No presente estudo, foi descrito o principal perfil do plasma seminal de coelhos adultos, criados em região tropical. A abordagem utilizada foi a eletroforese bidimensional juntamente com a análise computadorizada dos mapas eletroforéticos e a identificação dos spots proteícos através da técnica de espectrometia de massa, o que permitiu identificar 90 proteínas diferentes. Além disso, os parâmetros seminais avaliados, tais como vigor, número de células viáveis, morfologia espermática e células com membranas funcionais foram associados com proteínas específicas. De acordo com a literatura, este representa o primeiro relato sobre o proteoma do plasma seminal de coelhos e seu papel sobre os parâmetros seminais.
Grupo das principais proteínas do plasma seminal de coelhos
As proteínas mais abundantes identificadas no plasma seminal de coelhos foram Zeta-globina (19,41 %), lipocalinas (13,02 %), anexinas (12,34 %), FAM115 protein (12,90 %) e albumina (6,49 %).
A Zeta-globina foi recentemente demonstrada no plasma seminal de catetos (Pecari tajacu) (Santos et al., 2014). Outas proteínas pertencentes à família das globinas já foram relatadas em fluídos seminais de outras espécies, como por exemplo, a hemoglobina B no fluído epididimal de touros (Belleannée et al., 2011a). Como toda
hemoglobina, a zeta-globina atua no transporte de oxigênio e liga-se ao ferro (He e Russel, 2004; Yonetani e Kanaori, 2013), entretanto, sua função na reprodução do macho ainda é desconhecida.
Uma outra proteína encontrada em grande concentração no sêmen de coelho foi a lipocalina. As lipocalinas são principalmente secretadas pelos testículos e epidídimo, onde podem transportar testeosterona e ácido retinóico (Tokugawa et al., 1998; Gerena et al., 2000; Rodriguez-Martinez et al., 2009; Belleannée et al., 2011b ). De acordo com Fouchécourt et al. (2002), a sua expressão localizada nos testículos e epidídimo podem apoiar uma possível função sobre a maturação espermática e espermatogênese. No
entanto, as lipocalinas tem sido associadas principalmente com a fertilidade em mamíferos (Killian et al., 1993; Diamandis et al., 1999). Um exemplo é a lipocalina prostaglandin D synthase, presente no plasma seminal de bovinos que desempenha papel durante a fertilização in vitro (Gonçalves et al., 2008). No presente estudo foram identificadas as seguintes lipocalinas: allergen Fel d 4-like, odorant-binding protein 3 (OBP3) e a lipocalina allergen Ory c 4 precursor. As OBPs podem ser encontradas na mucosa nasal, pele e urina de coelhos (Garibotti et al., 1997; Baker et al., 2001). A OBP3 foi recentemente identificada em orgãos não sensoriais, foi expressa na próstata e encontrada no plasma seminal de coelhos, onde foi considerada um possível feromônio (Mastrogiacomo et al., 2014).
As anexinas ANX1, ANX3, ANX4, ANX5 e ANX6 também foram identificadas no plasma seminal da espécie. Tais proteínas foram expressas em 21 spots com peso molecular e valores de pontos isoelétricos diferentes, representando 12,34 % das proteínas detectadas nos géis bidimensionais. As anexinas são proteínas de ligação- fosfolipídica dependendente de cálcio que apresentam como papéis na transdução de sinal, fusão de membrana, exocitose, processos anti-inflamatório e de anti-coagulação (Romisch e Pâques, 1991). Diferem entre si quanto à sensibilidade ao cálcio e especificidade do grupo fosfolipídico e apresentam como propriedade uma auto- associação entre ANXs pela interação proteína-proteína capaz de facilitara atividade de ligação de uma ANX com baixa afinidade fosfolipídica a um determinado tipo de
membrana (Gerke e Moss, 2002). O exemplo disso é a ANX 1 que apresenta um NH2 terminal que se liga a um segundo elemento quando a mesma está ligada a ANX 5. As ANX 2 e ANX 6 também apresentam a mesma função da ANX 1, ou seja, facilitam a ligação da ANX 5 em membranas com baixa afinidade fosfolipídica com essa isoforma. ANX 5, em humanos, atua protegendo a funcionalidade da membrana espermática e a integridade do DNA contra o estresse oxidativo (Lu et al., 2011). Além disso, devido à sua habilidade em se ligar à fosfatidilserina da membrana plasmática, uma característica ligada a membrana qunado a célula entra em apoptose, vem sendo usada como marcador de células inviáveis em ensaios com espermatozoides (Said et al., 2006; Almeida et al., 2009). A ANX 5 já foi previamente identificada no plasma seminal de coelhos (Arruda-Alencar et al., 2012). Em coelhos, a ANX 5 foi descrita como um possível fator de decapacitação (Okabe et al., 1993). Estudos posteriores realizados por Castellini et al. (2013), observaram que espermatozoides lavados e incubados inicialmente em solução capacitante tiveram a decapacitação restaurada após a adição de PS ao meio de cultura, constatando o assim, o seu efeito inibitório sobre a capacitação. Porém, essas informações são importantes uma vez que está espécie é de ovulação reflexa, ou seja, a ovulação é induzida pela cópula, e os espermatozoides permanecem durante um longo período no trato reprodutivo da fêmea até que ocorra a fertilização. Uma capacitação prematura diminuiria a viabilidade espermática e a eficiência reprodutiva (Giojalas et al., 2004). Portanto, é importante mencionar que a atividade decapacitante e de proteção dos espermatozoides são atributos da proteína mais abundante no plasma seminal dos coelhos.
A albumina já foi descrita como componente do plasma seminal de coelhos (Kirchner e Schroer, 1976) e que a sua presença influência positivamente na motilidade espermática (Muller e Kirchner, 1978). Okab (2007), estudando raça Nova Zelândia Branca criada em clima temperado, constatou que as concentrações de proteínas totais, albumina e globulina no plasma seminal são influenciadas pela estação do ano. As maiores concentrações desses metabólitos foram encontradas no verão, enquanto que na primavera foram observadas as menores concentrações, sugerindo portanto, que a
qualidade do sêmen é melhor no verão devido ao aumento da concentração dessas proteínas na sua composição (Strezezek, 1985; Okab, 2007). Elzanaty et al. (2007), ao estudar o plasma seminal de humanos, demonstraram existir uma correlação positiva entre a albumina e o percentual de espermatozoides morfologicamente normais, porém sem nenhuma associação com a motilidade.
A proteína FAM 115 correspondeu a 12,90 % das proteínas identificadas, sendo observadas duas isoformas, a FAM115C e FAM115E. A FAM115C, também previamente estudada como TCAF 2, é formada por 845 aminoácidos e seu alinhamento com a proteina FAM 115E (TCAF 3) é de 57 %, com semelhança entre as mesmas de 66 %, sugerindo uma origem comum, portanto pertencem ao mesmo grupo de genes (Gkika et al., 2015). Segundo o referido autor, tal proteína pertencente à família de canais de receptores transientes de potencial (TRP). Os TRPs compõem a família de canais de cátions envolvidos em diversos processos fisiológicos com expressàao em quase todos os tipos de células, dentre estas, células do trato reprodutivo (Clapham, 2003). Segundo análise in silico (String), onde foi feito o interactoma da FAM115E, foi visto que esta proteína apresenta associações com a proteína transglutaminase 4, expressa na próstata, que atua na formação do coágulo seminal em Mus musculus, fato este que também pode ser observado no ejaculado de coelhos (Oryctolagus cuniculus).
Associações entre as proteínas do plasma seminal e os parâmetros seminais
O presente estudo apresenta uma série de associações significativas entre as proteínas identificadas no plasma seminal e os parâmetros seminais. Associações significativas também foram descritas em outras espécies, tais como ovinos (Rodrigues et al., 2013) e suínos (González Cadavid et al., 2014). No entanto, este é o primeiro estudo que descreve tais associações em coelhos, no qual foi confirmado pela primeira vez a presença da proteína fator de crescimento do nervo (NGF) no plasma seminal dessa espécie e também a sua associação com a motilidade. A NGF foi identificada no plasma seminal de outras espécies, tais como: bovinos (Haper et al., 1982), suínos (Kershaw-Young et al., 2012), humanos (Kumar et al., 2013), camelos, llamas e alpacas
(Druart et al., 2013), bem como o seu receptor TrakA, que foi observado na cabeça e na cauda do epidídimo de bovinos (Li et al., 2010). A NGF é uma neurotrofina e como tal, exerce um papel essencial na sobrevivência, desenvolvimento e diferenciação de neurônios no sistema nervoso central e periférico (Levi-Montalcini, 1987). Atualmente, diversos estudos tem sugerido uma possível influência sobre a função reprodutiva de machos e fêmeas (Li e Zhoun, 2013; Bao et al., 2014). Testes realizados in vitro demostraram que em machos, influencia a função espermática, atuando na motilidade espermática e a reação acrossômica através da via MAPK (Jin et al., 2010).
Nesse trabalho, a NGF associou-se positivamente com motilidade espermática, estando de acordo com os estudos realizados em humanos. Lin et al. (2014), em seus estudos demonstraram que a motilidade espermática sofreu um incremento após a incubação com uma solução contendo 0,1 µM de NGF por 30 minutos. Além de influenciar a função espermática, pesquisas recentes sugerem que a NGF funcione, em lhamas e alpacas (espécies consideradas de ovulação induzida), como um fator de indução a ovulação (Adams et al., 2005; Kershaw-Young et al., 2012). Em coelhos, a existência de um fator de indução a ovulação já foi detectado no plasma seminal, porém não foi ainda identificado (Silva et al., 2011). Até o presente momento, não existem estudos consistentes de que a NGF induza a ovulação na espécie cunícula, sendo este o primeiro relato sobre o seu papel sobre a função espermática de coelhos.
Outras proteínas também influenciaram a motilidade espermática, a cysteine-rich secretory protein 1, positivamente, e a galectina - 1, negativamente. A cysteine - rich secretory protein 1 (CRISP-1) é uma glicoproteína expressa no epitélio do epidídimo em humanos e ratos (Kratzschmar et al. 1995; Schwidetzky et al., 1997) e sua função tem sido atribuída a eventos ligados à capacitação espermática e fertilização (Schwidetzky et al., 1997; Robert et al., 2003; Cohen et al., 2011). Em ratos, foram identificadas duas isoformas D e E, ambas ligam-se na surperfície do espermatozoide durante o processo de maturação que ocorre durante o trânsito epididimário, na presença de zinco (Maldera et al., 2011). Diferem, porém, no tipo de função e interação com o espermatozoide (Roberts et al., 2007). A proteína D se liga fracamente ao
espermatozoide, sendo liberada para o meio através de uma força iônica durante o processo de capacitação espérmatica. Estudos demonstraram que a Proteína D é um fator decapacitante e atua na regulação da ação da tyrosine phosphorylation e da progesterona, sendo liberada para o meio após o início da reação acrossômica (Roberts et al., 2003). Enquanto que a Proteína E, permanece ligada ao espermatozoide, porém, durante o processo de capacitação, migra para a região equatorial e juntamente com a CRISP 2 irá participarar nos eventos iniciais da interação espermatozoide com a zona pelúcida.
Em humanos, a CRISP-1 vem sendo estudada como um potencial biomarcador para o diagnóstico de azoospermia obstrutiva, uma vez que é um componente do plasma seminal. Pesquisas realizadas em pacientes diagnosticados com azoospermia obstrutiva, detectaram que os níveis de CRISP - 1 eram baixos ou mesmo inexistentes, em contraste com os pacientes diagnosticados com azoospermia não obstrutiva, em que a sua concentração era alta (Légare et al., 2013). Entretanto, a sua associação com a motilidade espermática, até o presente momento não foi descrita nenhuma associação com tal parâmetro espermático, sendo esse, o primeiro relato da associação da CRISP-1 com a motilidade espermática.
A galetin 1 já foi identificada em testículos de humanos e ratos (Wollina et al., 1999; Dettin et al., 2003). As galectinas pertecem à uma família de proteínas de ligação a carboidratos -galactosides (Camby et al., 2006) e estudos têm sugerido que sua função está relacionada a processos imunossupressores e antinflamatórios (Leffler et al., 2004). Dettin et al. (2003), ao estudar a expressão da GAL-1 em testículos de ratos, observaram uma estreita correlação dessa proteína com a espermatogênese, pois a sua expressão estava ligada a fases específicas de desenvolvimento. Os referidos autores identificaram a sua expressão nas células de Sertoli a partir dos 45 dias de vida, bem como a sua presença nas espermátides alongadas e em espermatozoides, nas regiões da cabeça e da cauda, sugerindo um potencial papel na tolerância imunológica, não somente no momento da ejaculação como também no trato reprodutivo da fêmea, porém os mecanismos pelos quais esses
processos ocorrem ainda não foram completamente elucidados. Nesse estudo, a função da GAL-1 parece relacionar-se ao sistema imunológico, uma vez que foram observadas associações negativas com o percentual de espermatozoides móveis defeituosos.
A presença de espermatozoides com membranas íntegras (HOST) foi associada a duas proteínas, a FAM 115 (complex), descrita anteriormente e a tropomiosina. Estudos recentes conduzidos por Gkika et al. (2015), sugerem que a função da FAM 115 está relacionada a regulação da TRPM8 (transient receptor potencial melastatin 8). Estes receptores (TRP) atuam em resposta a variações de temperatura regulando funções fisiológicas, tais como, absorção de Ca 2+, osmolaridade, vasodilatação, pH e apoptose (Gkika et al., 2015). É expressa em tecidos que não apresentam influencia de oscilações ambientais, tais como a próstata, onde foi identificada uma correlação positiva com o câncer (Tsavaler et al., 2001). No presente trabalho, foram observadas associações positivas da FAM115 com a integridade de membrana dos espermatozoides. Este parece ser o primeiro relato da associação da FAM115 com parâmetros espermáticos.
As tropomiosinas (Tms) são componentes altamente conservados dos filamentos de actina que regulam a estabilidade e a função desses filamentos (Cooper, 2002; Hook et al., 2011), enquanto que a desestabilização é promovida pela Cofilin-1, proteína também identificada no plasma seminal de coelhos. Diversas funções celulares, tais como divisão celular, tráfico celular e a motilidade são reguladas diretamente pelo citoesqueleto que contém a actina como uma de suas principais proteínas (Cooper, 1991). Diversos autores têm descrito a actina como um componente da membrana do espermatozoide (Clark et al., 1982) e a sua associação com a regulação da motilidade (Breitbart et al., 2005). Devido à interação existente entre as proteínas actina e tropomiosina, Hook et al. (2011) sugeriram que a Tm seria um potencial regulador dos filamentos de actina na função espermática. No presente trabalho, a tropomiosina apresentou associações positivas com os espermatozoides com membrana íntegra, estando de acordo com os dados demostrados na literatura. A tropomiosina atua no
controle da regulação da estabilidade e da dinâmica dos filamentos de actina, conservando assim, a integridade das membranas espermáticas.
No que se refere ao percentual de espermatozoides normais, foram encontradas associações negativas desse parâmetro com a proteína isocitrato desidrogenase (ICDH) e positiva com a proteína carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecules 6 - like (CEACAM6).
A isocitrato desidrogenase (ICDH) é uma enzima ligada ao metabolismo energético do espermatozoide e participa do ciclo do ácido cítrico. A presença da ICDH de origem citoplasmática dentro do plasma seminal pode ser devido à presença de anormalidades espermáticas que poderia resultar no extravasamento do seu conteúdo para o meio externo. Tal fato poderia justificar a associação negativa da ICDH com o percentual de espermatozoides normais presentes no ejaculado. Kawase et al. (2015) relataram a presença ICDH como componente da matriz da membrana de espermatozoides em cervos, o que apoia esta hipótese. A isocitrato desidrogenase foi identificada como componente dos prostassomas em humanos (Utleg et al., 2003) e é possível que também seja componente dos prostassomas de coelhos.
A proteína carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecules 6 - like (CEACAM6) presente no plasma seminal de coelhos apresentou associações positivas com o percentual de espermatozoides normais e associações negativas com o percentual de espermatozoides com defeito na peça intermediária. Outras proteínas pertencentes à família das CEA's (carcinoembryonic antigen-related) foram identificadas no plasma seminal de outras espécies, tais como ratos (Li et al., 2005) e humanos (Krause, 1980; Lizana et al., 1982). Em humanos observou-se correlação positiva com a concentração espermática, porém sem nenhuma associação com os parâmetros de motilidade e morfologia espermática. Já em ratos, a sua função parece estar ligada à motilidade, pois espermatozoides epididimários incubados com a CEACAM10 obtiveram uma melhora significativa na sua mobilidade, independente do tempo em que permaneceram no meio de cultura. A CEACAM 10, em ratos, liga-se ao espermatozoide no momento da ejaculação e a sua maior concentração tendo sido observado na região da peça
intermediária. Nixon et al. (2010) descreveram a presença da CEACAM6 em espermatozoides de humanos, marcadamente na região da cabeça. Em ratos, a CEACAM6 foi expressa nas células de Sertoli e sua produção parece ser independente da existência de células germinativas, embora também tenha sido identificada em espermatócitos e espermátides, sugerindo uma possível expressão nas células germinativas. Os estudos sugeriram que a CEACAM6 tem como função a adesão entre as células germinativas e as células de Sertoli, quer seja por interações homotípicas ou heterotípicas (Kurio et al., 2008). A presença da CEACAM6 no plasma seminal da espécie cunícula está sendo descrita pela primeira vez neste trabalho e os achados diferiram dos resultados encontrados das espécies citadas. Outros estudos devem ser realizados para identificar o local de sua expressão em coelhos e compreender melhor o seu mecanismo de ação.
Além da CEACAM6, o percentual de espermatozoides com defeito de peça intermediária também apresentou associações com outras duas proteínas, a PMNA - like 1 e a superóxido dismutase (Cu-Zn), ambas de modo positivo.
A paraneoplastic Ma antigens (PNMA1), também conhecida como Ma 1, é uma proteína onconeural que recentemente foi identificada como alvo da imunidade associada com síndromes paraneoplásicas neurais (Schuller et al., 2005). Seus anticorpos são encontrados em pacientes com tumores neurais e testiculares. Em tecidos normais, sua expressão é restrita ao tecido cerebral e aos testículos, entretanto a sua função ainda é desconhecida (Daumal et al., 1996). Existe na literatura relatos de outras proteínas com locais de expressão restrita ao cérebro e testículos que sugerem sua participação em funções importantes, tais como a neurogênese e gametogênese (Connor et al., 1995; Martin et al., 1996). Diversos autores descreveram que a função da PMNA 1 seja de proapoptóse (Tan et al., 2001; Schuller et al., 2005). Para Sakkas et al. (1999), a apoptose durante a espermatogênese pode desempenhar um papel regulador no controle da qualidade seminal e da espermatogênese. Os referidos autores observaram também diferenças claras nos marcadores moleculares de apoptose entre homens com parâmetros seminais normais e anormais, tais como motilidade e morfologia
espermática. Neste estudo foram observadas associações da PMNA 1 com o defeito de peça intermediária em espermatozoides de coelhos, sendo este o primeiro relato sobre a influência da Ma - 1 em parâmetros seminais desta espécie. A existência de proteínas apoptóticas no ejaculado relacionadas à espermatogênese já tem sido relatada e a sua associação com defeitos na morfologia descritos. Um exemplo de uma proteína proapoptótica é a Fas, que em humanos atua ativando o mecanismo da apoptose durante a espermatogênese (Hikim et al., 1998), com concentraçãomaior em ejaculados contendo espermatozoides com defeitos de morfologia. Resultado similar encontrado nesse trabalho, embora sejam proteínas diferentes, ambas atuam desencadeando a cascata de eventos responsável pela morte celular. A presença de tais proteínas no ejaculado vem sendo explicada por Sakka et al. (1999) como resultado do processo de apoptose interrompida que ocorre durante a espermatogênese. Falhas na apoptose durante a espermatogênese podem resultar no surgimento de células defeituosas nos ejaculados devido a interrupção parcial do processo de morte celular (Sakkas et al., 2010).
Diversos estudos têm descrito a relação entre a produção de espécies reativas ao oxigênio e os parâmetros seminais (Argawal et al., 1994; Maia et al., 2004). Macanovic et al.(2015) estudando a correlação entre parâmetros seminais e a expressão de enzimas antioxidantes no plasma seminal de humanos, identificaram associações positivas da SOD (CuZn) com a motilidade espermática, no entanto, sem nenhuma associação com a morfologia, diferindo dos resultados desse trabalho, onde a superóxido dismutase (SOD) não apresentou associações com a motilidade espermática e sim, com o defeito de peça intermediária. A SOD foi identificada anteriormente em espermatozoides de coelhos e sua função descrita seria a de proteger os espermatozoides contra danos oxidativos (Holland et al., 1982). Argawal et al. (1994), constataram correlações positivas entre os níveis altos das espécies reativas a oxigênio e os parâmetros seminais de motilidade, ROS e morfologia espermática. A superóxido dismutase (SOD) é uma enzima amplamente distribuída em células aeróbicas (Fridovich, 1978) responsável pela catalisação da dismutação do O2 para H2O2 através da seguinte reação: 2O2- + 2H+
H2O2 + O2. A SOD constitui o primeiro sistema de defesa contra os danos causados pelos radicais derivados do oxigênio e a presença dessa enzima de defesa contra o estresse oxidativo no plasma seminal pode servir como um marcador de atividade de ROS produzida pelos espermatozoide defeituosos. Em humanos, a SOD vem sendo considerada como um marcador de infertilidade (Macanovic et al., 2015) e segundo Aitken et al. (1996), somente os espermatozoides que apresentam baixa atividade desta enzima podem ser considerados funcionalmente competentes. Trabalhos realizados com cães (Cassani et al., 2005) mostraram correlação negativa da SOD com o percentual de espermatozoides anormais e o vigor. Estudos afirmam que a maior parte da atividade da SOD se concentra na região da peça intermediária do espermatozoide, onde estão localizados a mitocôndria e o citoplasma residual (Aitken et al., 1996), o mesmo local que correspondeu ao defeito identificado no presente trabalho.
O percentual de espermatozoides com defeitos de cauda apresentaram associações com sete das proteínas identificadas, sendo de maneira positiva com as proteínas actina, peptidyl-prolyl cis-trans isomerase A (ciclofilina A), fosfoglicerato quinase, rab GDP dissociation inhibitor 2 - like. Enquanto que com as proteínas N (G), N (G) - dimethylarginine dimethylaminohydrolase 1 (DDAH1), proteína DJ - 1 - like e Von Willebrand factor A domain - containing protein 3 A, as associações observadas foram negativas.
A actina é umas das principais proteínas componentes do citoesqueleto presente nas células de mamíferos que desempenha um papel importante na regulação da forma da célula, migração celular e interação com a matriz celular através de transformações reversíveis entre as formas monomérica G-actina e filamentosa F-actina (Cooper, 1991). A actina já foi identificada no plasma seminal de diversas espécies, tais como: humanos (Akiyama et al., 1990), bovinos (Rego et al., 2014), ovinos (Souza et al., 2012), equinos (Druart et al., 2013) e alpacas (Druart et al., 2013). Em humanos, foi relatada a presença da actina em vários locais no espermatozoide, tais como: região equatorial, pós acrossomal e na cauda (Clark et al., 1982). Segundo Breitbart et al. (2005), a presença