, 1999; Ribeiro et al., 2000), já a erva de S. Roberto é uma herbácea com um caule delgado permitindo a uma extração mais fácil (Lima, 2009). Além de que para a obtenção dos extratos foram utilizadas diferentes partes da planta o que poderá influenciar os resultados. Para o extrato da carqueja foram utilizados caules, folha e flores, já para a obtenção dos extratos da erva de S. Roberto foram apenas utilizados folhas e caules.
A erva de S. Roberto foi a espécie que apresentou a maior concentração de compostos fenólicos, rondando os 270 mg GAE/ g de extrato, em comparação com a carqueja que apresentou 180 mg GAE/ g de extrato. Isto também se aplica para a atividade antioxidante para a erva de S. Roberto que ronda os 6 mmol Trolox/ g de extrato, sendo o dobro do valor quando comparado com a carqueja.
A B
Figura 23 – Comparação morfológica entre carqueja (A) e erva de S. Roberto (B). (adatado de Flora.on, 2012)
A atividade antioxidante superior por parte da erva de S. Roberto pode ser justificada por uma maior concentração de fenóis, bem como um maior poder de captação ou neutralização de radicais livres por parte dos compostos existentes. Também pode ser explicado por uma variada gama de compostos identificados.
No que toca à caracterização fitoquímica na erva de S. Roberto foram identificados um derivado glucosilado da apigenina, a luteolina e o ácido elágico. Estes compostos são conhecidos pelo seu alto poder antioxidante e pelas propriedades anti-carcinogénicas, imuno- modeladoras, neuro protetoras e anti-inflamatórias, (Delgado et al., 2009; Iacopini et al., 2008; Larrosa et al., 2010; Liu et al., 2013; Seelinger et al., 2008; Moretti et al., 2012; Xavier et al., 2009; Xu et al., 2010). É de indicar que possivelmente foi identificado um composto, através da bibliografia, na fração metanólica da extração aquosa, como geraniina (Tuominen et al., 2013). Este composto já foi identificado em plantas do género Geranium, e que também apresentam várias propriedades anti-tumorais (Okabe et al., 2001), hepatoprotetoras (Londhe
et al., 2012) e neuroprotetoras (Youn & Jun, 2013). Também outro composto com uma
intensidade relativa de 26,76% que não foi possível ser identificado.
É de referir que na fração metanólica surgiram compostos que não estavam presentes na amostra inicial, para ambas as extrações (hidro-etanólica e aquosa), o que nos leva a pensar que poderá ter ocorrido uma amplificação dos sinais nas amostras após SPE, uma vez que nas
amostras iniciais existe uma grande quantidade de compostos que poderão mascarar outras moléculas.
Quanto aos compostos existentes na carqueja foram identificadas a floretina, a miricetina e a isoquercetina como compostos maioritários, conhecidos por apresentarem propriedades anti-inflamatórias (Ribeiro et al., 2009), anti carcinogénicas (So et al., 1996) e antioxidantes (Cao et al., 2013; Jagetia & Reddy, 2005). Segundo vários autores também já foram identificadas a prunetina, a genistina, a sissotrina, a isoquercitrina e a rutina (Ferreira et al., 2012; Paulo et al., 2008; Vitor et al., 2004). Esta variação pode ter sido influenciada a vários níveis como o local de recolha, as condições de crescimento em que a planta se encontrou, a parte da planta utilizada, o solvente, entre outros.
Ao partir do princípio que a integridade e a viabilidade celular são proporcionais à quantidade de Alamar blue reduzido, espera-se que os compostos que tenham efeito a nível celular impossibilitem as células de reduzir o Alamar blue. Assim, é de interesse que os valores de percentagem de AB sejam baixos, uma vez que se está a trabalhar com células cancerígenas, seria importante que as células diminuíssem o seu crescimento ou morressem. Isto implicaria que os compostos existentes no extrato afetassem as células no seu metabolismo controlassem o seu ciclo celular e alterassem a taxa de divisão celular (Aggarwal & Shishodia, 2006; Al- Nasiry et al., 2007; Fjaeraa & Nånberg, 2009; Fraga & Oteiza, 2011; Kim et al., 2009; Tsai et
al., 2013).
Quanto aos efeitos da aplicação dos extratos nas linhas celulares estudadas, os resultados mais relevantes foram obtidos na erva de S. Roberto. Nesta planta muitos dos tratamentos apresentaram percentagens de redução de Alamar blue com valores inferiores 80 a 5 %. Os tratamentos que apresentam estes resultados foram as amostras iniciais de ambas as extrações (aquosa e hidro-etanólica) e a fração metanólica, também de ambas as extrações. Isto mostra que na fração metanólica existe efetivamente uma grande concentração de compostos fenólicos. Poderá mostrar assim que mesmo que a concentração de compostos fenólicos seja elevada, a sua atividade antioxidante dependa da presença de compostos com uma elevada capacidade antioxidante. As concentrações que se apresentaram mais efetivas foram 200 e 500 µg/ ml. Ambas as linhas celulares testadas foram afetadas pelos extratos, não havendo diferenças concretas com os resultados obtidos. Seria necessário realizar estudo mais profundos para observar qual as diferenças, se existirem, entre os dois tipos celulares.
As fração aquosas de ambas as extrações não foram tão efetivas pois nestas amostras além de não terem sido identificados quais quer compostos por HPLC, os resultados obtidos tanto para a atividade antioxidante como para a concentração de fenóis totais não foram mensuráveis.
Paun e colaboradores (2012) testaram extratos de Geranium robertianum em células Hep- 2p e concluíram que os extratos apresentavam uma citotoxicidade muito baixa para células saudáveis, e citotoxicidade seletiva para células tumorais Hep-2p. Ferreira e colaboradores (2010) demostraram que o extrato aquoso de erva de S. Roberto induziu um melhor funcionamento das mitocôndrias. Além disso houve uma diminuição dos ROS produzidos e eventualmente uma estimulação da biogénese mitocondrial.
Quanto à carqueja houve apenas um tratamento que apresentou resultados onde a redução da percentagem de redução de Alamar blue foi inferior a 80%, sendo esta a amostra inicial nas maiores concentrações (100, 200 e 500 µg/ ml). Embora os resultados obtidos não tenham sido os esperados, segundo Vítor (2004) que aplicou a isoquercetina extraída da carqueja que levou à proteção das células da veia do cordão umbilical humano induzidas a danos por H2O2. Mas
segundo Ferreira (2012) a aplicação do extrato aquoso da carqueja em células HepG2, nas concentrações de 125 e 375 mg/L, não apresentou redução da viabilidade das células pelo método MTT.
Sabe-se que um dos muitos fatores responsáveis pelo surgimento de inúmeras doenças de entre as quais o cancro, se deve ao descontrolo fisiológico da produção ou neutralização de espécies reativas ao oxigénio (Neagu et al., 2010; Silva et al., 2007). Os seres vivos possuem mecanismos de defesa contra os radicais livres, mas nem sempre são eficazes, e em alternativa o organismo pode obter antioxidantes provenientes da alimentação (Cerqueira et al., 2007; Wilfred & Nicholson, 2008) apresentando assim, um papel indispensável para a saúde (Cerqueira et al., 2007). Com base nestes pressupostos, os estudos para a descoberta de compostos para os tratamentos da carcinogénese, tem como base a utilização de células tumorais. A cultura deste tipo de células, tem sido uma importante ferramenta na investigação oncológica, permitindo o estudo dos mecanismos moleculares envolvidos na carcinogénese e a identificação de maradores de diagnóstico e prognóstico (Cruz, 2008)