Material e métodos

2.1. Animais

Foram utilizados 24 camundongos machos, sendo 12 da linhagem C57BL/10 (animais controle) e 12 da linhagem C57BL/10Mdx (animais distróficos), provenientes do Biotério da FIOCRUZ/ Rio de Janeiro e do Biotério do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo/ICB – USP, respectivamente. O projeto foi aprovado pelo comitê de ética do ICB/USP e chancelado pelo CEUA/UFRN (Parecer nº 164/2011 CEUA/ICB/USP e Parecer nº 064/2013

CEUA/UFRN) (Anexo A-B). Os animais foram divididos em seis grupos com 4 animais em

cada: Grupo controle com 30 dias de idade (C30); Grupo distrófico com 30 dias de idade (D30); Grupo controle com 60 dias de idade (C60); Grupo distrófico com 60 dias de idade (D60); Grupo controle com 60 dias de idade suplementado com ácido ascórbico (CS60) e Grupo distrófico com 60 dias de idade suplementado com ácido ascórbico (DS60). Os animais foram mantidos no Biotério do Departamento de Anatomia, ICB/USP, em caixas de polietileno, contendo bebedouro (água) e comedouro (ração), sob temperatura controlada de aproximadamente 22ºC e iluminação com ciclo de 12 horas claro/escuro.

2.2. Dieta suplementar com ácido ascórbico

Após o desmame (21 dias de idade), os animais receberam ração comercial para roedores Nuvilab® (Nuvital, São Paulo, Brasil). A partir dos 30 dias de idade os animais dos grupos suplementados com ácido ascórbico (CS60 e DS60) receberam diariamente 0,005g de ácido ascórbico (Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA) por quilograma do animal, diluído em água e administrado por meio de gavagem. A concentração foi calculada com base no protocolo estabelecido na literatura (Guido et al., 2010; Tonon et al., 2012).

2.3. Eutanásia e coleta do material

Os animais foram eutanasiados em câmara de dióxido de carbono hermeticamente fechada, com entrada de gás na parte superior. Após a eutanásia, os animais foram pesados e os testículos coletados para serem pesados, seccionados transversalmente e imersos em solução fixadora de

acordo com a técnica histológica a ser empregada: Karnovsky para morfometria testicular sob microscopia de luz e análise ultraestrutural sob microscopia eletrônica de transmissão, e Paraformaldeído 4% em solução tampão de PBS para os procedimentos de imunohistoquímica (Karnovsky, 1965; Oliveira, 2004; Morais et al., 2014a).

2.4. Processamento histológico

Após fixação em Karnovsky por 24h, os fragmentos testiculares destinados à morfometria foram transferidos para álcool 70%. Os fragmentos foram desidratados em concentrações crescentes de álcool etílico, para posterior inclusão em glicol-metacrilato (Historesin®, Leica Mycrosistems, Heidelberg, Alemanha). O material foi seccionado a 3µm de espessura através da técnica semi- seriada com micrótomo rotativo Leica RM2255 (Leica Microsystems, Heidelberg, Alemanha), com intervalo de 40µm entre os cortes, e as lâminas histológicas destinadas à morfometria foram coradas com azul de toluidina/borato de sódio 1% (Morais et al., 2014a). As lâminas permanentes confeccionadas foram observadas ao microscópio de luz Motic BA410 (Motic, Causeway Bay, Hong Kong) e microfotogradas para análises e comparações com câmera digital Moticam 5.0 MP (Motic Instruments Inc, Richmond, Canada). As imagens foram analisadas ao software Image-Pro Plus®(Media Cybernetics Inc., Rochville, USA).

2.5. Estereologia testicular

As análises morfométricas foram realizadas de acordo com os protocolos propostos por Morais et al. (2014a). As proporções volumétricas entre túbulos seminíferos e intertúbulo foram estimadas pela contagem de 266 pontos projetados sobre 10 imagens obtidas das preparações histológicas de cada animal, em objetiva de 10x, para quantificar os túbulos seminíferos, intertúbulo, túnica própria, epitélio seminífero e lúmen. Já o volume dos túbulos seminíferos foi estimado a partir do percentual ocupado pelos mesmos no testículo e do volume do parênquima testicular (Vol. Túbulo = peso gonadal líquido x Túbulo %/ 100). O volume do epitélio seminífero foi o produto do percentual do epitélio seminífero com o volume do parênquima testicular, dividido por 100. O peso da túnica albugínea foi estimado a partir da densidade de volume pela contagem de 266 pontos projetados sobre 10 imagens obtidas das preparações histológicas de cada animal, em objetiva de 10x (Vv = No de pontos contados sobre a túnica albugínea / Total de pontos contados x 100). O volume absoluto da albugínea foi resultado do produto da densidade de volume com o volume testicular, levando-se em consideração que a densidade testicular em mamíferos é aproximadamente 1 (Johnson et al., 1981; Sprando et al., 1998; Costa et al., 2011).

O índice tubulossomático (ITS) foi obtido através da divisão do volume tubular pelo peso corporal multiplicado, por 100. Já o índice gonadossomático (IGS) foi obtido como quociente da

divisão do peso dos testículos pelo peso corporal, sendo o valor, multiplicado por 100. O diâmetro dos túbulos seminíferos e altura do epitélio seminífero (mensurada da túnica própria até o lúmen tubular) foram obtidos pela mensuração de 20 secções transversais de túbulos/animal, escolhendo- se os túbulos que apresentaram contorno o mais circular possível.

O comprimento dos túbulos seminíferos (CT), em metros, foi estimado a partir da fórmula CT = VTS/πR2_{, onde VTS é o volume dos túbulos seminíferos, πR}2 _{é a área da secção transversal} dos túbulos seminíferos, e R é o diâmetro tubular/2. O CT por grama de testículo foi obtido dividindo-se este valor pelo peso gonadal.

2.6. Frequência relativa dos estádios do ciclo do epitélio seminífero

Os estádios que compõem o ciclo do epitélio seminífero (CES) foram descritos utilizando-se o método de morfologia tubular (Berndtson, 1977). A frequência relativa de cada estádio foi descrita pela caracterização e contagem de 50 túbulos por animal em secções transversal de forma randomizada.

2.7. Quantificação da espermatogênese

Quantificou-se a população de cada tipo celular encontrada no estádio 8 do CES, através da contagem dos núcleos das células germinativas e do nucléolo das células de Sertoli. Foram utilizadas 10 secções transversais circulares de túbulos seminíferos por animal para, então, mensurar os diâmetros nucleares de espermatogônias do tipo A (A), espermatócitos primários na transição pré-leptótenos para leptóteno (PL-L), espermatócitos primários em paquíteno (PQ), espermátides arredondadas (Ar) e nucléolos de células de Sertoli (Se) (Russell et al., 1990). As contagens foram corrigidas de acordo com a espessura do corte histológico e o diâmetro nuclear ou nucleolar das células germinativas e células de Sertoli, respectivamente, de acordo com o método de Abercrombie (1946) modificado por Amann & Almquist (1962).

A partir desses dados o índice das células de Sertoli foi obtido com a finalidade de indicar a capacidade de suporte dessas células por total de células germinativas. Esse índice foi determinado através do resultado da razão entre os números corrigidos de células germinativas e o número corrigido de células de Sertoli, utilizando-se a fórmula: (A+PL-L+PQ+Ar) / Se. Os índices mitótico (PL-L / A), meiótico (Ar / PQ) e o rendimento geral da espermatogênese (Ar / A) também foram quantificados.

2.8. Análise da ultraestrutura

Após fixação em solução de Karnovsky por 24h, os fragmentos testiculares foram submetidos à microscopia eletrônica de transmissão (MET). Os fragmentos foram imersos em

glutaraldeído a 2,5%, tamponado com fosfato de sódio a 0,1M, pH 7,4. Após a fixação o material foi lavado três vezes durante 10 minutos cada no mesmo tampão. Em seguida ocorreu a pós-fixação com tetróxido de ósmio tamponado a 2% por duas horas (tamponado em fosfato de sódio 0,1M e a pH 7,4). Os fragmentos foram lavados com solução tampão por três vezes durante dez minutos cada. Após esse procedimento o material foi imerso em acetato de uranila a 3% overnight, lavado com tampão fosfato e desidratado com série crescente de álcool etílico (50-100%) durante 10 minutos em cada.

Após desidratação, os fragmentos foram imersos em óxido de propileno por 10 minutos para garantir total desidratação do tecido. Em seguida o material foi embebido em resina araldite 502 (Polysciences Inc, California, EUA), para a confecção dos blocos. Foram então obtidos cortes semi- finos com ultramicrótomo, os quais foram corados com solução aquosa de azul de toluidina a 1% para a identificação dos locais para a realização de cortes ultrafinos. Cortes de 70nm de espessura foram confeccionados com navalha de diamante e colocados em telas de cobre com 200 mesh para posterior contraste com acetato de uranila saturado a 2%, por sete a dez minutos e o citrato de chumbo a 0,5%, durante o mesmo período. O material foi analisado em Microscópio Eletrônico de Transmissão (Jeol® 100 CX II, Tóquio, Japão).

2.9. Imunohistoquímica para caspase-3

Para identificar células em apoptose no interior dos túbulos seminíferos foi utilizada a técnica de imunohistoquímica para marcação da caspase-3. Os cortes foram desparafinizados em uma estufa a 60°C durante 30 minutos e colocados em xilol por 5 minutos, reidratados em concentrações decrescentes de álcool etílico (100%, 90%, 70% e 50%) e lavados em água destilada. Para desmascarar os epítopos, a recuperação antigênica foi realizada com solução de citrato de sódio 10 mM (pH 6,0 95°). Esta recuperação foi realizada em panela de pressão de micro-ondas com potência máxima de 750W, em dois ciclos de 5 minutos. Em seguida as amostras foram arrefecidas até a temperatura ambiente e lavadas com água destilada. O bloqueio da peroxidase endógena foi realizado com peróxido de hidrogênio 0,9%, seguindo-se a lavagem com água destilada e solução salina tamponada com fosfato de sódio (PBS, pH 7,4). O anticorpo primário anti-caspase 3 (diluição 1: 400, Abcam, Cambridge, Inglaterra) foi incubado durante a noite (12h). Em seguida, os antígenos imunomarcados foram visualizados através do sistema Dako Envision+ (Dako, Carpinteria, EUA), usando 3'3-tetra-hidrocloreto de diaminobenzidina (DAB) como cromógeno. As seções foram finalmente contrastadas com hematoxilina de Harry e montadas para análise em microscopia de luz.

2.10. Densidade de Volume (Vv) das células caspase 3 - positivas

A densidade de volume (Vv) refere-se a fração de volume ocupada pelas células caspase 3- positivas no respectivo espaço referência, ou seja, o testículo. Para a estimativa de Vv foram obtidos 3 campos por animal e aplicado um sistema teste sobre o espaço referência. Foram contados o número total de pontos que tocam as células de interesse (Pint) os quais foram divididos pelo número total de pontos sobre o espaço referência (Pref) (Ladd et al., 2012).

2.11. Análise estatística

Os parâmetros testiculares quantitativos foram expressos em média ± desvio padrão. Estes foram submetidos à análise de variância (ANOVA) e teste de múltiplas comparações de Kruskall- Wallis, seguido do teste de Mann-Whitney com correção de Bonferroni, utilizando-se o software PAST® versão 2.17 (Hammer et al., 2001). Admitiu-se o nível de significância de P<0,05.