7.1. Parâmetros seminais
Os parâmetros seminais avaliados encontram-se sumarizados na tabela abaixo: Tabela 1. Média ± erro padrão dos parâmetros vigor, motilidade total, concentração espermática, morfologia espermática, vitalidade espermática e integridade do acrossoma e teste de integridade de membrana espermática do sêmen de coelhos.
Parâmetros seminais Médias ± erro padrão
Vigor (0-5) 3,8 ± 0,2
Motilitidade (%) 81,0 ± 6,1
Concentração espermática (x 106/mL) 364 ± 70
Morfologia espermática (%)
Células normais 66,7 ± 2,5
Defeitos de peça intermediária 14,1 ± 1,4
Defeitos de cabeça 10,2 ± 1,5
Defeitos de cauda 8,7 ± 1,3
Gota citoplasmática 0,5 ± 0,2
Vitalidade espermática e integridade do
acrossoma (%)
Céls. vivas com acrossoma intacto 65,8 ± 2,5
Céls. vivas sem acrossoma 0,9 ± 0,2
Céls. vivas com dano no acrossoma 1,7 ± 0,4
Céls. morta com acrossoma íntegro 15,1 ± 2,1
Céls. morta sem acrossoma 11,3 ± 1,5
Céls. morta com dano no acrossoma 5,3 ± 1,0
Teste de integridade de membrana
(HOST) (%)
Acrossoma e membrana intacta 60,7 ± 8
Danos no acrossoma e membrana intacta 8,3 ± 0,9
Danos no acrossoma e na membrana 22,5 ± 2,2
Acrossoma intacto e dano na membrana 7,5 ± 13 Legenda: Céls. células
7.2. Proteínas no plasma seminal
As proteínas identificadas através da espectrometria de massa encontram-se nas tabelas 2 e 3, nos anexos. As figuras 2, 3 e 4 ilustram os mapas do agrupamento de animais utilizados na experimentação.
Em média, foram identificados 232 ± 69,5 spots (Figura 2) no plasma seminal de coelhos, dos quais 34 encontravam-se consistentemente presentes em todos os géis. Apesar desses 34 spots corresponderam a apenas 15 % do número total de spots, representaram 32 % da densidade óptica de todos os spots detectados nos mapas. Através da técnica de espectrometria de massa foi possível identificar 95 % de todos os spots detectados nos géis (220 spots em um total de 232 spots), o que correspondeu a 90 proteínas diferentes. Todas as proteínas identificadas encontram-se na tabela 2. As principais proteínas foram anexinas, zeta-globulina, lipocalinas, serpinas, aldose reductase, galectina 1, Fator de cescimento do nervo , glutationa S transferase, heat shock proteins 70 e 90 kDa, albumina, dentre outras.
Também foram encontradas proteínas com várias isoformas, tais como: FAM115 (37 spots), anexinas ANX1, ANX3, ANX4, ANX5 e ANX6 (31 spots), albumina (12 spots), zeta-globulina (12 spots), lipocalina (14 spots), glutationa S transferase (6 spots) e galectina-1 (6 spots). As proteínas mais abundantes no plasma seminal de coelhos foram: zeta-globulina (19,41 %), anexinas (17,28 %), lipocalinas (13,02 %), proteína FAM115 (12,90 %), albumina (8,92 %), calmodulina (5,78 %), galectina -1 (4,74 %), serinas (4,61 %), fator de crescimento do nervo (4,65 %) e SLC2A4 regulator (5,52 %). Este conjunto das principais proteínas representaram mais da metade de todas as proteínas identificadas no plasma seminal de coelhos.
7.3. Ontologia gênica das proteínas no plasma seminal de coelhos
As 90 proteínas identificadas no plasma seminal de coelhos participam dos seguintes processos biológicos (gráfico 1): processo celular (65,25 %), regulação (64,25 %), resposta a estímulos (22,9 %), interação com outras células ou organismos (21,8 %), processos de desenvolvimento (21,8 %), localização (15,6 %), processos imunológicos (7,3 %) e outros (20,8 %). Quanto aos componentes celulares (gráfico 2), as proteínas identificadas que são relacionadas aos processos extrecelulares representaram 74,22 %, enquanto que 25,78 % restantes são proteínas de membrana, complexos macromoleculares, proteínas de citoesqueleto e outras organelas intracelulares. No tocante a função molecular (gráfico 3), as proteínas participam das seguintes atividades: ligação (79,45 %), atividade catalítica (55,31 %), enzimas reguladoras (18,10 %), atividade de transdução molecular (7,4 %), atividade oxidante (5,3 %) and mólecula estrututral (3,2 %).
Gráfico 2 - Ontologia gênica componente celular
7. 4. Associações entre as proteínas do plasma seminal e os parâmetros seminais A tabela 2 mostra os modelos de regressão linear múltipla dos parâmetros espermáticos variando em função das intensidades das proteínas identificadas no plasma seminal de coelhos adultos, bem como seus coeficientes de determinação ajustados (R²), os valores de P para o teste F global, o critério C(p), a raiz MSE e o teste de Durbin- Watson (DW). Todos os modelos apresentaram distribuição normal dos seus resíduos de acordo com o teste Shaprio - Wilk, foram significativos (p < 0,001) com moderado a alto R², e também não apresentaram multicolinearidade, de acordo com o teste de DW. A tabela 3 mostra em detalhes as estimativas, os limites de confiança, o teste t e a inflação de variância (IV) para cada parâmetro de todos os modelos. Todas as estimativas referentes às proteínas inclusas nos modelos estavam dentro dos limites de confiança e foram altamente significativos. Os valores de IV foram todos abaixo de 10, indicando que não há multicolinearidade entre as proteínas inclusas em cada modelo, corroborando com o teste de DW mostrado na tabela 2.
espermáticos Modelo R² p-valor C(p) Root MSE Watson W W Motilidade espermática y = 81,09 + 0,00055973x1 + 0,00910x2 0,00071419x3 0,69 0,0002 4,0 3,40 1,9 0,87 0,02 Teste de integridade de membrana (HOST-NSH-CT) y = 43,9 + 0,00021575x1 + 0,00129x2 0,41 0,0072 3,0 8,07 1,9 0,85 0,01 % Espermatozoides normais y = 66,9 + 0,00311x1 0,00331x2 0,60 0,0004 3,0 6,86 3,1 0,95 0,46 % Defeitos de peça intermediária y = 5,74 0,00142x1 + 0,00737x2 + 0,00344x3 0,82 0,0001 < 4,0 2,61 1,9 0,94 0,29 % Defeitos de cauda y = 15,0 + 0,00046466x1 0,00342x2 + 0,00299x3 + 0,00155x4 0,02952x5 + 0,01521x6 0,00184x7 0,95 < 0,0001 8,0 1,09 1,6 0,94 0,35 % Espermatozoides vivos
A motilidade espermática apresentou associação com 3 proteínas: fator de crescimento do nervo -rich secretory protein 1-like e galectina-1, com R² de 0,69, isso significa que 69 % da variação dos valores correspondentes à motilidade espermática eram dependentes desssas 3 proteínas (Tabela 2). Os resultados obtidos sugerem que a cysteine-rich secretory protein 1-like exercem um efeito de aumento na motilidade espermática, pois apresentaram 1 e 2 correspondentes a 0,00055973 e 0,00910, enquanto que a galectina - 1 promove uma redução do parâmetros avaliado, com 3 de -0,00071419 (Tabela 3). Estes valores indicam que a motilidade espermática aumenta 0,00055973 % e 0,0091 % para cada
aumento de 1 pixel cysteine-rich secretory protein
1-like, respectivamente, ao mesmo tempo que diminui 0.00071419 % para cada aumento de 1 pixel na intensidade da galectina - 1.
O percentual de espermatozoides com membrana funcional, representado pelos NSH-CT no HOST, foram associados positivamente por 2 proteínas (R² = 0,41; Tabele 3): ao complexo de proteínas FAM115 e a tropomiosina 1 = 0, 2 = 0,00129, respectivamente; Tabela 3). No que se refere ao percentual de espermatozoides morfologicamente normais (R² = 0,60), observou-se associações significativas positivas e negativas com as proteínas Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 6- 1 = 0,00311) e isocitrato 2 = - 0,00331), respectivamente. Leukocyte elastase inhibitor e a peptidyl-prolyl cis-trans isomerase A representou 42 % (Tabela 2) da variação do percentual de céluas vivas com o acrossoma intacto, ambas associadas positivamente 1 = 0, 2 = 0,02621, respectivamente; Tabela 3).
As proteínas do plasma seminal também influenciaram o percentual de espermatozoides normais e os seguintes defeitos espermáticos: defeito de peça intermediária e defeito de cauda. O percentual de espermatozoides com defeito na peça intermediária variou de acordo com a expressão de 3 proteínas, representando 82 % da variação desse parâmetro seminal. A Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 6-like associou-se de modo negativo 1 = - 0,00142), enquanto que as proteínas PNMA-like 1 e superoxide-dismutase (Cu- 2 = 0,00737 e 3 = 0,00344)
tiveram associações positivas. Sete proteínas foram responsáveis por 95 % da variação no percentual de espermatozoides com defeito de cauda. A N(G),N(G)-dimethylarginine 2 = -0,00342), protein DJ-1- 5 = -0,02952) e von Willebrand factor A domain- 7 = -0,00184) influenciaram negativamente, enquanto a actina 1 = 0.00046466), peptidyl-prolyl cis-trans isomerase
3 = 0, 4 = 0,00155) e rab GDP dissociation
inhibitor 2- 6 = 0.01521) influenciaram positivamente esse parâmetro seminal. Não houve modelo significativo para a associação das proteínas do plasma seminal com o parâmetro espermático defeito de cabeça.