Discussão

A morfologia e a morfometria do compartimento tubular na Distrofia Muscular de Duchenne ainda não está esclarecida na literatura científica, assim como o efeito da suplementação a base de ácido ascórbico nessa patologia. Dessa forma, esse trabalho avaliou se a morfometria tubular e os índices de produção espermáticos em camundongos mdx podem ser alterados pela DMD, bem como, se há influência da suplementação com ácido ascórbico sobre esses parâmetros. De acordo com França & Russell (1998), tanto o peso como o tamanho testicular são indicadores quantitativos da produção espermática. A elevação do peso da gônada pode implicar em alterações do epitélio seminífero ou edema intersticial (Sellers et al., 2007). Todavia, nesse trabalho a suplementação com ácido ascórbico em distróficos púberes elevou o peso testicular sem alterar significativamente o epitélio seminífero e o intertúbulo. Isso possivelmente ocorreu em virtude da intervenção do ácido ascórbico na manutenção da integridade fisiológica nos testículos, visto que diversas funções enzimáticas da vitamina C são essenciais para a síntese, desenvolvimento e manutenção testicular (Yousef, 2005).

A suplementação com ácido ascórbico ao elevar o peso corporal em distróficos púberes pode ter influenciado, positivamente, o comportamento reprodutivo. Essa variável é necessária para determinação do índice gonadossomático (IGS), que representa a percentagem de massa corpórea que corresponde ao testículo, e, do índice tubulussomático (ITS), que quantifica a proporção de túbulos seminíferos em relação à massa corporal (Paula et al., 2002). O IGS mostrou-se reduzido em camundongos distróficos na pré-puberdade quando comparado ao controle C30, isso implica que é requerido menor investimento de massa corporal para formação da gônada em virtude do maior peso corporal (Kenagy & Trombulak, 1986). Nessa pesquisa os valores médios do ITS nos camundongos controle foram próximos ao descrito Melo et al. (2010) para ratos, 0,50%, no entanto, no presente trabalho observa-se uma redução no ITS na transição da pré-puberdade para puberdade nos grupos distróficos e controle. Estes resultados indicam que na distrofia, semelhante ao controle, o maior investimento em túbulos seminíferos pode estar diretamente relacionado com a maior quantidade de energia requerida para a produção espermática no período pré-púbere.

A túnica albugínea e o mediastino testicular são constituintes morfológicos dos testículos, apesar de não estarem diretamente relacionados à espermatogênese pode alterar o peso da gônada e interferir em alguns parâmetros morfométricos (Azevedo et al., 2006). O percentual testicular ocupado pela túnica albugínea foi abaixo da média encontrada para ratos (6,5%, Russell & França, 1995). Contudo, a distrofia reduziu esse percentual ainda no período pré-púbere, assim como, em testículos de camundongos expostos a fluoreto de sódio, cujos percentuais de túnica albugínea foram diferentes para o grupo controle e menores em relação ao padrão para ratos, com percentual

de 1,81%, e para animais expostos a diferentes concentrações de fluoreto de sódio, com 1,63-2,01% (Sprando et al., 1998).

Ao remover a túnica albugínea é obtido o parênquima testicular, que é dividido em compartimento tubular e compartimento intertubular, sendo o compartimento tubular o principal componente do testículo. A organização do compartimento tubular foi semelhante às descrições prévias para a maioria dos mamíferos, com túbulos seminíferos compostos pela túnica própria com células mióides, epitélio seminífero e lúmen (Russell et al., 1990; França & Russell, 1998; França & Godinho, 2003; Costa et al., 2006; Beguelini et al., 2009; Costa et al., 2011). Na túnica própria dos animais de todos os grupos observou-se apenas uma camada de células mióides, assim como descrito na literatura para outros roedores (Bustos-Obregón, 1976). Essas células são contráteis e a distrofia alterou sua morfologia mostrando núcleo irregular, conforme observado na análise ultraestrutural, isso sugere perda de suas características funcionais, segundo afirmam Martin et al. (1992) em estudo realizado em pacientes com a síndrome de Klynefelter. Nesse caso os camundongos distróficos podem apresentar comprometimento funcional, como ao elevar a força para o movimento dos fluidos e da propulsão dos espermatozoides no túbulo seminífero (Clermont, 1958; Ross, 1967; Suvanto & Cormano, 1970; Russell et al., 1989a).

De acordo com Russell & França (1995) a túnica própria, ou tecido peritubular, compreende 1,2% do testículo em ratos. Na pré-puberdade, o percentual de túnica própria foi maior nos distróficos em relação aos animais controle, indicando uma maior espessura dessa túnica. Isso certamente foi decorrente do aumento de deposição de fibras colágenas (Bustos-Obregón, 1976). Essa elevação pode inibir a gametogênese em virtude do desequilíbrio das vias parácrinas de comunicação entre o túbulo e intertúbulo (Adam et al., 2011, 2012). A suplementação com ácido ascórbico no grupo controle aumentou significativamente o percentual de túnica própria, que na análise ultraestrutural revelou aumento de fibras colágenas que descaracterizaram a integridade da lâmina basal, possivelmente decorrente da participação crucial do ácido ascórbico na síntese de colágeno (Khalid et al., 2004). No entanto, nos distróficos suplementados não foi observado esse aumento no percentual da túnica própria, entretanto, verificou-se comportamento semelhante das fibras colágenas na MET. Esses achados ultraestruturais foram semelhantes ao descrito na literatura para ratos tratados com nicotina e segundo Aydos et al. (2001) podem prejudicar a progressão normal da espermatogênese.

O percentual de lúmen foi reduzido pela distrofia e pode ocasionar uma restrição parcial do refluxo de fluido testicular (Russell et al., 1989b). O lúmen está diretamente relacionado ao diâmetro tubular, um indicador da atividade espermatogênica testicular (Attal et al., 1963; Sinha-

Hikim et al., 1988; França & Cardoso, 1998). Os valores encontrados para o diâmetro tubular em todos os grupos desse trabalho estavam abaixo do descrito para a maioria dos amniotas, 180-300µm (Roosen-Runge, 1977). Porém, de acordo com Roosen-Runge (1961) os ratos adultos possuem redução do diâmetro tubular ao logo da rede testicular, podendo alcançar valor igual ou menor a 100µm. Dessa forma, nesse trabalho o diâmetro tubular em distróficos comportou-se de forma semelhante aos animais dos grupos controle, e a suplementação não afetou significativamente essa variável em distróficos, assim como em ratos após a suplementação com extratos vegetais de

Tynnanthus fasciculatus (Melo et al., 2010).

O diâmetro tubular ao longo de todo o testículo de ratos pode sofrer diferenças significativas em virtude das variações ao longo do ciclo do epitélio seminífero, estando relacionado com o aumento do lúmen tubular que antecede a espermiação (Wing & Christensen, 1982). Logo, medir a altura do epitélio seminífero é uma ferramenta que permite investigar efetivamente as variações da produção espermática ao longo do ciclo do epitélio seminífero, uma vez que o epitélio seminífero reflete diretamente o processo espermatogênico (Azevedo et al., 2006). Apesar de não apresentar variação significativa a altura do epitélio dos grupos estudados foi abaixo da média encontrada para animais domésticos, 60-100µm (França & Russell, 1998). Contudo, é possível que ocorra redução da altura do epitélio sem alterar severamente o processo espermatogênico (França et al., 2000).

A distrofia em animais pré-púberes elevou o comprimento tubular por testículo a valores superiores ao descrito para ratos Sprague-Dawley adultos com 21,8±0,6 metros de túbulo seminífero (Ghosh et al., 1992). Isso também foi observado no comprimento tubular por grama de testículo, um parâmetro produtivo, logo é provável que a morfologia testicular da distrofia tenha se preparado para a produção espermática na pré-puberdade, mas fisiologicamente a puberdade precoce não acontece. Já que os pacientes portadores da DMD possuem puberdade tardia decorrente do número de doenças crônicas associadas, problemas nutricionais secundários ou aumento da demanda energética (Ezri et al., 2012).

O epitélio seminífero é constituído por células germinativas e somáticas organizadas em 8 estádios celulares de acordo com o método da morfometria tubular (Berndtson, 1977; Russell et al., 1990). Através dessa organização é possível obter o CES, uma ferramenta utilizada para compreender a espermatogênese e identificar possíveis erros (Russell et al., 1990). Além disso, a análise da frequência relativa do CES é fundamental para determinar a duração de cada estádio, sendo os estádios menos frequentes aqueles de curta duração, enquanto os estádios mais frequentes são aqueles de maior duração (França et al., 1998; Costa et al., 2011). Nesse trabalho a distrofia apresentou 8 estádios, sendo o estádio 8 o mais frequente, e o 4 o menos frequente. Resultados

semelhantes foram encontrados para outras espécies de roedores (Melo et al., 2013; Morais et al., 2014b). O processo espermatogênico pode ser divido nas fases pré-meiótica, meiótica e pós- meiótica e, para fins de análise comparativa, as frequências são agrupadas e distribuídas entre as fases (Courot et al., 1970). Assim como descrito para outros roedores, a fase pós-meiótica foi a mais representativa do ciclo nesse trabalho, implicando em alta diferenciação celular no estádio 8 (Morais et al. 2014b). A distribuição das fases nos grupos estudados foi semelhante, contudo foi possível observar que o estádio 8 no controle pré-púbere e sua ausência no grupo distrófico de 30 dias de idade. Esse estádio é caracterizado pela presença de espermatozoides no lúmen, confirmando a baixa atividade espermatogênica no período pré-púbere de animais distróficos.

Ao longo do ciclo do epitélio seminífero os estádios possuem diferentes linhagens celulares que ao serem quantificadas permitem a análise funcional do parênquima testicular e estimam a produção espermática (França, 1991). Ainda que a distrofia não tenha alterado a morfometria das células do epitélio seminífero durante a puberdade, ocorreu aumento do rendimento geral da espermatogênese, mas possivelmente prejudicou a espermiogênese. Isso pode ser decorrente da redução da frequência do estádio 8 em distróficos púberes quando comparado ao controle de mesma idade, visto que é nesse estádio que encontramos espermátides alongadas prontas para a espermiação no lúmen, e que não são avaliadas quantitativamente pelo rendimento geral da espermatogênese. Dessa forma, pode haver implicações na qualidade seminal em distróficos. De acordo com Hernández-González et al. (2005) camundongos distróficos mutantes, que não expressam produtos do gene da distrofina, possuíram alteração morfológica flagelar, causando redução progressiva da motilidade espermática, na ausência da proteína Dp71, uma isoforma da proteína distrofina de baixo peso molecular. Todavia, segundo Peres et al. (2014) cães distróficos Golden Retriever apresentam volume de ejaculação, concentração espermática, motilidade e morfologia espermática dentro dos padrões normais, mas é possível que ocorra teratozoospermia (mais de 20% dos espermatozoides totais com anormalidades) e redução do volume seminal decorrente da ineficiente contração do músculo prostático. Dessa forma, apesar da morfometria favorecer o aumento do rendimento da espermatogênese, a qualidade seminal dependerá da gravidade da DMD.

Além das células germinativas, o número de células de Sertoli é um fator determinante da capacidade espermática e do tamanho testicular em mamíferos, visto que são reguladoras da espermatogênese (Orth et al., 1988; Hess et al., 1993; Weinbauer et al., 2010). Além disso, cada célula de Sertoli é capaz de suportar um número de células germinativas, conhecido como índice da célula de Sertoli (Russell & Peterson, 1984). Apesar de não haver alteração nos índices de célula de Sertoli, os animais distróficos pré-púberes apresentaram vacuolizações nessas células. Esse achado

antecede as alterações nas células do epitélio germinativo, sendo considerado por alguns autores como o primeiro sinal morfológico dos danos tubulares e que acontece em virtude de dilatações no retículo endoplasmático (Creasy, 2001; Boekelheide, 2005). O aumento da densidade de volume de células positivas para caspase-3, nos túbulos dos animais distróficos, pode está relacionada com as alterações das células de Sertoli e consequentemente maior apoptose do epitélio germinativo nesses animais.

As mitocôndrias testiculares modificam sua morfologia, localização e metabolismo ao longo da espermatogênese (Ramalho-Santos et al., 2009). Segundo De Martino et al. (1979) as mitocôndrias se classificam em três tipos: tipo ortodoxa predominam em células de Sertoli, espermatogônias e em espermatócitos pré-leptóteno/leptóteno; tipo intermediária em espermatócito em zigóteno; e o tipo condensada em espermatócito em paquíteno e espermátides. Contudo, as células de Sertoli podem alterar a morfologia de suas mitocôndrias através da liberação de fatores. A liberação de Activina A pelas células de Sertoli induz a mudança para a forma condensada, a fim de aumentar a eficiência metabólica e contribuir para a regulação da diferenciação de células germinativas (Meinhardt et al., 2000). Dessa forma, a distrofia alterou a morfologia mitocondrial no período púbere para o tipo condensada para melhorar o metabolismo energético de forma compensatória.

A ativação da apoptose pela via de caspase-3 em distróficos foi semelhante ao controle. Logo, é possível afirmar que ocorreu apoptose fisiológica, visto que esse evento é necessário para manter a homeostasia das proporções de células de Sertoli e de células germinativas durante a primeira onda da espermatogênese (Rodriguez et al., 1997; Pentikäinen et al., 2003). A apoptose durante esse período pode ser elevada pela redução dos níveis de FSH, e inibida pelo aumento de testosterona (Rodriguez et al., 1997; Jahnukainen et al., 2004). A concentração utilizada na suplementação com ácido ascórbico para o grupo controle não foi suficiente para reduzir a apoptose fisiológica na puberdade, visto que a apoptose via caspase-3 em espermatogônia A e espermatócito em paquíteno é um controle preventivo da produção exacerbada de gametas, durante a primeira onda da espermatogênese na puberdade (Jahnukainen et al., 2004). Contudo, em distróficos suplementados houve uma redução na Vv de células positivas para caspase-3. Portanto a suplementação atuou reduzindo o estresse oxidativo na região basal do compartimento tubular, uma vez que o tratamento com antioxidantes como a vitamina E, o ácido ascórbico e o selênio atuam na apoptose desencadeada pela via das caspases (Koyuturk et al., 2006).

Com isso é possível inferir que a Distrofia Muscular de Duchenne afeta alguns parâmetros da morfologia testicular e, consequentemente, o processo da espermatogênese ainda no período pré-

púbere do indivíduo, mas não impede a reprodução. Além disso, a concentração de ácido ascórbico utilizada foi eficaz para reverter os processos apoptóticos na região basal do compartimento tubular em camundongos distróficos.

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